Лечение нейропатии днк-конструкциями, кодирующими igf-1, и днк- конструкциями, кодирующими hgf - RU2781980C2

Чертежи

Показать все 10 чертежа(ей)

Описание

1. Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №62/699667, поданной 17 июля 2018 г, которая тем самым является включенной посредством ссылки во всей ее полноте.

2. Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан посредством файловой системы электронного архивирования (EFS - от англ. electronic filing system) и включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте. Указанная копия ASCII, созданная 1 июля 2019 г, называется 37536US_CRF_sequencelisting.txt и имеет размер 130163 байт.

3. Предшествующий уровень техники

Нейропатия представляет собой хроническое патологическое состояние, возникающее из-за повреждения нервов. Нейропатия является обычным последствием диабета, причем нейропатия у диабетического пациента конкретно называется диабетической нейропатией. Нейропатия также может быть вызвана повреждением нервов, вызванным инфекциями (например, герпесом с ассоциированной нейропатией, возникающей после инфекции, известной как постгерпетическая невралгия; ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)/СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита человека); болезнью Лайма; лепрой; сифилисом и опоясывающим герпесом); аутоиммунными заболеваниями (например, ревматоидный артрит, системная волчанка и синдром Гийена-Барре); генетическими или наследственными расстройствами (например, наследственная атаксия Фридрейха и болезнь Шарко-Мари-Тута); амилоидозом; уремией; воздействием токсинов, ядов или лекарственных средств; травмами или повреждением. В некоторых случаях данная причина неизвестна, причем в данном случае нейропатия называется идиопатической нейропатией.

Независимо от причины нейропатия ассоциирована с характерными симптомами, которые отчасти зависят от анатомического места повреждения нерва (например, периферическая нейропатия, краниальная нейропатия, автономная нейропатия, очаговая нейропатия), такими как боль (невропатическая боль), другие сенсорные нарушения (например, анестезии, включающие частичную или полную потерю ощущения; и парестезии, включающие онемение, покалывание и т.д.), моторные дефекты (например, слабость, потеря рефлексов, потеря мышечной массы, спазмы, потеря точной координации и т.д.) и автономная дисфункция (например, тошнота, рвота, импотенция, головокружение, запор, диарея и т.д.).

Нейропатию традиционно лечат с использованием мер, которые управляют ассоциированными симптомами, и, когда этиология известна, посредством лечения лежащей в основе причины нейропатии. Например, использовали обезболивающие лекарственные средства или медицинские способы лечения диабета, аутоиммунных заболеваний, инфекций или недостаточностей витаминов. Однако данные способы не лечат само повреждение нервов.

Следовательно, существует потребность в эффективном способе лечения, который может предупреждать или осуществлять репарацию повреждения нервов, ассоциированного с нейропатией.

Разные факторы роста предлагали в качестве возможных средств для лечения нейропатии, и Kessler с коллегами недавно описали успешное двойное слепое, плацебо-контролируемое клиническое испытание на человеке, фаза 2, невирусной генотерапии фактором роста гепатоцитов (HGF - от англ. hepatocyte growth factor) при диабетической периферической нейропатии. Kessler et a/., Annals Clin. Transl. Neurology 2(5):465-478 (2015). См. также патент США №9963493, включенный в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

Принимая во внимание широкий спектр этиологий, которые вызывают нейропатию, и широкий спектр клинических проявлений нейропатии, несмотря на клинические успехи в лечении диабетической периферической нейропатии с использованием ДНК-конструкций, экспрессирующих HGF, остается потребность в дополнительных лечениях, включая лечения с использованием HGF с другими терапевтическими средствами.

4. Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение основывается на новых данных о том, что введение ДНК-конструкции, кодирующей инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1 - от англ. insulin-like growth factor 1), способной экспрессировать человеческую изоформу IGF-1, в комбинации с ДНК-конструкцией, кодирующей HGF, способной экспрессировать человеческую изоформу HGF, является эффективным в лечении симптома, ассоциированного с нейропатией. Было продемонстрировано, что эффекты лечения двумя данными ДНК-конструкциями в комбинации больше, чем эффекты лечения самой ДНК-конструкцией, кодирующей HGF (например, VM202 или pCK-HGF₇₂₈). Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены разные ДНК-конструкции, кодирующие изоформу IGF-1 или изоформу HGF, которые можно использовать для комбинированной терапии. Кроме того, в данном документе предложены способы введения ДНК-конструкций, продемонстрированных как эффективные в лечении симптомов, ассоциированных с нейропатией in vivo.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предложена новая комбинированная терапия с использованием изоформ IGF-1 и HGF для лечения нейропатии.

В частности, в одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения нейропатии, включающий следующие стадии: (1) введение субъекту, имеющему нейропатию, терапевтически эффективного количества первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, способной экспрессировать человеческую изоформу IGF-1; и (2) введение данному субъекту терапевтически эффективного количества первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, способной экспрессировать человеческую изоформу HGF.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, способна экспрессировать белок IGF-1Ea класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 14 или белок IGF-1Ec класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 16. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, не способна экспрессировать как белок IGF-1Ea Класса II, содержащий полипептид SEQ ID NO 18, так и белок IGF-1Еb Класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 20.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 15. В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает стадию введения субъекту второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, где данная вторая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 17.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 17. В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает стадию введения субъекту второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, где данная вторая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 15.

В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, проводятся одновременно. В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, проводятся последовательно.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, кодирует более чем одну изоформу человеческого IGF-1. В некоторых воплощениях более чем одна изоформа человеческого IGF-1 содержит полипептид SEQ ID NO 14 и полипептид SEQ ID NO 16.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит: первый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 1 (экзоны 1, 3, 4) или его вырожденную последовательность; второй полинуклеотид IGF SEQ ID NO 2 (интрон 4) или его фрагмент; третий полинуклеотид IGF SEQ ID NO 3 (экзоны 5 и 6-1) или его вырожденную последовательность; четвертый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 4 (интрон 5) или его фрагмент; и пятый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 5 (экзон 6-2) или его вырожденную последовательность, где первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид, четвертый полинуклеотид и пятый полинуклеотид связываются в последовательном порядке от 5' к 3'.

В некоторых воплощениях второй полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 6. В некоторых воплощениях второй полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 7. В некоторых воплощениях четвертый полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 8.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит плазмидный вектор. В некоторых воплощениях данный плазмидный вектор представляет собой рСK. В некоторых воплощениях данный плазмидный вектор представляет собой рТх.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 10. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 9.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся в достаточном количестве для уменьшения у субъекта боли. В некоторых воплощениях данный субъект имеет диабетическую нейропатию.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся посредством множества внутримышечных инъекций.

В некоторых воплощениях человеческая изоформа HGF представляет собой fIHGF SEQ ID NO 11 или dHGF SEQ ID NO 12.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, кодирует более чем одну человеческую изоформу HGF. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, кодирует две человеческие изоформы HGF, где две данные человеческие изоформы HGF представляют собой fIHGF SEQ ID NO 11 и dHGF SEQ ID NO 12.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит плазмидный вектор, возможно где данный плазмидный вектор представляет собой вектор рСK или вектор рТх.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит первый полинуклеотид HGF экзонов 1-4 SEQ ID NO 22 или его вырожденную последовательность; второй полинуклеотид HGF интрона 4 SEQ ID NO 25 или его функциональный фрагмент; и третий полинуклеотид HGF экзонов 5-18 SEQ ID NO 23 или его вырожденную последовательность, где данный второй полинуклеотид HGF расположен между первым полинуклеотидом HGF и третьим полинуклеотидом HGF, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, кодирует две изоформы человеческого HGF.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся совместно. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся совместно посредством внутримышечной инъекции.

В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, проводятся раздельно. В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, проводятся с разделением во времени по меньшей мере три недели.

В некоторых воплощениях данный способ дополнительно включает стадию введения субъекту второй ДНК-конструкции, кодирующей HGF, способной экспрессировать человеческую изоформу HGF, выбранную из fIHGF SEQ ID NO 11 и dHGF SEQ ID NO 12.

В некоторых воплощениях данный способ включает следующие стадии: введение субъекту, имеющему нейропатию, ДНК-конструкции, кодирующей HGF, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO 13, и введение субъекту ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO 10 или полинуклеотид SEQ ID NO 9, где стадия введения ДНК-конструкции, кодирующей HGF, и стадия введения ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, проводятся с разделением во времени по меньшей мере три недели.

В некоторых воплощениях данный способ включает следующие стадии: введение субъекту, имеющему нейропатию, ДНК-конструкции, кодирующей HGF, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO 33, и введение данному субъекту ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO 10 или полинуклеотид SEQ ID NO 9, где стадия введения ДНК-конструкции, кодирующей HGF, и стадия введения ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, проводятся с разделением во времени по меньшей мере три недели.

В некоторых воплощениях следующие стадии: введение субъекту, имеющему нейропатию, ДНК-конструкции, кодирующей HGF, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO 13, и введение данному субъекту первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO 15, и второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO 17, где стадия введения ДНК-конструкции, кодирующей HGF, и стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, проводятся с разделением во времени по меньшей мере три недели.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая: ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1, способную экспрессировать по меньшей мере одну изоформу человеческого IGF-1; ДНК-конструкцию, кодирующую HGF, способную экспрессировать по меньшей мере одну изоформу человеческого HGF, и фармацевтически приемлемый эксципиент.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, кодирует белок IGF-1Ea класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 14 или белок IGF-1Ec класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 16.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, кодирует более чем одну изоформу человеческого IGF-1. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, кодирует две изоформы человеческого IGF-1, где данные две изоформы человеческого IGF-1 представляют собой белок IGF-1Ea класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 14, и белок IGF-1Ec Класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 16.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит: первый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 1 (экзоны 1, 3, 4) или его вырожденную последовательность; второй полинуклеотид IGF SEQ ID NO 2 (интрон 4) или его фрагмент; третий полинуклеотид IGF SEQ ID NO 3 (экзоны 5 и 6-1) или его вырожденную последовательность; четвертый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 4 (интрон 5) или его фрагмент; и пятый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 5 (экзон 6-2) или его вырожденную последовательность, где первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид, четвертый полинуклеотид и пятый полинуклеотид связываются в последовательном порядке от 5' к 3'.

