Способ получения полипептидов - SU904518A3
Код документа: SU904518A3
Описание
Ш У:3 i (OCaUL) CI I, OCOCJsHj,;
ooiCCHgaxc);; oaiiCHnOcoc -ii j,OBu Thr-Ш; О
NHEt;
OCQIJNHZ; OCCHjJaM.leZ; OCHiCH ak; OPh; ЫНСОу а ; NH(CH),iMfvie; ;v)H(CH2)2.fJMe2 5 Me; 0(CH2)2.
D-Thr-OH, . G и к вместе представляют собой
(9H2)(
ЭД,-|НW-0Q( ,
IL о; т или к-TIH jjj I
мнзаключающиеся в том, что отщепляют защитные группы в соединении формулы «i-T B-E-F-G-K НГ где R. - водород, метильный или ацеI тильный радикал; R -.водород; Z; Н-й-А1а; Z-Asp; Z-Lys; Z-LysfZ); Z-LysfBoc) H-r.ly-Glyj Z-Asp (OBzl) Z-Lys (Z)-Z-Lys; Z-ArgCZ/)-Pro-Lys{Z ); Z-Gly-Gly-Gly; Z-Leu-Leu-Leu; Z-Glu-Gly-OBzl ZLys; Z-Pro-Gln-Gln; Z-Asp(OBzl)-Gly-Gly-Gly; Z-Lys-Gly-Gly-Gly или Z-Gly-Gly-GlyJl43 s; Z-Arg (Z), -Pro-Lys (Z) -Pro-Gln-Gln; Boc; H-Glu(OBu); Boc-Lys(Boc); H-D-Lys(Boc); H-Lys(Boc); Boc-Phe H-Lyi; Boc-Gly-Gly-Gly или Boc-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; Т - Тут; Tyr(Bzl); Tyr(Z) или Tyr(Bu); B - D-Ala; D-Asp; Azala; D-Leu; D-Ser; D-Thr; D-Trp; fb-Ala; D-Ser(Bu); D-Lys; - D-Lys(Boc) или P-Met; E - Gly или Azgly; F - Phe; Azphe или Phe(6lO ; G - Leu; Azleu; Me; Met; Pro; DL-Leu или Azpro; К - ate; NHi; 0(. 0(Gla)2NI№; Ш; 0(aii.)iai; 0(aia) Ora iOCOCJL,; ЛХИгШ(ОАс)О1гОАс;
Ю12 (Qtocoq j у .i oai(ai2. oai(a-ijOCOQ.fi,)
Thr(Bzl); ШН I
i MTR;
0(aii)eNHZ; 0(.teZ; OCI-IiOi Ciij.; OPhe; ХИ(ау.Ш; NHCCIia.)iMi.Ie; (aLWie,,; NEto.; №; 0(, или DjThr-OBzl, G и к вместе представляют собой
о XN
,-NH Получение исходных соединений осуществляют при использовании различных методов пептидной химии, например карбодиимидного или азидного метода получения смешанных ангидридов и т.п. . При этом получают исходные соединения, блокированные различными защитными группами. Например, для блокировки иминогруппы используют бензилоксикарбонил, трет, -бутоксикарбонил . Гидроксильную группу защищают бензилом или трет.-бутилом; карбоксильную группу защищают, получая эфирметиловый или этиловый спирт. Для снятия этих групп применяют известные методы. Так, бензил или бензилоксикарбонил удаляют гидрогенолизом; трет.-бутоксикарбонил или трет.-бутил - обработкой исходного соединения кислотой, например трифторуксусной, или хлористым водородом . Для удаления бензилоксикарбонила или трет.-бутоксикарбонила используют брбмистый водород в уксусной .кислоте. Метиловый или этиловый эфир расщепляют с помощью гидрогенолиза или щелочной обработкой исходного продукта. Восходящую тонкослойную хроматографию проводят на пластинах, покрытых силикагелем (Кизельгур G). Хроматографирование проводят в следующих системах растворителей: бутанол-1 - уксусная кислота - вода 4:1:5 об. ч. (RjA); бутанол-1 - уксусная кислота - вода - пиридин 15:3:12:10 об.ч. (); бутанол-2 (3 вес.%) - водный раствор аммиака 3:1 об.ч. (IvgC) ; ацетонитрил - вода 3:1 об.ч. (RjD); ацетон - хлороформ 1:1 об.ч. (R.fE); хлороформ - этанол 1:4 об.ч. (RrF); циклогексан - этил ацетат 1:1 об.ч. (RrG); циклогексан этилацетат - метанол 1:1:1 об.ч. (RjH); хлороформ - метанол - вода 11:8:2 об.ч. (); хлороформ - метанол 19:1 об.ч. (RrP) и хлороформ - метанол 9:1 об.ч. (RtQ). Некоторые из таких систем растворителей используют также для колоночной хроматографии на кремнеземе (рэство рители G, К, Q и Р). Во всех случая пластины оценивают в ультрафиолетов свете и обрабатывают флуоресцеином, нингидрином и реагентом - хлорйодис тым крахмалом. Если нет особых указаний , то показатель R г означает, что этими способами обнаруживают от дельное пятно. Гидролизаты кислого характера дл всех продуктов получают нагреванием пептида или блокированного пептида с 6 н.