Модифицированный фиброин - RU2018135565A
Код документа: RU2018135565A
Формула
1. Модифицированный фиброин, включающий:
последовательность домена, представленную формулой 1: [мотив (A)n-REP]m,
где последовательность домена имеет аминокислотную последовательность с пониженным содержанием глициновых остатков, эквивалентную аминокислотной последовательности, в которой по меньшей мере один или множество глициновых остатков в REP заменены другим аминокислотным остатком по сравнению с природным фиброином,
где мотив (А)n представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 4-20 аминокислотных остатков, а число аланиновых остатков составляет 83% или более от общего числа аминокислотных остатков в мотиве (A)n, REP представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 10-200 аминокислотных остатков, m равно целому числу от 8 до 300, множество мотивов (А)n может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности, а множество REP может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности.
2. Модифицированный фиброин по п. 1, где последовательность домена имеет аминокислотную последовательность, эквивалентную аминокислотной последовательности, в которой по меньшей мере в одной последовательности мотива, выбранной из GGX и GPGXX (где X представляет собой аминокислотный остаток, не являющийся глицином) в REP, один глициновый остаток в одной или во множестве последовательностей мотива был заменен другим аминокислотным остатком по сравнению с природным фиброином.
3. Модифицированный фиброин по п. 2, где отношение последовательностей мотива, в которых глициновый остаток заменен другим аминокислотным остатком, составляет 10% или более от всей последовательности мотива.
4. Модифицированный фиброин, включающий:
последовательность домена, представленную формулой 1:
[мотив (A)n-REP]m,
где z/w составляет 50,9% или более в случае, когда общее число аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, состоящей из XGX (где X представляет собой аминокислотный остаток, не являющийся глицином), содержащегося во всех REP в последовательности, за исключением последовательности мотива (А)n, расположенного, в основном, с С-концевой стороны по отношению к С-концу последовательности домена, определено как z, а общее число аминокислотных остатков в последовательности, за исключением последовательности мотива (А)n, расположенного, в основном, с С-концевой стороны по отношению к С-концу последовательности домена, определено как w,
где мотив (А)n представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 4-20 аминокислотных остатков, а число аланиновых остатков составляет 83% или более от общего числа аминокислотных остатков в мотиве (A)n, REP представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 10-200 аминокислотных остатков, m равно целому числу от 8 до 300, множество мотивов (А)n может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности, а множество REP может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности.
5. Модифицированный фиброин по любому из пп. 1-4, где фиброин, помимо аминокислотной последовательности с заменой одного или множества глициновых остатков в REP другим аминокислотным остатком, имеет аминокислотную последовательность с заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением одного или множества аминокислотных остатков по сравнению с природным фиброином.
6. Модифицированный фиброин по п. 5, где природным фиброином является фиброин, происходящий от насекомых или пауков.
7. Модифицированный фиброин по п. 5, где природным фиброином является мажорный белок паука, имеющий бутылочнообразную форму (MaSp), или минорный белок паука, имеющий бутылочнообразную форму (MiSp).
8. Модифицированный фиброин по любому из пп. 5-7, где последовательность домена имеет аминокислотную последовательность, эквивалентную аминокислотной последовательности, в которой по меньшей мере в одной последовательности мотива, выбранной из GGX и GPGXX (где X представляет собой аминокислотный остаток, не являющийся глицином) в REP, один глициновый остаток в одной или во множестве последовательностей мотивов был заменен другим аминокислотным остатком по сравнению с природным фиброином, и где отношение последовательностей мотива, в которых глициновый остаток заменен другим аминокислотным остатком, составляет 10% или более от всей последовательности мотива.
9. Модифицированный фиброин по п. 8, где другим аминокислотным остатком является аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из глутаминового (Q) остатка, валинового (V) остатка, лейцинового (L) остатка, изолейцинового (I) остатка, метионинового (М) остатка, пролинового (Р) остатка, фенилаланинового (F) остатка, триптофанового (W) остатка, аспарагинового (N) остатка, серинового (S) остатка, лизинового (K) остатка и остатка глутаминовой кислоты (Е).
10. Модифицированный фиброин по п. 8, где другим аминокислотным остатком является глутаминовый (Q) остаток.
11. Модифицированный фиброин по любому из пп. 1-10, где последовательность домена также имеет аминокислотную последовательность с пониженным содержанием мотива (А)n, эквивалентную аминокислотной последовательности, в которой по меньшей мере один или множество мотивов (А)n были делетированы по сравнению с природным фиброином.
12. Модифицированный фиброин по п. 11, где последовательность домена имеет аминокислотную последовательность, эквивалентную аминокислотной последовательности, в которой по меньшей мере один мотив (А)n на 1-3 мотива (А)n, расположенных с N-концевой стороны до С-концевой стороны, был делетирован по сравнению с природным фиброином.
13. Модифицированный фиброин по п. 11, где последовательность домена имеет аминокислотную последовательность, эквивалентную аминокислотной последовательности, в которой по меньшей мере два последовательно расположенных мотива (А)n с делециями и один мотив (А)n с делецией повторяются в указанном порядке от N-концевой стороны до С-концевой стороны по сравнению с природным фиброином.