В некоторых воплощениях второй полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 6. В некоторых воплощениях второй полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 7. В некоторых воплощениях четвертый полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 8.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, дополнительно содержит плазмидный вектор. В некоторых воплощениях данный плазмидный вектор представляет собой рСK. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, выбрана из группы, состоящей из pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данный плазмидный вектор представляет собой рТх. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, выбрана из группы, состоящей из pTx-IGF-1X6 и pTx-IGF-1X10.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 9. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 10.

В некоторых воплощениях по меньшей мере одна человеческая изоформа HGF представляет собой fIHGF SEQ ID NO 11 или dHGF SEQ ID NO 12. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая HGF, способна экспрессировать и fIHGF SEQ ID NO 11, и dHGF SEQ ID NO 12.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит: первый полинуклеотид HGF SEQ ID NO 22 (экзоны 1-4) или его вырожденную последовательность; второй полинуклеотид HGF SEQ ID NO 25 (интрон 4) или его функциональный фрагмент; и третий полинуклеотид HGF SEQ ID NO 23 (экзоны 5-18) или его вырожденную последовательность, где второй полинуклеотид HGF расположен между первым полинуклеотидом HGF и третьим полинуклеотидом HGF, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, кодирует две изоформы человеческого HGF.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит полинуклеотид любой из SEQ ID NO: 26-32 и 13. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13.

В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13 и полинуклеотид SEQ ID NO 9. В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13 и полинуклеотид SEQ ID NO 10. В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13, полинуклеотид SEQ ID NO 15 или полинуклеотид SEQ ID NO 17. В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13, полинуклеотид SEQ ID NO 15 и полинуклеотид SEQ ID NO 17.

В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 33 и полинуклеотид SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 15 или SEQ ID NO 17.

В еще одном другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен набор для лечения нейропатии, содержащий: первую фармацевтическую композицию, содержащую ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1, способную экспрессировать по меньшей мере одну изоформу человеческго IGF-1, и первый фармацевтически приемлемый эксципиент; и вторую фармацевтическую композицию, содержащую ДНК-конструкцию, кодирующую HGF, способную экспрессировать по меньшей мере одну изоформу человеческго HGF, и второй фармацевтически приемлемый эксципиент.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, кодирует белок IGF-1Ea класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 14, или белок IGF-1Ec класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 16. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, кодирует более чем одну человеческую изоформу IGF-1. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, кодирует две человеческие изоформы IGF-1, где данные две человеческие изоформы IGF-1 представляют собой белок IGF-1Ea класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 14, и белок IGF-1Ec класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 16.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит: первый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 1 (экзоны 1, 3, 4) или его вырожденную последовательность; второй полинуклеотид IGF SEQ ID NO 2 (интрон 4) или его фрагмент; третий полинуклеотид IGF SEQ ID NO 3 (экзоны 5 и 6-1) или его вырожденную последовательность; четвертый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 4 (интрон 5) или его фрагмент; и пятый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 5 (экзон 6-2) или его вырожденную последовательность, где первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид, четвертый полинуклеотид и пятый полинуклеотид связываются в последовательном порядке от 5' к 3'.

В некоторых воплощениях второй полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 6. В некоторых воплощениях второй полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 7. В некоторых воплощениях четвертый полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 8.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, дополнительно содержит плазмидный вектор. В некоторых воплощениях данный плазмидный вектор представляет собой рСK. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит pCK-IGF-1X6 или pCK-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данный плазмидный вектор представляет собой рТх. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит pTx-IGF-1X6 или pTx-IGF-1X10.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 9. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 10.

В некоторых воплощениях по меньшей мере одна человеческая изоформа HGF представляет собой fIHGF SEQ ID NO 11 или dHGF SEQ ID NO 12. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая HGF, способна экспрессировать и fIHGF SEQ ID NO 11, и dHGF SEQ ID NO 12.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит: первый полинуклеотид HGF SEQ ID NO 22 (экзоны 1-4) или его вырожденную последовательность; второй полинуклеотид HGF SEQ ID NO 25 (интрон 4) или его функциональный фрагмент; и третий полинуклеотид HGF SEQ ID NO 23 (экзоны 5-18) или его вырожденную последовательность, где второй полинуклеотид HGF расположен между первым полинуклеотидом HGF и третьим полинуклеотидом HGF, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, кодирует две изоформы человеческого HGF.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит полинуклеотид любой из SEQ ID NO: 26-32 и 13. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13.

В некоторых воплощениях первая фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 9; и вторая фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13.

В некоторых воплощениях первая фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 10; и вторая фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13.

В некоторых воплощениях первая фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 15 и полинуклеотид SEQ ID NO 17; и вторая фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13.

В некоторых воплощениях первая фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 15 или SEQ ID NO 17, и вторая фармацевтическая композиция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 33.

В другом аспекте согласно настоящему раскрытию предложена первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, способная экспрессировать человеческую изоформу IGF-1 для применения в медицинском способе лечения нейропатии, причем данный медицинский способ включает следующие стадии: введение субъекту, имеющему нейропатию, терапевтически эффективного количества первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и введение данному субъекту терапевтически эффективного количества первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, способной экспрессировать человеческую изоформу HGF.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, способна экспрессировать белок IGF-1Ea Класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 14, или белок IGF-1Ec Класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 16. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, не способна экспрессировать как белок IGF-1Ea Класса II, содержащий полипептид SEQ ID NO 18, так и белок IGF-1Еb Класса I, содержащий полипептид SEQ ID NO 20.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 15. В некоторых воплощениях данный медицинский способ дополнительно включает стадию введения субъекту второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, где данная вторая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 17.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 17. В некоторых воплощениях данный медицинский способ дополнительно включает стадию введения субъекту второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, где данная вторая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 15.

В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, проводятся одновременно. В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, проводятся последовательно.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, кодирует более чем одну человеческую изоформу IGF-1. В некоторых воплощениях более чем одна человеческая изоформа IGF-1 содержит полипептид SEQ ID NO 14 и полипептид SEQ ID NO 16.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит: первый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 1 (экзоны 1, 3, 4) или его вырожденную последовательность; второй полинуклеотид IGF SEQ ID NO 2 (интрон 4) или его фрагмент; третий полинуклеотид IGF SEQ ID NO 3 (экзоны 5 и 6-1) или его вырожденную последовательность; четвертый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 4 (интрон 5) или его фрагмент; и пятый полинуклеотид IGF SEQ ID NO 5 (экзон 6-2) или его вырожденную последовательность, где первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид, четвертый полинуклеотид и пятый полинуклеотид связываются в последовательном порядке от 5' к 3'.

В некоторых воплощениях второй полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 6. В некоторых воплощениях второй полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 7. В некоторых воплощениях четвертый полинуклеотид IGF представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO 8.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит плазмидный вектор. В некоторых воплощениях данный плазмидный вектор представляет собой рСK. В некоторых воплощениях данный плазмидный вектор представляет собой рТх.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 10. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 9.

В некоторых воплощениях первую ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1, и первую ДНК-конструкцию, кодирующую HGF, вводят в достаточном количестве для уменьшения у субъекта боли. В некоторых воплощениях данный субъект имеет диабетическую нейропатию. В некоторых воплощениях первую ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1, и первую ДНК-конструкцию, кодирующую HGF, вводят посредством целого ряда внутримышечных инъекций.

В некоторых воплощениях человеческая изоформа HGF представляет собой fIHGF SEQ ID NO 11 или dHGF SEQ ID NO 12. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, кодирует более чем одну человеческую изоформу HGF. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, кодирует две человеческие изоформы HGF, где данные две человеческие изоформы HGF представляют собой fIHGF SEQ ID NO 11 и dHGF SEQ ID NO 12.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит плазмидный вектор, возможно, где данный плазмидный вектор представляет собой вектор рСK или вектор рТх. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит первый полинуклеотид HGF SEQ ID NO 22 (экзоны 1-4) или его вырожденную последовательность; второй полинуклеотид HGF SEQ ID NO 25 (интрон 4) или его функциональный фрагмент; и третий полинуклеотид HGF SEQ ID NO 23 (экзоны 5-18) или его вырожденную последовательность, где второй полинуклеотид HGF расположен между первым полинуклеотидом HGF и третьим полинуклеотидом HGF, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, кодирует две изоформы человеческого HGF.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13.

В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся совместно. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся совместно посредством внутримышечной инъекции. В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, осуществляются раздельно. В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, осуществляются с разделением во времени по меньшей мере три недели.

В некоторых воплощениях данный медицинский способ дополнительно включает стадию введения субъекту второй ДНК-конструкции, кодирующей HGF, способной экспрессировать человеческую изоформу HGF, выбранную из fIHGF SEQ ID NO 11 и dHGF SEQ ID NO 12.

В другом аспекте согласно настоящему раскрытию дополнительно предложена первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, способная экспрессировать человеческую изоформу HGF для применения в медицинском способе лечения нейропатии, причем данный методологический способ включает следующие стадии: введение субъекту, имеющему нейропатию, терапевтически эффективного количества первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, и введение данному субъекту терапевтически эффективного количества ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, способной экспрессировать человеческую изоформу IGF-1.

5. Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой схематическое представление человеческого гена IGF-1, включающего сайты альтернативной инициации транскрипции и сайты альтернативного сплайсинга. Изоформы IGF-1, которые образуются в природе от гена IGF-1, включают Еc класса I (изоформа №1); Еа класса II (изоформа №2); Еb класса I (изоформа №3) и Еа класса I (изоформа №4).

На Фиг. 2а описан экспериментальный протокол для анализа терапевтической эффективности одновременного введения ДНК-конструкции, кодирующей HGF (VM202), и ДНК-конструкции, кодирующей одну изоформу IGF-1, в модели хронической компрессии (CCI - от англ. chronic constriction injury).

Фиг. 2в представляет собой график, показывающий частоту (%) отдергивания лапы, измеренную у мышей CCI или у плацебо мышей в эксперименте, описанном на ФИГ. 2А. Мышам CCI инъецировали ДНК-конструкцию - (i) вектор рСK («рСK»). (ii) VM202 («VM202») или (iii) VM202 плюс (+) ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1 - VM202 и pCK-IGF-1#1 («1»), VM202 и pCK-IGF-1#2 («2»), VM202 и pCK-IGF-1#3 («3») или VM202 и pCK-IGF-1#4 («4»).

На Фиг. 3а описан экспериментальный протокол для анализа терапевтической эффективности одновременного введения ДНК-конструкции, кодирующей HGF (VM202), и одной или двух ДНК-конструкций, кодирующих одну изоформу IGF-1, в модели хронической компрессии (CCI).

Фиг. 3в представляет собой график, показывающий частоту (%) отдергивания лапы, измеренную у мышей CCI или у плацебо мышей в эксперименте, описанном на ФИГ. 3А. Мышам CCI инъецировали ДНК-конструкцию - (i) вектор рСK («рСK»), (ii) VM202 («VM202») или (iii) VM202 и ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1 - VM202 и pCK-IGF-1#1 («1»), VM202 и pCK-IGF-1#4 («4») или VM202, pCK-IGF-1#1 и pCK-IGF-1#4 («1+4»).

На Фиг. 4а описан экспериментальный протокол для анализа терапевтической эффективности серийного введения ДНК-конструкции, кодирующей HGF (VM202), и двух ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1 - pCK-IGF-1#1 и pCK-IGF-1#4, в модели хронической компрессии (CCI).

Фиг. 4в представляет собой график, показывающий частоту (%) отдергивания лапы, измеренную у мышей CCI, в эксперименте, описанном на ФИГ. 4А. Мышам CCI дважды инъецировали одну или более чем одну ДНК-конструкцию - (i) вектор рСK в 1-ой инъекции и вектор рСK во 2-ой инъекции ("рСK"), (ii) рСK-IGF-1#1 и pCK-IGF-1#4 в 1-ой инъекции, и pCK-IGF-1#1 и pCK-IGF-1#4 во 2-ой инъекции ("IGF-1 -> IGF-1"), (iii) VM202 в 1-ой инъекции и вектор рСK во 2-ой инъекции ("VM202 ->р СK"), (iv) pCK-IGF-1#1 и pCK-IGF-1#4 в 1-ой инъекции, и вектор рСK во 2-ой инъекции ("IGF-1 -> рСK"), (v) pCK-IGF-1#1 и pCK-IGF-1#4 в 1-ой инъекции и VM202 во 2-ой инъекции ("IGF-1 -> VM202"), (vi) VM202 в 1-ой инъекции и VM202 во 2-ой инъекции ("VM202 -> VM202"), или (vii) VM202 в 1-ой инъекции и pCK-IGF-1#1, и pCK-IGF-1#4 во 2-ой инъекции ("VM202 -> изоформы IGF-1").

На Фиг. 5а описан экспериментальный протокол, используемый в Примере 3 для оценки экспрессии in vivo изоформ IGF-1 от разных ДНК-конструкций.

На Фиг. 5в показаны результаты иммуноферментного твердофазного анализа (ИФА), измеряющего общее количество человеческих изоформ IGF-1, экспрессируемых после инъекции ДНК-конструкции, не кодирующей IGF (только вектор, «рСK»); pCK-IGF-1#1 ("1"); pCK-IGF-1#4 ("4"); pCK-IGF-1 #1 и pCK-IGF-1#4 ("1+4"); и двойных экспрессионных конструкций pCK-IGF-1X6 ("Х6") и pCK-IGF-1X10 ("Х10").

На Фиг. 6а показано положение прямого («F») и обратного («R») праймеров, используемых в ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией), для различения экспрессии изоформ №1 (изоформа Еc класса I) и №4 (изоформа Еа класса I) IGF-1.

На Фиг. 6в показан электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР-ОТ, демонстрирующий экспрессию изоформ №1 и №4 от конструкций двойной экспрессии pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10. И pCK-IGF-1X6, и pCK-IGF-1X10 индуцировали высокий уровень экспрессии обеих изоформ.

На Фиг. 7а описан протокол, используемый в Примере 3 для оценки экспрессии белка от ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1, в клетках 293Т in vitro.

На Фиг. 7в показаны результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие экспрессию изоформ №1 и/или №4 IGF-1 после трансфекции in vitro (i) pCK-IGF-1#1 ("1"), (ii) pCK-IGF-1#4 ("4"), (iii) двух одиночных экспрессионных конструкций: pCK-IGF-1#1 и pCK-IGF-1#4 ("1+4"), (iv) двойной экспрессионной конструкции рСK-IGF-1X6 ("Х6") или (v) двойной экспрессионной конструкции pCK-IGF-1X10 ("Х10").

На Фиг. 8а описан экспериментальный протокол, используемый в Примере 4 для анализа эффективности одновременного введения конструкции, кодирующей HGF - VM202, и разных ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1, в уменьшении механической аллодинии в животной CCI модели.

Фиг. 8в представляет собой график, показывающий частоту отдергивания лапы, измеренную у плацебо мышей или мышей CCI, в эксперименте, описанном на ФИГ. 8А. Мышам CCI инъецировали одну или более чем одну ДНК-конструкцию - (i) вектор рСK ("рСK"), (ii) VM202 ("VM202"), (iii) VM202, pCK-IGF-1#1, и pCK-IGF-1#4 ("IGF-1#1+#4"), (iv) VM202 и pCK-IGF-1X6 ("IGF-1 X6"), и (v) VM202 и pCK-IGF-1X10 ("IGF-1 X10").

На Фиг. 9a описан экспериментальный протокол, используемый в Примере 5 для анализа эффективности одновременного введения конструкции, экспрессирующей HGF₇₂₈, и разных ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1, в уменьшении механической аллодинии в животной модели CCI.

Фиг. 9в представляет собой график, показывающий частоту отдергивания лапы, измеренную у плацебо мышей или мышей CCI, в эксперименте, описанном на ФИГ. 9А.

Фиг. 9с представляет собой график, показывающий порог отдергивания лапы, измеренный у плацебо мышей или мышей CCI, в эксперименте, описанном на ФИГ. 9А. Мышам CCI инъецировали одну или более чем одну ДНК-конструкцию - один вектор ("CCI-pCK") или (i) pCK-HGF₇₂₈ ("CCI-HGF₇₂₈"), (ii) pCK-HGF₇₂₈ и pCK-IGF-1#1 ("CCI-HGF₇₂₈+IGF-1#1"), (iii) pCK-HGF₇₂₈ и pCK-IGF-1#4 ("CCI-HGF₇₂₈+IGF-1#4"), или (iv) pCK-HGF₇₂₈ и pCK-IGF-1X10 ("CCI-HGF₇₂₈+IGF-1X10").

Данные графические материалы показывают разные воплощения настоящего изобретения лишь в целях иллюстрации. Специалист в данной области легко узнает из следующего обсуждения то, что можно использовать альтернативные воплощения структур и способов, проиллюстрированных в данном документе, без отступления от принципов изобретения, описанного в данном документе.

6. Подробное описание изобретения

6.1 Определения

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понятное специалисту в области, к которой принадлежит данное изобретение. Следующие термины в том виде, в котором они используются в данном документе, имеют значения, приписываемые им ниже.

Термины «изоформа IGF-1» или «человеческая изоформа IGF-1» в том виде, в котором они используются в данном документе, используются взаимозаменяемо для названия полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотной последовательности одного из встречающихся в природе пре-прополипептидов человеческого IGF-1 или их аллельного варианта, образующегося в результате сплайсинга варианта или образующегося в результате делеции вариантов. Встречающиеся в природе полипептиды пре-про-IGF-1 включают изоформы Еc класса I (SEQ ID NO 16); Еа класса II (SEQ ID NO 18); Eb класса I (SEQ ID NO 20) и Еа класса I (SEQ ID NO 14).

Термины «изоформа №1», «изоформа Еc класса I», «изоформа Еc IGF-1 класса I» или «Еc IGF-1 класса I» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 16.

Термины «изоформа №2», «изоформа Еа класса II», «изоформа Еа IGF-1 класса II» или «Еа IGF-1 класса II» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 18.

Термины «изоформа №3», «изоформа Еb класса I», «изоформа Eb IGF-1 класса I» или «Еb IGF-1 класса I» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 20.

Термины «изоформа №4», «изоформа Еа класса I», «изоформа Еа IGF-1 класса I» или «Еа IGF-1 класса I» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия полипептида SEQ ID NO 14.

Термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится ко всем актам (а) подавления симптома нейропатии; (b) облегчения симптома нейропатии; и (с) устранения симптома нейропатии. В некоторых воплощениях композиция по настоящему изобретению может лечить нейропатию посредством роста нейронов или подавления гибели нейронов.