раствором соляной кислоты, соде0й а«цим 1 вес.об. фенола, в запаянной пробирке, из которой выкачен воздух, в течение 16 ч при ПО° Аминокислотный состав каждого гидролизата определен с помощью анализатора аминокислот Локарта. В каждом случае наблюдают соответствие с ожидаемым составом. Примеры 1-42. Блокированный полипептид подвергают восстановительному расщеплению. восстановительное расщепление осуществляют следуюи им образом. HI. Исходный материал в количест ве 1 ммоль растворяют в этаноле, содержащем до 25 воды, ив атмосфе ре азота добавляют 5 вес.1 катализа тора, содержащего 5 вес.% палладированного угля, и перемешивае мую реакционную смесь при 20-25С осторожно барботируют поток водорода . Для полного завершения реакции достаточно 5-6 ч. Водород заменяют азотом, и катализатор фильтруют через слой диатомовой земли. Продукт выделяют упариванием фильтрата в вакууме . Выход 90-95-. Н2. Осуществляют, как и в HI, но вместо водного этанола применяют .метанол. НЗ. Осуществляют, как и в HI , но применяют метанол в качестве реакционной среды. Н4. Осуществляют, как и в N1, но применяют водный этанол при добавлении 1 экв.ч. хлористого водорода. Н5. Осуществляют, как и в HI, но применяют водный метанол при добавлении 1 экв.ч. хлористого водорода. Нб.. Осуществляют, как и в HI, но применяют диметилформамид при добавлении 1 экв.ч. толуол-п-сульфокислоты . Н7. Осуществляют, как и в HI, но применяют метанол при добавлении 1 экв.ч. хлористого водорода. Н8. Осуществляют, как и в HI, но применяют в качестве реакционной среды смесь диметилформамида с бута нолом. Н9. Осуществляют, как и в HI, но применяют в качестве реакционной среды водную (90-95 об Л) уксусную кислоту. . ню. Осуществляют, как и в Н9, но добавляют 1-2 экв.ч. хлористого водорода. Н11. Осуществляют, как и в HI, но применяют в качестве реакционной среды водный диметилформамид Н12. Осуществляют, как и в HI, но применяют в качестве реакционной среды смесь водного этанола и хлороформа . Н13. Осуществляют, как и в HI, но применяют в качестве реакционной среды смесь метанола в диметилформамиде . Б результате получают полипептидные производные, приведенные в табл. 1. Примеры 43-б9- Блокированный полипептид подвергают расщеплению хлористым водородом по следующим методикам. 1. Исходное соединение растворяют в этигэцетате и добавляют раствор хлористого водорода в этилацетате в количестве, достаточном для получения 2-6 н.кислоты. Реакцию проводят при 20-25°С в течение 1-2 ч. Хлорги.чрат продукта осаждают и отфильтровывают . Выделение проводят упариванием в вакууме. Е2. Осуществляют, как и в Е1, но в качестве реакционной среды вместо этилацетата применяют метанол. ЕЗ. Осуществляют, как и в Е1, но рименяют хлористый водород в смеси етанола с этилацетатом. Е4. Осуществляют, как и в Е1, но рименяют уксусную кислоту для раст7 эорения исходного материала с посл дующим добавлением хлористого водо рода в этилацетате. Е5. Осуществляют, как и в Е2, н в атмосфере азота в присутствии пр тивонагарного средства, например 2-меркаптоэтанола. Еб. Осуществляют, как и в Е1, н применяют диэтиловый эфир вместо этилацетата в качестве реакционной среды. А Е7- Осуществляют, как и в Е1 , н в качестве реакционной смеси вмест этилацетата применяют диоксан. Е8. Осуществляют, как и в Е1, н в качестве реакционной среды приме няют уксусную кислоту вместо этилацетата . Е9. Осуществляют, как и в Et, н в атмосфере азота в присутствии пр тивонагарного средства, например 2-меркаптоэтанола. ЕЮ. Блокированный материал пер мешивают с концентрированной солян кислотой (примерно 10 мл/г) при О в течение 10 мин. Избыток кислоты затем отгоняют в вакууме, по возмо ности при минимальной температуре, и полученный продукт сушат лиофили зацией. 