14. Модифицированный фиброин по любому из пп. 11-13, где максимальная величина х/у составляет 20% или более, в случае, если ряд аминокислотных остатков в REP, состоящем из двух смежных звеньев [мотив (A)n-REP], расположен последовательно от N-концевой стороны до С-концевой стороны, а число аминокислотных остатков в REP, имеющем наименьшее число аминокислотных остатков, было определено как 1; общее число аминокислотных остатков в двух смежных звеньях [мотив (A)n-REP], где отношение числа аминокислотных остатков в другом REP составляет 1,8-11,3, было определено как х, а общее число аминокислотных остатков последовательности домена было определено как у.
15. Модифицированный фиброин, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10, или аминокислотную последовательность, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 10.
16. Модифицированный фиброин по любому из пп. 1-15, также включающий последовательность метки у N-конца или у С-конца или у обоих концов.
17. Модифицированный фиброин по п. 16, где последовательность метки включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.
18. Модифицированный фиброин, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, или аминокислотную последовательность, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11.
19. Нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный фиброин по любому из пп. 1-18.
20. Нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с комплементарной цепью нуклеиновой кислоты по п. 19 в жестких условиях и кодирует модифицированный фиброин, включающий последовательность домена, представленную формулой 1: [мотив (A)n-REP]m,
где мотив (А)n представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 4-20 аминокислотных остатков, а число аланиновых остатков составляет 83% или более от общего числа аминокислотных остатков в мотиве (A)n, REP представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 10-200 аминокислотных остатков, m равно целому числу от 8 до 300, множество мотивов (А)n может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности, а множество REP может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности.
21. Нуклеиновая кислота, имеющая последовательность, которая на 90% или более идентична нуклеиновой кислоте по п. 19, и кодирующая модифицированный фиброин, включающий последовательность домена, представленную формулой 1: [мотив (A)n-REP]m,
где мотив (А)n представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 4-20 аминокислотных остатков, а число аланиновых остатков составляет 83% или более от общего числа аминокислотных остатков в мотиве (A)n, REP представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 10-200 аминокислотных остатков, m равно целому числу от 8 до 300, множество мотивов (А)n может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности, а множество REP может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности.
22. Экспрессионный вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 19-21 и одну или множество регуляторных последовательностей, функционально присоединенных к этой последовательности.
23. Экспрессионный вектор по п. 22, который представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор.
24. Хозяин, трансформированный экспрессионным вектором по п. 22 или 23.
25. Хозяин по п. 24, который является прокариотом.
26. Хозяин по п. 25, где прокариотом является микроорганизм, принадлежащий к роду, выбранному из группы, состоящей из Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium и Pseudomonas.
27. Хозяин по п. 24, который является эукариотом.
28. Хозяин по п. 27, где эукариотом являются клетки дрожжей, нитчатых грибов или насекомых.
29. Хозяин по п. 28, где дрожжами являются дрожжи, принадлежащие к роду, выбранному из группы, состоящей из Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia, Candida, Yarrowia и Hansenula.
30. Хозяин по п. 29, где дрожжами, принадлежащими к роду Saccharomyces, являются Saccharomyces cerevisiae, дрожжами, принадлежащими к роду Schizosaccharomyces, являются Schizosaccharomyces pombe, дрожжами, принадлежащими к роду Kluyveromyces, являются Kluyveromyces lactis, дрожжами, принадлежащими к роду Trichosporon, являются Trichosporon pullulans, дрожжами, принадлежащими к роду Schwanniomyces, являются Schwanniomyces alluvius, дрожжами, принадлежащими к роду Pichia, являются Pichia pastoris, дрожжами, принадлежащими к роду Candida, являются Candida albicans, дрожжами, принадлежащими к роду Yarrowia, являются Yarrowia lipolytica, а дрожжами, принадлежащими к роду Hansenula, являются Hansenula polymorpha.
31. Хозяин по п. 28, где нитчатыми грибами являются нитчатые грибы, принадлежащие к роду, выбранному из группы, состоящей из Aspergillus, Penicillium и Мuсоr.
32. Хозяин по п. 31, где нитчатыми грибами, принадлежащими к роду Aspergillus, являются Aspergillus oryzae; нитчатыми грибами, принадлежащими к роду Penicillium, являются Penicillium chrysogenum, а нитчатыми грибами, принадлежащими к роду Мuсоr, являются Мuсоr fragilis.
33. Хозяин по п. 28, где клетками насекомых являются клетки насекомых отряда Жесткокрылых.
34. Хозяин по п. 28, где клетками насекомых являются клетки насекомых, происходящих от Spodoptera frugiperda, или клетки насекомых, происходящих от Trichoplusia ni.
35. Продукт, включающий модифицированный фиброин по любому из пп. 1-18 и выбранный из группы, состоящей из волокна, пряжи, нитей, пленки, пены, сферы, нанофибрилл, гидрогеля, смолы и их эквивалентов.