Термин «VM202» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к плазмидной ДНК, также именуемой pCK-HGF-X7, содержащей вектор рСK (SEQ ID NO 24) и HGF-X7 (SEQ ID NO 13), клонированный в вектор рСK. VM202 депонировали согласно условиям Будапештского соглашения в Корейский центр культуры микроорганизмов (KССМ) под номером доступа KССМ-10361 12 марта 2002 г.

Термин «изоформы HGF» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности встречающегося в природе у животного, включая человека, полипептида HGF. Данный термин включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична любому полноразмерному полипептиду HGF дикого типа, и включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична встречающемуся в природе аллельному варианту HGF, варианту, образующемуся в результате сплайсинга, или варианту, образующемуся в результате делеции. Предпочтительные для применения в настоящем изобретении изоформы HGF включают две или более чем две изоформы, выбранные из группы, состоящей из полноразмерного HGF (fIHGF) (синонимично, fHGF), делетированного варианта HGF (dHGF), NK1, NK2 и NK4. Согласно более предпочтительному воплощению настоящего изобретения изоформы HGF, используемые в способах, описанных в данном документе, включают fIHGF (SEQ ID NO 11) и dHGF (SEQ ID NO 12).

Термины «человеческий fIHGF», «fIHGF» и «fHGF» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия белка, состоящего из аминокислот 1-728 белка человеческого HGF. Последовательность fIHGF приводится в SEQ ID NO 11.

Термины «человеческий dHGF» или «dHGF» используются в данном документе взаимозаменяемо для названия делетированного варианта белка HGF, продуцируемого альтернативным сплайсингом человеческого гена HGF. В частности, «человеческий dHGF» или «dHGF» относится к человеческому белку HGF с делецией пяти аминокислот (F, L, Р, S и S) в первом домене «двойная петля» альфа цепи из последовательности полноразмерного HGF. Человеческий dHGF имеет 723 аминокислоты в длину. Аминокислотная последовательность человеческого dHGF приводится в SEQ ID NO 12.

Термин «терапевтически эффективная доза» или «эффективное количество» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к дозе или количеству, которое дает желательный эффект, для которого оно вводится. В контексте настоящих способов терапевтически эффективное количество представляет собой эффективное количество для лечения симптома нейропатии. Данное количество может представлять собой эффективное количество для лечения симптома нейропатии само по себе или в комбинации с другим терапевтическим средством.

Термин «достаточное количество» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к достаточному количеству, для того, чтобы давать желательный эффект. Данное количество может быть достаточным количеством для получения желательного эффекта самим по себе или в комбинации с другим терапевтическим средством.

Термин «вырожденная последовательность» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая может транслироваться с получением идентичной аминокислотной последовательности относительно аминокислотной последовательности, транслируемой от эталонной последовательности нуклеиновой кислоты.

6.2. Другие договоренности по интерпретации

Понятно, что перечисленные в данном документе интервалы представляют собой сокращенную запись для всех значений в пределах данного интервала, включая перечисленные конечные точки. Например, понятно то, что интервал от 1 до 50 включает любое число, комбинацию чисел или подинтервал из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, и 50.

6.3. Способы лечения нейропатии

В первом аспекте предложены способы лечения нейропатии. Данные способы включают введение субъекту, имеющему нейропатию, терапевтически эффективного количества первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, способной экспрессировать человеческую изоформу IGF-1; и терапевтически эффективного количества первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, способной экспрессировать человеческую изоформу HGF.

6.3.1. ДНК-конструкции, кодирующие IGF-1

В способах, предложенных в данном документе, используются ДНК-конструкции, способные экспрессировать по меньшей мере одну человеческую изоформу IGF-1.

Как проиллюстрировано на Фиг. 1, человеческий ген IGF-1 содержит шесть экзонов (экзоны 1, 2, 3, 4, 5 и 6 (6-1 и 6-2)), охватывающих почти 90 т.п.н. геномной ДНК. Экзоны 1 и 2 представляют собой взаимоисключающие лидерные экзоны, причем каждый имеет многочисленные промоторные сайты, которые используются по-разному. Кроме того, ген IGF-1 может подвергаться дифференциальному сплайсингу с созданием множества вариантов транскриптов. Каждый вариант транскрипта кодирует отличный белок пре-про-IGF-1 («изоформа IGF-1»), обладающий вариабельными последовательностями лидерного сигнального пептида. Тем не менее, все изоформы транскрипта приводят к одинаковому зрелому 70-аминокислотному пептиду IGF-1, который после процессинга использует одинаковый рецептор.

Пептиды пре-про-IGF-1 отличаются по их лидерным или сигнальным последовательностям и их карбокси(С)-концу. Включение экзона 1 или экзона 2 является взаимоисключающим, и один из них служит в качестве лидерной последовательности пептида пре-про-IGF-1; причем разные лидерные экзоны создают разные 5'-UTR (от англ. untranslated region - нетранслируемая область). Данные полипептиды пре-про-IGF-1 подвергаются посттрансляционному протеолитическому расщеплению с удалением лидера и карбоксиконца Е-пептида, приводя к зрелому 70-аминокислотному IGF-1.

Транскрипты, содержащие экзон 1, называются транскриптами класса 1 (например, Еc класса I; Еb класса I и Еа класса I на Фиг. 1), тогда как транскрипты, содержащие экзон 2, называются транскриптами класса 2 (например, Еа класса II на Фиг. 1). Почти все пре-пропептиды включают 27 аминокислот в сигнальном пептиде, происходящем от экзона 3, причем остальные сигнальные последовательности происходят от включения экзона 1 или 2. У меньшинства транскриптов используется отличный сайт инициации транскрипции в пределах экзона 3, генерируя более короткий сигнальный пептид из 22 аминокислот. Экзоны 3 и 4 являются инвариантными и кодируют домены В, С, А и D зрелого пептида IGF-1; экзон 4 кодирует две третьих зрелого пептида IGF-1. Человеческий пептид Еb состоит только из экзонов 4 и 5, тогда как Еc содержит экзоны 4, 5 и 6 (Фиг. 1).

Альтернативный сплайсинг и взаимоисключающая инициация транскрипции, которые приводят к образованию разных полипептидов пре-про-IGF-1 (т.е. изоформ IGF-1), проиллюстрированы на Фиг. 1. В частности, изоформа IGF-1 Еc класса I (SEQ ID NO 16), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 1, 3/4, 5 и 6, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 17. Изоформа IGF-1 Еа класса II (SEQ ID NO 18), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 2, 3/4 и 6, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 19. Изоформа IGF-1 Еb класса I (SEQ ID NO 20), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 1, 3/4 и 5, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 21. Изоформа IGF-1 Еа класса I (SEQ ID NO 14), содержащая по меньшей мере фрагмент экзонов 1, 3/4 и 6, генерируется из транскрипта, содержащего последовательность SEQ ID NO 15.

Несмотря на то, что зрелый белок IGF-1, образующийся от разных транскриптов, не отличается, предполагали то, что разные изоформы транскриптов имеют разные регуляторные функции. Формы вариантов обладают разными стабильностями, партнерами связывания и активностью, указывая на ключевую регуляторную роль для данных изоформ. Биологическая значимость данных изоформ остается неясной, хотя и предполагали то, что изоформы класса I с экзоном 1 являются аутокринными/паракринными формами, тогда как изоформы класса II с экзоном 2 являются секретируемыми эндокринными формами. Это основывается на данных о том, что транскрипты класса II включают типичный мотив сигнального пептида, ассоциированный с эффективной секрецией, тогда как транскрипты класса I имеют более длинный сигнальный пептид, который возможно может препятствовать секреции.

Считается, что большинство тканей использует транскрипты класса I, хотя в печени используются обе формы, и печеночные транскрипты класса II предпочтительно усиливаются во время развития. Имеется множество изменений в количестве транскриптов IGF-1 на протяжении развития. Обнаружили то, что Еа класса 1 является самой преобладающей формой во время фазы активного роста, а Еb класса 1 также однородно экспрессируется, хотя и на более низких уровнях, по всей ростовой пластинке на протяжении ранних фаз роста.

В данном документе предложены ДНК-конструкции, способные экспрессировать по меньшей мере одну изоформу человеческого IGF-1. Такая одиночная экспрессионная конструкция включает pCK-IGF-1#1, который представляет собой вектор рСK, содержащий кодирующую последовательность для изоформы №1 IGF-1; pCK-IGF-1#2, который представляет собой вектор рСK, содержащий кодирующую последовательность для изоформы №2 IGF-1; pCK-IGF-1#3, который представляет собой вектор рСK, содержащий кодирующую последовательность для изоформы №3 IGF-1, и pCK-IGF-1#4, который представляет собой вектор рСK, содержащий кодирующую последовательность для изоформы №4 IGF-1, но не ограничивается ими. В некоторых воплощениях используется более чем одна ДНК-конструкция, причем каждая кодирует другую изоформу IGF-1. Например, совместно используются первая конструкция, кодирующая изоформу Еc класса I (изоформа №1), и вторая конструкция, кодирующая изоформу Еа класса I (изоформа №4). Например, можно использовать совместно pCK-IGF-1#1 и pCK-IGF-1#4.

Такая конструкция одиночной экспрессии дополнительно включает pTx-IGF-1#1, который представляет собой вектор рТх, содержащий кодирующую последовательность изоформы №1 IGF-1; pTx-IGF-1#2, который представляет собой вектор рТх, содержащий кодирующую последовательность изоформы №2 IGF-1; pTx-IGF-1#3, который представляет собой вектор рТх, содержащий кодирующую последовательность изоформы №3 IGF-1, и pTx-IGF-1#4, который представляет собой вектор рТх, содержащий кодирующую последовательность изоформы №4 IGF-1, но не ограничивается ими. В некоторых воплощениях используется более чем одна ДНК-конструкция, причем каждая кодирует другую изоформу IGF-1. Например, совместно используются первая конструкция, кодирующая изоформу Еc класса I (изоформа №1), и вторая конструкция, кодирующая изоформу Еа класса I (изоформа №4). Например, можно совместно использовать pTx-IGF-1#1 и pTx-IGF-1#4.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция содержит кодирующую последовательность одной из изоформ IGF-1. Например, данная ДНК-конструкция может содержать последовательность, кодирующую Еа класса I (изоформа №4) (SEQ ID NO 15); Eb класса I (изоформа №3) (SEQ ID NO 21); Еc класса I (изоформа №1) (SEQ ID NO 17); или Еа класса II (изоформа №2) (SEQ ID NO 19).