8 результате получают полипепти ные производные, приведенные в табл. 2. Примечания (сноски) к табл. 2. 1.Соль НС1 2.Соль 2IIC1 3.Выделяют упариванием после фильтрования через диатомовую земл i. Выделяют осаждением 5.Осаждают добавлением эфира 6.Осаждают добавлением смеси метанола с эфиром 7.Кристаллизуют из смеси этилацетата с петролейным эфиром ( т.кип. 60-80°С). 8.Получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет.-бутанолом. 9.См.сноску 8, в присутствии Н 10.Очищают хроматографией на кремнеземе с применением растворителя 0. 11.См.сноску 10, с применением растворителя К. 12. Очищают на Сефадексе G 15 в0,01 М растворе соляной кислоты 13- Очищают на Сефадексе G 25 в 5 об.% уксусной кислоты. 8 14.Т.пл. 202-205С 15.1 .пл. 16.Т.пл. 179-180С 17.Т.пл. 173-174 С 18.Т.пл. 142-Й)Ч 19.Т.пл. 118-120С 20.Т.пл. 138-1«0С 21.Т.пл. ni-lU C 22.Т.пл. 195-2004 (с разл.) 23.Т.пл. 120-122С 2k.. Т.пл. 174-17бС (с разл.) 25. Т.пл. 120-12tC Примеры 7088. Блокированный полипептид подвергают расщеплению с помощью трифторуксусной кислоты по следующим методикам. F1. Исходное соединение растворяют в трифторуксусной кислоте (10 мл/г) и проводят реакцию при 2025°С в течение 1-2 ч. Продукт выделяют в виде трифторацетата упариванием раствора в вакууме. Используя лиофильную сушку в присутствии нё большого избытка хлористого водорода , получают соответствующий хлоргидрат . F2. Осуществляют, как и в F1, но применяют родную (90 или 95 об.) трифторуксусную кислоту. РЗ Осуществляют, как и в F1, но применяют водную (90 или 95 об.) трифторуксусную кислоту в атмосфере азота в присутствии противонагарного средства, например 2-меркаптоэтанола, Примечания (сноски) к табл. 3 1.Соль НС1 2.Соль уксусной кислоты 3.Соль трифторуксусной кислоты (ТФК) i. Соль 2ТФК 5.Выделяют осаждением после фильтрования через диатомовую землю. 6.Осаждают добавлением петролейного эфира (т.кип. 60-80 С) 7.Выделяют в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет.-бутанолом. 8.См. сноску 7, в присутствии НС1. 9.Очищают на Сефадексе G 15 в 5 об. водной уксусной кислоты. 10.Т.пл. 150-155С 11.Т.пл. 166-1684 Пример 89. К 235 мг ( 330 мкмоль) раствора H-T T-D-Ser-Gly-Phe (6Н)-Ley-Qr.ie (исходное соединение 110) в метаноле (5 мл) добавляют 1 н.раствор гидроокиси натрия (1,0 мл,3 экв.ч.), смесь пере9
мешивают при температуре окружающей среды в течение 3 ч. Раствор упаривают в вакууме, разбавляют водой и подкисляют разбавленным раствором соляной кислоты. После осветления фильтрованием раствор подвергают лиофильной сушке, продукт растворяю в водном растворе уксусной кислоты и пропускают через колонку, заполненную Сафадексом G 15, элюат вновь лиофилизуют, получают H-Tyr-D-Ser-Giy-Phe (6Н)-Leu-ffl, R|C 0,38.
Пример 90. При обработке H-Me-D-Ser-Gly-Phe(6H)-Leu-One (.исходное соединение 102) в водном растворе гидроокисью натрия (2 экз.) с последующим проведением процесса по мьтодике примера 89 получают H-Me-D-Ser-Gly-Phe(6{|) -Leu-CH, R 0,«t.
Пример 91. 140мг (22 мкмоль) Ас-Туг-D-Ala-niy-Phe-Leu-0t:ie (исходное соединение 123) растворяют в 10 мл теплого диоксана и постепенно температуру раствора доводят до температуры окружающей среды, после чего добавляют 12 мл воды и 1 н.водный раствор гидроокис натрия (0,75 мл, 3,5 экв.ч.). Смесь интенсивно перемешивают при температуре окружающей среды в течение 2,5 ч, затем большую часть диоксана отгоняют в вакууме. Остаток подкисляют добавлением 1 н.раствора соляной кислоты. Полученную суспензию концентрируют в вакууме. К остатку добавляют водный аммиак вместе с водным 0,05 М- раствором ацетата аммония до получения прозрачного раствора. Изыбток аммиака упаривают и продукт чистят на колонке, заполненной Сефадексом G 25, в водном 0,05 М растворе ацетата аммония. Элюат лиофилизуют, получают Ac-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-leu-CH, 0.56, 0,i(7. .
Способы, указываемые в таблицах значениями Н1-Н13 включительно, Е1-Е10 включительно и Fi-F3 включительно соответствуют значениям, приведенным , соответственно, в примерах 1-42, «3-69 и 70-88. Другие значения расшифровываются ниже.
Реакции активного сложного эфира
А1. Раствор подходящего аминосоединения (1 моль) и соответствующего активного сложного эфира (1,1 ммоль) в диметилформамиде ( ми1810
нимальный объем) выдерживают при 20-25 С до отсутствия положительной реакции с,нингидрином ч. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и выделяют неочищенный продукт или осаждением его при добалении подходящего органического расворителя , или обработкой водой, или смесью воды и подходящего органического растворителя, например эфир При необходимости осуществляют дополнительную очистку.
А2. Осуществляют, как и в А1, за исключением того, что в качестве реакционной среды применяют этилацетат при С.
A3. Осуществляют, как и в А1, но при добавлении 1-оксибензотриазола (примерно 0,2 ммоль).
А4. Осуществ;ляют, как и в А1 , но реакционную смесь выдерживают
А5. Осуществляют, как и в А1, но при добавлении 1-оксибензотриазола (примерно 0,2 ммоль), и всю смесь выдерживают при °С.
Реакции смешанного ангидрида
81.Раствор подходящего кЗрбоксилсодержащего компонента (1 ммоль) в диметилформамиде (примерно 5 мл) охлаждают до температуры от -20 до и обрабатывают N-метилморфолином (1 ,05 ммоль), а затем изобутилхлороформиатом (1,05 ммоль). Смесь перемешивают при температуре от -20 до С в течение 5 мин, а затем добавляют раствор аминокомпонента
(1 ммоль) в диметилформамиде. При использовании соли аминокомпонента добавляют также N-метилморфолин (1 ммоль). Смесь перемешивают при 20-25°С до 2 ч завершения реакции, затем ее упаривают в вакууме. Остаток распределяют между разбавленным водным раствором лимонной кислоты и подходящим, не смешивающимся с водой органическим растворителем, обымно с этилацетатом.
Продукт переходит в органическую фазу, которую отделяют и промывают водным раствором лимонной кислоты и водным раствором бикарбоната натрия, сушат и упаривают в вакууме. Если не найден подходящий растворитель, то промывают сухое вещество, которое затем выделяют фильтрованием после окончательной промывки водой.
82.Осуществляют, как и в 81, но в качестве т-ретичного основания применяют триэтиламин. ВЗ. Осуществляют,как и в В1 , но применяют этилхлорформиат с образованием смешанного ангидрида. . Осуществляют, как и в 81 , но смешанный ангидрид получают с этилхлорформиатом и N-метилморфолином в тетрагидрофуране. 85. Осуществляют, как и в 81, но смешанный ангидрид получают с этилхлорформиатом и в качестве третичного основания применяют триэтиламин Реакция азида С1. Гидразид (1 ммоль) карбоксиль ного компонента растворяют в диметилформамиде (примерно 5 мл), охлаждают до и превращают а азид обработкой 6 М раствором хлористого водорода ( ммоль) в диоксане, а затем в трет.-бутилнитрите (1,2 ммоль). Исчезновение гидразида из раствора выявляют нанесением сме си на фильтровальную бумагу с после дующим добавлением смеси хлорного железа и феррицианида калия. Смесь перемешивают в течение 10 мин при и нейтрализуют добавлением эк вивалентного количества триэтиламина (т.