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция представляет собой конструкцию двойной экспрессии - ДНК-конструкцию, которая может экспрессировать более чем одну изоформу IGF-1 посредством содержания регуляторной последовательности экспрессии для каждой последовательности, кодирующей изоформу (CDS - от англ. coding sequence). В некоторых воплощениях данная конструкция содержит участок внутренней посадки рибосомы (IRES - от англ. internal ribosomal entry site) между двумя кодирующими последовательностями, например, в порядке: (1) регуляторная последовательность экспрессии - (2) кодирующая последовательность первой изоформы - (3) IRES - (4) кодирующая последовательность второй изоформы - (5) последовательность терминации транскрипции. IRES обеспечивает начало трансляции в последовательности IRES, обеспечивая, посредством этого, экспрессию двух белковых продуктов от одного транскрипта. В других воплощениях совместно используется множество конструкций, причем каждая кодирует одну изоформу IGF-1, для индукции экспрессии более чем одной изоформы IGF-1 у субъекта, которому они вводятся.

В предпочтительных воплощениях данная ДНК-конструкция способна одновременно экспрессировать две или более чем две изоформы IGF-1 - например, (i) изоформу Еc класса I (изоформа №1) и изоформу Еа класса II (изоформа №2); (ii) изоформу Еc класса I (изоформа №1) и изоформу Еb класса I (изоформа №3); (iii) изоформу Еc класса I (изоформа №1) и изоформу Еа класса I (изоформа №4); (iv) изоформу Еа Класса II (изоформа №2) и изоформу Еb Класса I (изоформа №3); (v) изоформу Еа класса II (изоформа №2) и изоформу Еа класса I (изоформа №4); (vi) изоформу Еb класса I (изоформа №3) и изоформу Еа класса I (изоформа №4) - посредством содержания сайта альтернативного сплайсинга.

Например, данная ДНК-конструкция может содержать (i) первую последовательность, содержащую экзоны 1, 3 и 4 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 1), или вырожденную последовательность данной первой последовательности; (ii) вторую последовательность, содержащую интрон 4 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 2), или фрагмент данной второй последовательности; (iii) третью последовательность, содержащую экзоны 5 и 6-1 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 3), или вырожденную последовательность данной третьей последовательности; (iv) четвертую последовательность, содержащую интрон 5 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 4) или фрагмент данной второй последовательности; и (v) пятую последовательность, содержащую экзон 6-2 человеческого гена IGF-1 (SEQ ID NO 5), или вырожденную последовательость данной пятой последовательности. Интроны 4 и 5 могут подвергаться альтернативному сплайсингу, приводя к продукции двух изоформ IGF-1 (например, Еc класса I и Еа класса I).

В некоторых воплощениях данную ДНК-конструкцию анализируют in vitro и/или in vivo в отношении ее способности экспрессировать одну или более чем одну изоформу IGF-1. В предпочтительных воплощениях выбирают ДНК-конструкции, способные экспрессировать и изоформы Еc класса I, и изоформы Еа класса I IGF-1.

В некоторых воплощениях данная конструкция содержит полную последовательность интрона 4 (SEQ ID NO 2) или его фрагмент. В предпочтительных воплощениях данная конструкция содержит фрагмент интрона 4, имеющий последовательность SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO 7.

В некоторых воплощениях данная конструкция содержит полную последовательность интрона 5 (SEQ ID NO 4) или его фрагмент. В предпочтительных воплощениях данная конструкция содержит фрагмент интрона 5, имеющий последовательность SEQ ID NO 8.

Разные ДНК-конструкции, содержащие последовательности, соответствующие (i) экзонам 1-6 человеческого гена IGF-1 и (ii) интронам 4 и 5 человеческого гена IGF-1 или разные фрагменты интронов 4 и 5, называются «IGF-1Х» с последующим уникальным номером. Проанализированные заявителем конструкции IGF-1X включают IGF-1X1, IGF-1X2, IGF-1X3, IGF-1X4, IGF-1X5, IGF-1X6, IGF-1X7, IGF-1X8, IGF-1X9 и IGF-1X10, но не ограничиваются ими. Конструкции IGF-1X1, клонированные в вектор рСK, называются pCK-IGF-1X1, pCK-IGF-1X2, pCK-IGF-1X3, pCK-IGF-1X4, pCK-IGF-1X5, pCK-IGF-1X6, pCK-IGF-1X7, pCK-IGF-1X8, pCK-IGF-1X9 и pCK-IGF-1X10 соответственно. Среди проанализированных конструкций идентифицировали то, что pCK-IGF-1X6 и рСK-IGF-1X10 экспрессируют и изоформу Еc класса I, и Еа класса I IGF-1. Конструкции IGF-1X, клонированные в вектор рТх, называются pTx-IGF-1X1, pTx-IGF-1X2, рТх-IGF-1X3, pTx-IGF-1X4, pTx-IGF-1X5, pTx-IGF-1X6, pTx-IGF-1X7, pTx-IGF-1X8, pTx-IGF-1X9 и pTx-IGF-1X10 соответственно. pTx-IGF-1X6 и pTx-IGF-1X10 экспрессируют и изоформу Еc класса I, и Еа класса I IGF-1.

В предпочтительных воплощениях используются IGF-1X6 (SEQ ID NO 9) или IGF-1X10 (SEQ ID NO 10). IGF-1X6 (SEQ ID NO 9) и IGF-1X10 (SEQ ID NO 10), клонированные в вектор рСK, называются pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10 соответственно. Клетки Е. coli, трансформированные pCK-IGF-1X6 ("DH5α_pCK-IGF1 Х6"), депонировали согласно условиям Будапештского соглашения в Корейскую коллекцию типовых культур (KСТС (от англ. Korea Collection for Type Cultures), Корейский исследовательский институт биологических наук и биотехнологии (KRIBB - от англ. Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 181, Ipsin-gil, Jeongeup-si, Jeollabuk-do, 56212, Республика Корея) с номером доступа KСТС 13539 ВР 30 мая 2018 г. Клетки E. coli, трансформированные pCK-IGF-1X10 ("DH5α_pCK-IGF1 Х10"), депонировали согласно условиям Будапештского соглашения в Корейскую коллекцию типовых культур (KСТС, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) 181, Ipsin-gil, Jeongeup-si, Jeollabuk-do, 56212, Республика Корея) с номером доступа KСТС 13540 ВР 30 мая 2018 г.

В других предпочтительных воплощениях используют IGF-1X6 (SEQ ID NO 9) и IGF-1X10 (SEQ ID NO 10), клонированные в вектор рТх (SEQ ID NO 38). Данные конструкции IGF называются pTx-IGF-1X6 и pTx-IGF-1X10 (SEQ ID NO 39) соответственно.

Изоформы IGF-1 или ДНК-конструкции, кодирующие изоформы IGF-1, описанные в данном документе, могут включать модификации от человеческих изоформ IGF-1 дикого типа. Данные модифицированные последовательности могут включать последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью при максимальном выравнивании данных модифицированных последовательностей с последовательностями человеческой изоформы IGF-1 дикого типа. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Способы выравнивания последовательностей для сравнения являются хорошо известными в данной области. В частности, алгоритм выравнивания, раскрытый на сайте Средства поиска основного локального выравнивания (BLAST - от англ. Basic Local Alignment Search Tool) NCBI Национального центра биотехнологической информации (NBCI - от англ. National Center for Biotechnological Information, Bethesda, Md.) и используемый в связи с программами анализа последовательностей blastp, blasm, blastx, tblastn и tblastx, можно использовать для определения процента идентичности.

6.3.2. ДНК-конструкции, кодирующие HGF

В способах, предложенных в данном документе, используются ДНК-конструкции, способные экспрессировать по меньшей мере одну изоформу человеческого HGF.

Фактор роста гепатоцитов (HGF) представляет собой гепаринсвязывающий гликопротеин, также известный как рассеивающий фактор или гепатопоэтин-А. HGF имеет многочисленные биологические эффекты, такие как митогенез, мотогенез и морфогенез разных типов клеток. HGF кодируется геном, содержащим 18 экзонов и 17 интронов, расположенным на хромосоме 7q21.1.

Ген HGF кодирует две изоформы HGF посредством альтернативного сплайсинга между экзоном 4 и экзоном 5 - две данные изоформы включают: (1) предшественник полноразмерного полипептида HGF («fIHGF»), содержащий 728 аминокислот (SEQ ID NO 11), со следующими доменами: сериновая протеаза, инактивированная N-концевой петлей шпильки-двойной петлей 1-двойной петлей 2-двойной петлей 3-двойной петлей 4, и (2) делетированный вариант HGF («dHGF»), содержащий 723 аминокислоты (SEQ ID NO 12) с делецией пяти аминокислот в первом домене «двойная петля» альфа-цепи (т.е. F, L, Р, S и S). fIHGF и dHGF имеют несколько общих биологических функций, но отличаются в показателях иммунологических характеристик и нескольких биологических свойств. Было продемонстрировано, что данные две изоформы HGF являются эффективными в лечении диабетической нейропатии, как раскрыто в публикации США №20140296142, включенной в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте.

Согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения предложен способ введения конструкции, кодирующей одну или более чем одну изоформу HGF. В некоторых воплощениях используется конструкция, кодирующая и fIHGF, и dHGF. В некоторых воплощениях используется конструкция, кодирующая либо fIHGF, либо dHGF. В частности, может использоваться конструкция, содержащая полинуклеотид SEQ ID NO 33. Данные конструкции могут содержать вектор с одной или более чем одной регуляторной последовательностью (например, промотором или энхансером), связанной функциональным образом с кодирующей последовательностью, кодирующей fIHGF, dHGF или и ту, и другую. Данная регуляторная последовательность может регулировать экспрессию изоформы HGF.

В некоторых воплощениях конструкция может кодировать две или более чем две изоформы HGF посредством содержания регуляторной последовательности экспрессии для кодирующей последовательности (CDS) каждой изоформы. В качестве альтернативы, данная конструкция может содержать участок внутренней посадки рибосомы (IRES) между двумя кодирующими последовательностями, например, в порядке: (1) регуляторная последовательность экспрессии - (2) кодирующая последовательность первой изоформы - (3) IRES - (4) кодирующая последовательность второй изоформы - (5) последовательность терминации транскрипции. IRES обеспечивает начало трансляции в последовательности IRES, обеспечивая, посредством этого, экспрессию двух интересующих генов от одной конструкции. В качестве альтернативы, для индукции экспрессии более чем одной изоформы HGF в мишени можно использовать более чем одну конструкцию, причем каждая кодирует одну изоформу HGF.

В предпочтительных воплощениях используется конструкция, которая одновременно экспрессирует две или более чем две разные изоформы HGF - т.е. fIHGF и dHGF - посредством включения сайта альтернативного сплайсинга. В патенте США №7812146, включенном в данный документ посредством ссылки во всей его полноте, ранее было продемонстрировано то, что конструкция, кодирующая две изоформы HGF (fIHGF и dHGF), имеет значительно большую (почти в 250 раз большую) эффективность экспрессии, чем конструкция, кодирующая одну изоформу HGF (либо fIHGF, либо dHGF).

Данная конструкция может включать кДНК, соответствующую экзону 1-18 человеческого HGF и интрону 4 гена человеческого HGF или его фрагмента, который вставлен между экзоном 4 и экзоном 5 кДНК. От данной конструкции могут быть генерированы две изоформы HGF (fIHGF и dHGF) посредством альтернативного сплайсинга между экзоном 4 и экзоном 5. В некоторых воплощениях данная конструкция содержит полную последовательность интрона 4 (SEQ ID NO 25). В некоторых воплощениях данная конструкция содержит фрагмент интрона 4.

Конструкция, содержащая кДНК, соответствующую экзону 1-18 человеческого HGF и интрону 4 человеческого гена HGF или его фрагмента, может кодировать две изоформы HGF посредством альтернативного сплайсинга в интроне 4 или его фрагменте. В частности, данная конструкция может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 13 и SEQ ID NO 26 - SEQ ID NO 32. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO 26 имеет 7113 п. н. и соответствует конструкции, содержащей полную последовательность интрона 4. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO 13 и 27-32 соответствует конструкциям, содержащим разные фрагменты интрона 4.

Разные ДНК-конструкции, содержащие кДНК, соответствующую экзону 1-18 человеческого HGF и интрону 4 человеческого гена HGF или его фрагмента, называются «HGF-Х» с последующим уникальным номером. HGF-X, которая может использоваться для разных воплощений настоящего изобретения, включает HGF-Х1 (SEQ ID NO 26), HGF-X2 (SEQ ID NO 27), HGF-X3 (SEQ ID NO 28), HGF-X4 (SEQ ID NO 29), HGF-X5 (SEQ ID NO 30), HGF-X6 (SEQ ID NO 31), HGF-X7 (SEQ ID NO 13; кодирующая последовательность HGF в VM202) и HGF-X8 (SEQ ID NO 32), но не ограничивается ими.

Продемонстрировали то, что pCK-HGF-X7 (т.е. VM202) имеет наивысшую эффективность экспрессии, как раскрыто в патенте США №7812146. Соответственно, в предпочтительных воплощениях настоящего изобретения может использоваться ДНК-конструкция, содержащая HGF-X7.

Конструкции, используемые в данном изобретении, могут включать по существу идентичные нуклеотидные последовательности относительно последовательностей человеческих изоформ HGF дикого типа. Существенная идентичность включает последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%-ной идентичностью при измерении с использованием одного из алгоритмов сравнения последовательностей, где аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность человеческой изоформы HGF дикого типа максимально выравнивается с последовательностью. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Разные программы и алгоритмы выравнивания описываются в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 15 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989) Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Соmр. Appl. BioSci. 8: 155-65 (1992) и Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994). Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) от NCBI [Altschul 20 et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990) доступен из нескольких источников, включающих Национальный центр биологической информации (NBCI, Bethesda, Md.) и интернет, для применения в связи с программами анализа последовательностей blastp, blasm, blastx, tblastn и tblastx.

6.3.3. Вектор

ДНК-конструкции, экспрессирующие изоформу IGF-1 или изоформу HGF, используемые в способах, описанных в данном документе, типично содержат вектор с одной или более чем одной регуляторной последовательностью (например, промотором или энхансером), связанной функциональным образом с экспрессируемыми последовательностями. Данные регуляторные последовательности регулируют экспрессию изоформ IGF-1 или изоформ HGF.

Предпочтительным является то, что в экспрессионной конструкции полинуклеотид, кодирующий одну или более чем одну изоформу IGF-1 или изоформу HGF, связан функциональным образом с промотором. Термин «связанный функциональным образом» относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (такой как промотор, сигнальная последовательность или группа сайтов связывания транскрипционных факторов) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где последовательность контроля экспрессии влияет на транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.

В типичных воплощениях промотор, связанный с данным полинуклеотидом, является функциональным предпочтительно у животных, более предпочтительно в клетках млекопитающих, для контроля транскрипции полинуклеотида, включая промоторы, происходящие из генома клеток млекопитающих или из вирусов млекопитающих, например, промотор цитомеголовируса (CMV - от англ. cytomegalovirus), поздний промотор аденовируса, промотор вируса осповакцины 7.5K, промотор SV40, промотор tk HSV (от англ. Herpes Simplex Virus - вирус простого герпеса), промотор RSV (от англ. respiratory syncytial virus - вирус саркомы Рауса), промотор EF1 альфа, промотор металлотионеина, промотор бета-актина, промотор гена IL-2 (от англ. interleukin - интерлейкин) человека, промотор гена IFN (от англ. interferon - интерферон) человека, промотор гена IL-4 человека, промотор гена лимфотоксина человека и промотор гена GM-CSF (от англ. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) человека, но не ограничиваясь ими. Более предпочтительно, полезный в данном изобретении промотор представляет собой промотор, происходящий из IE (немедленный ранний) гена человеческого CMV (hCMV), или промотор EF1 альфа, наиболее предпочтительно промотор/энхансер, происходящий из IE гена hCMV, и 5'-UTR (нетранслируемая область), содержащая всю последовательность экзона 1 и экзона 2, охватывающую последовательность непосредственно перед инициирующим кодоном ATG.

Экспрессионная кассета, используемая в данном изобретении, может содержать последовательность полиаденилирования, например, включающую терминатор коровьего гормона роста (Gimmi, Е.R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), происходящую из SV40 последовательность полиаденилирования (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), полиА ВИЧ-1 (вирус иммунодефицита человека-1) (Klasens, В. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), полиА β-глобина (Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), полиА ТK HSV (Cole, C.N. and T.P. Stacy, Mol. Cell. 5 Biol. 5: 2104-2113 (1985)) или полиА вируса полиомы (Batt, D. Band G.G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995)), но не ограничивающуюся ими.

6.3.3.1. Невирусный вектор

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, способная экспрессировать человеческую изоформу IGF-1, и/или ДНК-конструкция, кодирующая HGF, способная экспрессировать человеческую изоформу HGF, представляет собой невирусный вектор, способный экспрессировать одну или более чем одну изоформу IGF-1 или одну или более чем одну изоформу HGF.

В типичных воплощениях невирусный вектор представляет собой плазмиду. В предпочтительных в настоящее время воплощениях данная плазмида представляет собой рСK, рСР, pVAXI, рТх или pCY. В особенно предпочтительных воплощениях, данная плазмида представляет собой рСK, подробности о которой можно найти в WO 2000/040737 и Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 272:230-235 (2000), которые обе включаются в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Е. coli, трансформированную рСK (Тор10-рСK), депонировали в Корейский центр культуры микроорганизмов (KССМ) согласно условиям Будапештского соглашения 21 марта 2003 г. (№ доступа: KССМ-10476). Е. coli, трансформированную pCK-VEGF165 (т.е. вектор рСK с кодирующей последовательностью VEGF - Top10-pCK/VEGF165'), депонировали в Корейский центр культуры микроорганизмов (KССМ) согласно условиям Будапештского соглашения 27 декабря 1999 г. (№ доступа: KССМ-10179).

Вектор рСK конструируется таким образом, что экспрессия гена, например, гена IGF-1 или гена HGF, регулируется под энхансером/промотором человеческого цитомегаловируса (HCMV), как подробно раскрыто в Lee et al., Biochem, Biophys, Res. Commun. 272: 230 (2000); WO 2000/040737, которые обе включаются посредством ссылки во всей их полноте. Вектор рСK использовали для клинических испытаний в человеческом организме, и его безопасность и эффективность были подтверждены (Henry et al., Gene Ther. 18:788 (2011)).

В предпочтительных воплощениях плазмида рСK содержит кодирующую последовательность для изоформы IGF-1 Еc класса I и/или изоформы IGF-1 Еа класса I. В особенно предпочтительных воплощениях плазмида рСK содержит IGF-1X6 (т.е. pCK-IGF-1X6) или IGF-1 Х10 (т.е. pCK-IGF-1X10).

В предпочтительных воплощениях плазмида рСK содержит кодирующую последовательность для изоформ fIHGF и/или dHGF. В особенно предпочтительных воплощениях плазмида рСK содержит HGF-X7 (т.е. pCK-HGF-Х7 или VM202).

В других предпочтительных воплощениях данная плазмида представляет собой рТх (SEQ ID NO 38) - плазмидный вектор, происходящий из рСK. рТх получали посредством двух последовательных раундов мутагенеза рСK. Первый делеционный мутагенез проводили для удаления ненеобходимой последовательности между геном устойчивости к канамицину и СоIЕ1 рСK. В частности, делеционный ПЦР-мутагенез проводили с использованием первой пары праймеров (SEQ ID NO: 34 и 35). Делецию 228 пар оснований между геном устойчивости к канамицину и СоIЕ1 подтверждали секвенированием плазмиды. Затем проводили второй делеционный ПЦР-мутагенез с использованием второй пары праймеров (SEQ ID NO: 36 и 37) для оптимизации размера последовательности интрона HCMV. Последовательность интрона HCMV (421 пара оснований) между экзоном 1 и экзоном 2 IE1 подвергали делеции, и данную делецию подтверждали секвенированием.

В конкретных воплощениях плазмида рТх содержит IGF-1X6 (т.е. pTx-IGF-1X6) или IGF-1 Х10 (т.е. pTx-IGF-1X10). Например, рТх-1Х10 (SEQ ID NO 39) получали посредством лигирования IGF-1X10 в рТх, расщепленную ферментом Clal на 5' и ферментом Sal1 на 3'.

6.3.3.2. Вирусный вектор

В других воплощениях для доставки и экспрессии одной или более чем одной изоформы IGF-1 и/или одной или более чем одной изоформы HGF по настоящему изобретению можно использовать разные вирусные векторы, известные в данной области. Например, для некоторых воплощений настоящего изобретения можно использовать векторы, разработанные с использованием ретровирусов, лентивирусов, аденовирусов или аденоассоциированных вирусов.

(а) Ретровирус

Ретровирусы, способные нести относительно большие экзогенные гены, использовали в качестве вирусных векторов доставки генов в том смысле, что они интегрируют их геном в геном хозяина и имеют широкий спектр хозяев.

Для того чтобы сконструировать ретровирусный вектор, полинуклеотид по изобретению (например, кодирующую последовательность одной или более чем одной изоформы IGF-1) вставляют в вирусный геном вместо определенных вирусных последовательностей для получения дефектного по репликации вируса. Для получения вирионов конструируют упаковочную линию клеток, содержащую гены gag, pol и env, но без компонентов LTR (от англ. long terminal repeat - длинный концевой повтор) и W (Mann et al., Cell, 33:153-159 (1983)). Когда рекомбинантную плазмиду, содержащую полинуклеотид по изобретению, в данную линию клеток вводят LTR и W, последовательность W обеспечивает упаковку РНК-транскрипта рекомбинантной плазмиды в вирусные частицы, которые затем секретируются в культуральную среду (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). Среду, содержащую рекомбинантные ретровирусы, затем отбирают, возможно концентрируют и используют для доставки генов.

Был описан успешный перенос генов с использованием ретровирусного вектора второго поколения. Kasahara et al. (Science, 266:1373-1376 (1994)) получили варианты вируса мышиного лейкоза Молони, в котором вместо области оболочки вставлена последовательность ЕРО (от англ. erythropoietin - эритропоэтин), получая впоследствии химерные белки, имеющие новые свойства связывания. Подобным образом, настоящую систему доставки генов можно конструировать согласно стратегиям конструирования для ретровирусного вектора второго поколения.

(b) Лентивирусы

В некоторых воплощениях настоящего изобретения также можно использовать лентивирусы. Лентивирусы представляют собой подкласс ретровирусов. Однако лентивирус может интегрироваться в геном неделящихся клеток, тогда как ретровирусы могут инфицировать только делящиеся клетки.

Лентивирусные векторы обычно продуцируются из упаковочной линии клеток, обычно НЕK293, трансформированной несколькими плазмидами. Данные плазмиды включают (1) упаковочные плазмиды, кодирующие вирионные белки, такие капсид и обратную транскриптазу, (2) плазмиду, содержащую экзогенный ген (например, кодирующую последовательность одной или более чем одной изоформы IGF-1, или одной или более чем одной изоформы HGF), подлежащий доставке в мишень.

При поступлении данного вируса в клетку вирусный геном в виде РНК подвергается обратной транскрипции с получением ДНК, которая затем вставляется в геном посредством фермента вирусной интегразы. Таким образом, экзогенно доставленное с использованием лентивирусного вектора может оставаться в геноме и передаваться потомству клетки при ее делении.

(c) Аденовирус

Аденовирус обычно использовали в качестве системы доставки генов из-за его генома среднего размера, легкости манипуляции, высокого титра, широкого интервала клеток-мишеней и высокой инфекционности. Оба конца данного вирусного генома содержат ITR (от англ. inverted terminal repeats инвертированные концевые повторы) из 100-200 п.н., которые представляют собой цис-элементы, необходимые для репликации и упаковки вирусной ДНК. Область EI (EIA и EIB) кодирует белки, ответственные за регуляцию транскрипции вирусного генома и нескольких клеточных генов. Экспрессия области Е2 (Е2А и Е2В) приводит к синтезу белков для репликации вирусной ДНК.

Из аденовирусных векторов, разработанных до настоящего времени, обычно используют некомпетентный в отношении репликации аденовирус, имеющий делетированную область EI. Делетированная область Е3 в аденовирусных векторах может обеспечивать сайт вставки для трансгенов (Thimmappaya, В. еt al., Cell, 31:543-551(1982) и Riordan, J.R. et al., Science, 245:1066- 1073 (1989)). Следовательно, предпочтительным является то, что нуклеотидную последовательность, кодирующую декорин, вставляют либо в делетированную область EI (область EIA и/или область EIB 5, предпочтительно область EIB), либо в делетированную область Е3. Полинуклеотид по изобретению может быть вставлен в делетированную область Е4. Термин «делеция» по отношению к вирусным геномным последовательностям охватывает полную делецию, а также частичную делецию. В природе аденовирус может упаковывать приблизительно 105% от генома дикого типа, обеспечивая вместительность для примерно 2 дополнительных т.п.н. ДНК (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J. 6:1733-1 739 (1987)). В данном отношении чужеродные последовательности, описанные выше, вставленные в аденовирус, могут быть дополнительно вставлены в геном аденовируса дикого типа.

Данный аденовирус может быть любого известного серотипа или подгруппы A-F. Аденовирус типа 5 подгруппы С является самым предпочтительным исходным материалом для конструирования аденовирусной системы доставки генов по данному изобретению. Известно значительное количество биохимической и генетической информации об аденовирусе типа 5. Чужеродные гены, доставляемые аденовирусной системой доставки генов, являются эписомными и генотоксичные для клеток-хозяев. Следовательно, генотерапия с использованием аденовирусной системы доставки генов может быть в значительной степени безопасной.

(d) Аденоассоциированный вирус (AAV, от англ - adeno-associated virus)

Аденоассоциированные вирусы способны инфицировать неделящиеся клетки и разные типы клеток, делая их полезными в конструировании системы доставки генов по данному изобретению. Подробные описания для применения и получения вектора на основе AAV находятся в патентах США №10308958; 10301650; 10301648; 10266846; 10265417; 10208107; 10167454; 10155931; 10149873; 10144770; 10138295; 10137176; 10113182; 10041090; 9890365; 9790472; 9770011; 9738688; 9737618; 9719106; 9677089; 9617561; 9597363; 9593346; 9587250; 9567607; 9493788; 9382551; 9359618; 9217159; 9206238; 9163260; 9133483; 8962332, раскрытия которых включаются в данный документ посредством ссылки во всей их полноте, и патентах США №5139941 и 4797368, раскрытия которых включаются в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

Результаты исследования для AAV в качестве систем доставки генов раскрываются в LaFace et al., Viology, 162: 483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al., J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) и Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995). Типично рекомбинантный вирус AAV получают сотрансфицированием плазмиды, содержащей интересующий ген (т.е. интересующую нуклеотидную последовательность, подлежащую доставке, например, кодирующую последовательность изоформы IGF-1), фланкированный двумя концевыми повторами AAV (McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989), и экспрессией плазмиды, содержащей кодирующие последовательности AAV дикого типа без концевых повторов (McCarty et al., J. Viral., 65:2936-2945 (1991)).

(e) Другие вирусные векторы

В настоящем изобретении можно использовать другие вирусные векторы в качестве системы доставки генов. В настоящих системах доставки для трансфицирования в клетки полинуклеотида по изобретению можно использовать векторы, полученные из таких вирусов, как вирус осповакцины (Puhlmann М. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) и Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), лентивирус (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104 (11): RS 5-62 (1999)) и вирус простого герпеса (Chamber R., et al., Proc. Natl. 10 15 Acad. Sci USA 92:1411-1415 (1995)).

6.3.4. Способы введения

Для введения ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и ДНК-конструкции, кодирующей HGF, можно использовать разные способы.

6.3.4.1.1. Инъекция

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция вводится посредством инъекции жидкой фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся совместно посредством одной инъекции. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся совместно посредством многих инъекций. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся индивидуально посредством многих инъекций.

В предпочтительных в настоящее время воплощениях ДНК-конструкция вводится посредством внутримышечной инъекции. Типично ДНК-конструкция вводится посредством внутримышечной инъекции близко к месту повреждения нерва, месту боли или ощущаемому пациентом месту боли, или месту другого симптома, ассоциированного с нейропатическим заболеванием. В некоторых воплощениях ДНК-конструкции вводятся в мышцы кистей, ступней или рук субъекта.