е. ммоль) и необходимого aминoкoмnoнeнтa (1 ммоль), растворе ного в диметилформамиде (3 мл). При использовании соли анинокомпонента на этой стадии также добавляют требуемое количество триэтиламина (1 ммоль). Реакционную смесь затем перемешивают при О-А С в течение 18-24 ч. Осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме и оста ток, растворенный в растворителе, не смешивающемся с водой, промывают водной лимонной кислотой, водным раствором бикарбоната натрия и водой , продукт выделяют или упаривани раствора или фильтрованием, если выпадает осадок. Реакции N,N -дициклогексилкарбодиимида Д1 . Подходящий карбоксилсодержащий компонент (1 ммоль) растворяют в диметилформамиде (5 мл) и перемешивают при 4°С при добавлении N,N -дициклогексилкарбодиимида (1,1 ммоль) и необходимого амииокомпонента (1 ммоль). Смесь продолж ют перемешивать при С (или в некоторых случаях при 20-25 С) до отсутствия положительной реакции на нингидрин (до 18 ч). Если аминокомпонент берут в виде соли, то к реак 9 12 ционной массе добавляют в начале реакции триэтиламин (1 ммоль). Осаок отфильтровывают, продукт выделят упариванием фильтрата в вакууме, остаток растворяют в подходящем органическом растворителе, например в этилацетате, и промывают последовательно водным раствором лимонной кислоты, водным раствором бикарбоната натрия и водой, после чего высушенный экстракт упаривают или осаждают продукт добавлением подходящего осадителя, например петро|1ейного эфира (т.кип. 60-80 С). Д2. Осуществляют, как и в Д1, но при добавлении к реакционной смеси . 1-окси бензотриазола (2 ммоль). ДЗ. Подходящее карбоксилсодержащее соединение.(1 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране( 2 мл) и добавляют N-оксисукцинимид (1 ммоль) а затем раствор N|N-дициклогексилкарбодиимида (1 ммоль) в тетрагидрофуране (1 мл). Через IS мин добавляют аминокомпонент (1 ммоль) и смесь перемешивают при 20-25 С в течение ч, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме, продукт повторно растворяют в подходящем растворителе , например в этилацетате, и промывают раствор последовательно водным раствором лимонной кислоты, водным раствором бикарбоната натрия и водой, сушат и упаривают в вакууме. Реакция восстановления С1. Для получения производных гексагидрофенилаланина подходящее промежуточное соединение, содержащее фенилаланин (1 ммоль) растворяют в 80|-ном водном растворе уксусной кислоты, возможно содержащей некоторое количество хлористого водорода, добавляют катализатор Адамса из окиси платины (50-150 мг) и проводят восстановление пропусканием потока водорода через перемешиваемую смесь при 20-25С до завершения реакции. Катализатор отделяют фильтрованием раствора через слой диатомовой земли , фильтрат упаривают в вакууме. Гидролиз сложного эфира 1. Сложный эфир (1 ммоль) растворяют в водном ацетоне (1015 мл), содержащем гидроокись натрия (1,1-1,2 ммоль) и раствор перемешивают при 20-25 С До прекращения реакции, что подтверждают спустя 13 2-3 ч тонкослойной хроматографией. Смесь концентрируют в вакууие, остаточный водный раствор промывают этилацетатом. Смесь подкисляют доба лением лимонной кислоты и продукт либо экстрагируют подходящим раство рителем, например этилацетатом, либ выделяют упариванием, если это осуществимо . Экстракт промывают насыщенным ра солом, высушивают и упаривайт в вакууме , получают необходимое карбоксилсодержащее соединение. U2. Осуществляют, как и в Э1, но применяют смесь воды, метанола и ацетона. J3. Осуществляют, как и в Э1, но в качестве реакционной среды применяют водный метанол. 3, Гидролиз проводят с 1 экв.ч. гидроокиси натрия в.воде и продукт выделяют в виде его натриевой соли упариванием под вакуумом. 35- Осуществляют, как и и 31 , но в качестве реакционной среды применяют диоксан. Реакции ацилирования К1. К охлажденному льдом раствору соответствующего сложного моноэфира глицерина (1 ммоль) в хлороформе (1 мл), содержащем пиридин (3 ммоль) добавляют хлористый ацетил (3 ммоль) и смесь перемешивают при 20-25 С в течение 18 ч. Растворитель отгоняют в вакууме и остаток вновь растворяют в этилацетате, раствор промывают последовательно водой, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и водой. Высушенный экстракт упаривают в вакууме, остаток растирают с небольшим количеством метанола и фильтруют. Сложный моноэфир глицерина, необходимый для такого ацилирования, получают следующим образом. Сложный эфир, блокированный изопропилиденом (50 ммоль), в 2-метоксиэтаноле (300 мл) нагревают на паровой бане в течение 6 ч с борной кислотой (500 ммоль). Растворитель отгоняют в вакууме и остаток растворяют в этилацетате. После промывания водой раствор сушат и растворитель отгоняют в вакууме , получают сложный эфир в виде масла, которое подвергают дополнительной очистке хроматографией на колонке с применением кремнезема. К2. Осуществляют, как и в К1, но вместо хлористого ацетила применяют хлористый пальмитоил. КЗ. Блокированный бензилиденом сложный моноэфир глицерина (1 ммоль) и боную кислоту (k ммоль) в триметилборате (5 мл) нагревают на паровой бане в течение 20 мин. Триметилборат отгоняют, остаток нагревают допол ительно 20 мин на паровой бане. Полученный продукт снова растворяют в этилацетате (30 мл), промывают водой и извлекают в виде свободного моноэфира глицерина упариванием. Затем проводят ацилирование с помощью хлористого ацетила, как и в К1. К . Осуществляют, как и в К1 , но для окончательного ацилирования применяют хлористый гексаноил. Реакции этерификации L1 . Безводную блокированную аминокислоту (10 ммоль) растворяют в сухом пиридине (10 мл) при и добавляют бензолсульфохлорид ПО ммоль). Смесь перемешивают при О С в течение 15 мин,затем добавляют подходящий спиот (10 ммоль). Смесь перемешивают при ° С в течение 18ч, затем пиридин отгоняют в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате п (150 мл) и раствор промывают последовательно водой, 1 н.раствором соляной кислоты, водой, 2 н.раствором бикарбоната натрия и водой. Сушат и отгоняют. Получают неочищенный продукт . L2. К перемешиваемому раствору соответствующим образом блокированной аминокислоты (5 ммоль) в пиридине (5 мл) при 0°С добавляют фенол (10 ммоль) и N, М-дициклогексилкарбодиимид (10 ммоль) и всю смесь перемешивают при 4 С в течение 18 ч. После фИJlЬTpoвaния смеси и упаривания пиридина в вакууме остаток растворяют в этилацетате (100 мл) и проывают последовательно водой, водным 2 н.раствором бикарбоната натрия водой. Экстракт сушат и упаривают, получают неочищенный сложный эфир. L3. Подходящим образом замещенную аминокислоту (10 ммоль) растворяют в ацетонитриле при и добавляют необходимое количество спирта (10 мл) вместе с пиридином (20 ммоль) и (N -дициклогексилкарбодиимидом 11 моль). Смесь перемешивают при °С в течение 18 ч, а затем фильтруют и растворитель отгоняют в вакууме Остаток обрабатывают этилацетатом и промывают последовательно водным раствором лимонной кислоты, водным раствором бикарбоната калия. Экстракт сушат, упаривают в вакууме , получают неочищенный сложный эфир. L. Осуществляют, как и в L3, но в качестве реакционной среды вместо ацетонитрила применяют ацетон Реакция с аммиаком Ml. Определенный сложный метиловый эфир пептида растворяют в минимальном количестве диметилформамида и приводят в контакт с избытком концентрированного раствора аммиака в этаноле в течение 3 Дн. при 20-25 С. Продукт выделяют осаждением водой Реакция с гидразином 1. Сложный метиловый эфир пептида (10 ммоль) растворяют в диметилформамиде (25 мл) и добавляют водный раствор гидрата гидразина (50 ммоль). Смесь перемешивают при 20-25 С в течение 18 ч, концентрируют в вакууме примерно до половины Вое 1 Тур(Ви) Rj D ОД, й М 0,Ь4 , р Р о Д , U а 0,47
Q1. к раствору соединения формулы Z-Tyr-(Bu)-aij выделенного из 55,2 г (ЮОммоль) его дициклогексиламиновой соли в сухом тетрагидрофуране (300 мл) добавляют 50 мл (800 ммоль) йодистого метила, 8,6 г гидри 1а натрия (300 ммоль) и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 18 ч на бане при .
Избыток гидрида натрия разлагают добавлением этилацетата к охлажденной суспензии, а затем воды, получают почти прозрачный раствор, который концентрируют в вакууме.
Полученный водный раствор разбавляют водой (ISO мл) и промывают дважды . Доводят значение рН водного раствора до 3 добавлением лимонной кислоты и продукт экстрагируют этилацетатом (ijOO мл, 2Ч 200 мл). Экстракт промывают последовательно водой (ЮО мл), 10 вес.об.% водного раствора тиосульфата натрия (100 мл), а затем вновь водой до нейтральной
реакции промывных вод. Экстракт сушат над сульфатом магния, упаривают, получают масло, которое суспендируют в теплом петролейном эфире (200 мл, т.кип. 60-80С), затем растворяют в этилацетате, из охлажденного до С раствора выпадает в осадок продукт формулы Z-Me-(Bu)-(H, т.пл.
эб-ээ°с.
R1 к 5,33 г (17 ммоль) раствора соединения Phe-Azley-NHiHCl и 2, мл (17 ммоль) триэтиламина в 50 мл хлороформа добавляют 3,87 г (17 ммоль) раствора соединения формулы ZNHNH-CO-C1. Смесь выдерживают при температуре окружающей среды в течение 1б ч, а затем добавляют 400 мл этилацетата. Раствор промывают последовательно водой, 20 вес.об. водного раствора лимонной кислоты, высушивают над сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток чистят хроматографией на колонке с применением кремнезема, хлороформа, 2 об.% объема, и продукт осаждают добавлением воды. Другие реакции Р1. 729 г U ммоль) Boc-Tyr(Bu)-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OI (исходное соединение 1б1), 0,55 мл (7 ммоль) чистого сухого пиридина и 0,3 мл (6,7 ммоль) свежеотогнанного уксусно го ангидрида перемешивают при 2022 С в течение 10 мин. Полученный раствор нагревают при ЭО-92С в течение 6 ч, затем охлаждают и обрабатывают водой (15 мл). Каменеподобное вещество отделяют, освобождают от верхнего слоя жидкости декантацией, промывают водой (5 15 мл) и растворяют в этилацетате (50 мл). Раствор промывают последовательно 10 вес.об.% водного раствора лимонной кислоты С f10 мл), водой (1 5 мл), 10 вес.об.% йодного раствора бикарбоната калия (3 л IDмл) и водой (3 10 мл), сушат (безводным сульфатом магния) и упаривают. Спектр ЯМР полученного твердого остатка (530 мг) показывает, что он представляет собой смесь L,D,L,L Ь,В,Ь,В-форм структурной формулы CHgCHHeg he-NH - СН - СОСН метанола в хлороформе и систем Р и Q в качестве элюентов. Получают соединение формулы Z-Azgly-Phe-Azley-Ш2 , т.пл. 11б-120°С (с разл.). S1. 17i5 г (30 ммоль) раствора Z-Tyr(Bzl)-OCp и 4,38 г (30 ммоль) Boc-NffIeNHi в 50 мл диметилформамид выдерживают в течение 18 ч при температуре окружающей среды. После разбавления 500 мл этилацетата раст вор промывают последовательно водой 20 вес.об.% водного раствора лимонной кислоты и водой. Упаривание высушенного экстракта в вакууме приводит к получению твердого вещества которое обрабатывают непосредственно раствором хлористого водорода (100 ммоль) в этилацетате в течение 2 ч при температуре окружающей среды . Растворитель отгоняют в вакууме получают соединение формулы Г Z-T)T(Bzl)-NHNHMe, НС1, т.пл. 22322 С , RfD 0,82, R 0,6, 0,63 Э, г (20 ммоль) приведенного хлоргидрата растворяют в 200 мл хло роформа и добавляют 2,8 мл (20 ммол триэтиламина, а затем 2,8 мл (20 ммоль) метилового эфира изоцианатоуксусной кислоты. Смесь перемешивают в течение 18 ч при температу окружающей среды, растворитель упаривают в вакууме. Остаток растворяю в этилацетате, промывают последовательно водой, 20 вес.об. водного раствора лимонной кислоты, насыщенным раствором бикарбоната натрия и водой. Высушенный экстракт упаривают в вакууме, получают соединения формулы Z-Tyr(Bzl)-Azala-Gly-C fe, которое после перекристаллизации из смеси метанола с эфиром имеет т.пл. 107-108С. Примечания (сноски) к табл.. 1.Очищают осаждением 2.Т.пл. 160-161С (с разл.) 3.Перекристаллизовывают из петролейного эфира т.кип. 60-80 С) t. Перекристаллизовывают из смеси изопропанола с эфиром (т.пл.18Н83 5.Перекристаллизовызают из изопропанола (т.пл. ) 6.Колоночная хроматография на кремнеземе с применением хлороформа и 2 об. метанола в хлороформе 7.Колоночная хроматография на кремнеземе с применением хлороформа 8.Колоночная хроматография на кремнеземе с применением хлороформа и системы Р 9.Перекристаллизация из этилацетата (т.пл. 128-130с) 10.Колоночная хроматография на кремнеземе с применением 25 об. этилацетата в циклогексане 11.Колоночная хроматография на кремнеземе с применением системы G 12.Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 0, т.пл. 9б-99С) 13- Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80С), т.пл. 202-2034) . Перекристаллизация из этилацетата (т.пл. 122-123°С) 15.Колоночная хроматография на кремнеземе с применением систем Р и Q 16.Перекристаллизация из этилацетата (т.пл. 177-17Э°С) 17- Г1ерекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.пл. 60-80°С), т.пл. 122-123С) 18.Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром ( т.кип. 60-80С), т.пл. 108,5-110С) 19.Перекристаллизация и2 метанола (т.пл. 219-220С) 20.Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80°С), т.пл. 121-122°С) 21.Перекристаллизация из смеси толуола с бензолом 22.Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80°С), т.пл. ТЗЗ-ТЗЗ С) 23- Колоночная хроматография на кремнеземе с применением системы Р 2. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением 3 об. метанола в хлороформе 25.Колоночная хроматография на кремнеземе с применением системы Q 26.Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т. кип. 60-80°С), т.пл. 122-12 С 27- Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80С), т.пл. 115-118С 28. Перекристаллизация из водного метанола, т.пл. 1б2-1бЗ С 29- Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80°С), т.пл. 130-132 С 30.Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 15б-157°С 31.Лиофильная сушка в присутстии НС1 32. Лиофильная сушка 33- Колоночная хроматография на кремнеземе с применением систем Р, Q и К З. Перекристаллизация из смеси этилацетата с циклогексаном, т.пл. 163-16 4 С 35. Перекристаллизация из смеси метанола с эфиром, т.пл. 130-131 С 36. Гидролиз сложного эфира в про цессе операции (исходное соединение 137)
Пример
Полипептид
-МеТут-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Wfe ,
H-T)T-D-Ala-Azgly-Pl№-Azleu-h81j
Н-Туг-1)-А1а-С1у-Р1ю-Ьеи-0(СН2)М«2
ll-Tyr-D-Ma-Cly-Phe-Leu-OCD ЗгМГе
H-Tyr-D-Ala-ay-Phe-Leu- aiJ
H-Tyr-D-Ala-Gly-Pte-Nle-Ct.ie
il-Tyr-D-Ala-Gly-.4ie(6H)-Uu-aj
n-Tyr-D-Ala-Gly-Plie(6H)-Leu-(ie
I l-Ty r-i -Asp-Gly-Plie -Lcu-Onc II-Tyr-Azala-Cly-Plie-Leu-ate
U-Tyr-EKLeu-Gly-Plie-Leu-CMe
li-Tyr-D-Ser-Cly-Aziihe-Leu-afe
H-Tyr-U-Ser-Gly-Plje-Leu-0(CHj)aOH
H-Tyr-I}-Ser-Gly-Pl e-Leu-0(
H-iyr-I)-Ser-Gly-Pl -Leu-0(Q)
H- -Typ-D-Ser-Oly-Phe-Lett-OCHg
CHOAe (OAC
H-Tyr-D-Sep-Cl3f-l he-L«u-OCHj
CmWOCuHjl
H-Tyr-D-Ser-Gly-nie-Leu-OCHCaijQAc)
19 H-Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-OCHCayXXX jy
R .10
Ajsll I
5041 87 16
I
55 552060
65
69 77
6510
6130 83
6022
6148
5790
6652 , 85
6059 50 8ii 7
79 77 6653 86
67 50 6050 «б 95
71 65 67 50 87
(
68 62 59i9 i 89
5654 81
55 6в 9
67 73 73 СН«ОСОС|,Н}1
67 71 is 58 6d 44 9в
61 6 $4 S4 St )J 85 0 51820 37.Колоночная хроматография на кремнеземе с применением системы К 38.Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром , ( т.кип. 60-8ос) , т.пл. 172-17 С 39. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С),т.пл. I O-lifl C 40. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением смеси этилацетата с метанолом 1 . Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром
21
(т.кип. бО-бО С) , т.пл. 1б2-1б5°С (с разл.)
42. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. бО-ВО С), т.пл.
АЗ. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением 1 об. метанола в хлороформе
4. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением систем Q и К
. Т.пл. 121-122С
0i 5l822
+6. Перекристаллизация из этилацетата , т.пл. Л8-250С
7- Очистка на Сефадексе U1 20 в диметилформамиде
5 48. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 152-155 С
49. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80С), т.пл. 1б« -1б8С
50. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением 5 об.% метанола в этилацетате
/т а б л и ц а )
Реферат
Формула