В некоторых воплощениях данную конструкцию инъецируют подкожно или внутрикожно. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция вводится посредством внутрисосудистой доставки. В некоторых воплощениях данную конструкцию инъецируют посредством ретроградной внутривенной инъекции.

6.3.4.1.2. Электропорация

Эффективность трансформации плазмидной ДНК в клетки in vivo в некоторых случаях может улучшаться посредством осуществления инъекции с последующей электропорацией. Таким образом, в некоторых воплощениях ДНК-конструкция вводится посредством инъекции, с последующей электропорацией. В конкретных воплощениях введение элекропорацией осуществляется с использованием системы доставки TriGrid™ (Ichor Medical Systems, Inc., Сан-Диего, США).

6.3.4.1.3. Сонопорация

В некоторых воплощениях для усиления эффективности трансформации ДНК-конструкции по настоящему изобретению используют сонопорацию. В сонопорации используется ультразвуковая волна для временной пермеабилизации клеточной мембраны для обеспечения клеточного поглощения ДНК. ДНК-конструкции могут включаться в микропузырьки и вводиться в большой круг кровообращения, с последующим внешним приложением ультразвука. Ультразвук индуцирует кавитацию микропузырька в пределах ткани-мишени, что приводит к высвобождению и трансфекции конструкций.

6.3.4.1.4. Магнитофекция

В некоторых воплощениях для усиления эффективности трансформации ДНК-конструкции по настоящему изобретению используют магнитофекцию. Данная конструкция вводится после связывания с магнитной наночастицей. Приложение высокоградиентных внешних магнитов вызывает захват и удержание комплекса в мишени. Данная ДНК-конструкция может высвобождаться ферментативным расщеплением сшивающей молекулы, взаимодействием зарядов или деградацией матрикса.

6.3.4.1.5. Липосома

В некоторых воплощениях ДНК-конструкции по настоящему изобретению могут доставляться посредством липосом. Липосомы спонтанно образуются при суспендировании фосфолипидов в избытке водной среды. Опосредованная липосомами доставка ДНК была успешной, как описано в Dos Santos Rodrigues et al., Int. J. Pharm. 566:717-730 (2019); Rasoulianboroujeni et al., Mater Sci Eng С Mater Biol Appl. 75:191-197 (2017); Xiong et al., Pharmazie 66(3):158-164 (2011); Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982) и Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987). Пример имеющихся в продаже реактивов для трансфицирования животных клеток с использованием липосом включает липофектамин (Gibco BRL). Липосомы, захватывающие ДНК-конструкции по изобретению, взаимодействуют с клетками посредством таких механизмов, как эндоцитоз, адсорбция и слияние, и затем переносят данные последовательности в клетки.

6.3.4.1.6. Трансфекция

При использовании вирусного вектора для доставки ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, или ДНК-конструкции, кодирующей HGF, данная конструкция может доставляться в клетки разными способами вирусной инфекции, известными в данной области. Инфекция клеток-хозяев с использованием вирусных векторов известна в данной области.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может вводиться парентерально. Для неперорального введения можно использовать внутривенную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутримышечную инъекцию, подкожную инъекцию или местную инъекцию. Например, данная фармацевтическая композиция может инъецироваться ретроградной внутривенной инъекцией.

Предпочтительно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться в мышцу. В некоторых воплощениях данное введение нацелено в мышцу, пораженную нейропатией (например, невропатической болью или другими симптомами).

6.3.5. Доза

ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся в терапевтически эффективных количествах. В описанных в данном документе способах терапевтически эффективное количество или доза ДНК-конструкции представляет собой эффективную дозу для лечения нейропатии у субъекта самой по себе или в комбинации с другой ДНК-конструкцией, или в комбинации с другим терапевтическим средством.

В некоторых воплощениях способов, описанных в данном документе, каждая из ДНК-конструкций (ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и ДНК-конструкция, кодирующая HGF) вводится в общей дозе от 1 мкг до 200 мг, от 1 мг до 200 мг, от 1 мг до 100 мг, от 1 мг до 50 мг, от 1 мг до 20 мг, от 2 мг до 10 мг, 16 мг, 8 мг, 4 мг или 2 мг.

В некоторых воплощениях общая доза ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и общая доза ДНК-конструкции, кодирующей HGF, которые вводятся субъекту, являются одинаковыми. В некоторых воплощениях общая доза ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и общая доза ДНК-конструкции, кодирующей HGF, являются разными. В некоторых воплощениях общая доза ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, корректируется в зависимости от общей дозы ДНК-конструкции, кодирующей HGF. В некоторых воплощениях общая доза ДНК-конструкции, кодирующей HGF, корректируется в зависимости от общей дозы ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1.

В типичных воплощениях общая доза каждой ДНК-конструкции делится на целый ряд индивидуальных инъекционных доз. В некоторых воплощениях общая доза делится на целый ряд равных инъекционных доз. В некоторых воплощениях общая доза делится на неравные инъекционные дозы.

В разных воплощениях с раздельными дозами общая доза каждой ДНК-конструкции вводится в 4, 8, 16, 24, 32 или 64 разных инъекционных сайтов.

В некоторых воплощениях доза каждой ДНК-конструкции на инъекцию составляет от 0,1 до 20 мг, от 1 до 10 мг, от 2 до 8 мг или от 3 до 8 мг. В определенных воплощениях доза каждой ДНК-конструкции на инъекцию составляет 0,1 мг, 0,15 мг, 0,2 мг, 0,25 мг, 0,3 мг, 0,35 мг, 0,4 мг, 0,45 мг, 0,5 мг, 1 мг, 2 мг, 4 мг, 8 мг, 16 мг или 32 мг.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводятся совместно. В данных случаях доза двух ДНК-конструкций в комбинации составляет от 0,1 до 20 мг, от 1 до 10 мг, от 2 до 8 мг или от 3 до 8 мг на инъекцию. В некоторых воплощениях доза двух ДНК-конструкций в комбинации составляет 0,1 мг, 0,15 мг, 0,2 мг, 0,25 мг, 0,3 мг, 0,35 мг, 0,4 мг, 0,45 мг, 0,5 мг, 1 мг, 2 мг, 4 мг, 8 мг, 16 мг или 32 мг на инъекцию.

Общая доза каждой ДНК-конструкции или обеих ДНК-конструкций в комбинации может вводиться во время одного посещения или на протяжении двух или более чем двух посещений.

В типичных воплощениях с раздельными дозами все из целого ряда инъекционных доз вводятся в пределах 1 часа друг от друга. В некоторых воплощениях все из целого ряда инъекционных доз вводятся в пределах 1,5; 2; 2,5 или 3 часов друг от друга.

В разных воплощениях данных способов общая доза каждой ДНК-конструкции или общая доза двух ДНК-конструкций в комбинации, независимо от того, вводится ли она в виде единичной однократной дозы или разделенной на множество инъекционных доз, вводится субъекту только один раз.

В некоторых воплощениях один цикл может включать введение общей дозы каждой ДНК-конструкции или двух ДНК-конструкций в комбинации в целый ряд инъекционных сайтов на протяжении одного, двух, трех или четырех посещений. Например, один цикл может включать введение 64 мг, 32 мг, 16 мг, 8 мг, 4 мг или 2 мг каждой ДНК-конструкции в целый ряд инъекционных сайтов на протяжении двух посещений. Данные два посещения могут быть разделены 3, 5, 7, 14, 21 или 28 сутками.

В некоторых воплощениях один цикл может включать введение ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и введение ДНК-конструкции, кодирующей HGF, в целый ряд инъекционных сайтов на протяжении одного, двух, трех или четырех посещений. Например, один цикл может включать введение 64 мг, 32 мг, 16 мг, 8 мг, 4 мг или 2 мг ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, в целый ряд инъекционных сайтов и введение 64 мг, 32 мг, 16 мг, 8 мг, 4 мг или 2 мг ДНК-конструкции, кодирующей HGF, в целый ряд инъекционных сайтов на протяжении двух посещений. Данные два посещения могут быть разделены 3, 5, 7, 14, 21 или 28 сутками.

В некоторых воплощениях данный цикл может быть повторен. Данный цикл можно повторять дважды, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз или более.

В некоторых воплощениях данный цикл может быть повторен через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более, чем 12 месяцев после предыдущего цикла.

В некоторых воплощениях общая доза, введенная в последующем цикле, является такой же, как и общая доза, введенная в предыдущем цикле. В некоторых воплощениях общая доза, введенная в последующем цикле, отличается от общей дозы, введенной в предыдущем цикле.

В предпочтительных воплощениях ДНК-конструкция (ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, или ДНК-конструкция, кодирующая HGF) вводится в дозе 8 мг на пораженную конечность, равномерно разделенной на целый ряд внутримышечных инъекций и целый ряд посещений, где каждая из целого ряда инъекций в любое одиночное посещение осуществляется в отдельное место инъекции. В некоторых воплощениях ДНК-конструкция (ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, или ДНК-конструкция, кодирующая HGF) вводится в дозе 8 мг на пораженную конечность, равномерно разделенной на первую дозу в 4 мг на конечность в сутки 0 и вторую дозу в 4 мг на конечность в сутки 14, где каждая из первой и второй дозы равномерно разделяется на целый ряд инъекционных доз.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, и ДНК-конструкция, кодирующая HGF, вводится одновременно или раздельно в общей дозе 16 мг на пораженную конечность, равномерно разделенной на целый ряд внутримышечных инъекий и целый ряд посещений, где каждая из целого ряда инъекий в любое одиночное посещение осуществляется в отдельное место инъекции. В некоторых воплощениях один цикл составляет введение ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, в дозе 8 мг на пораженную конечность и введение ДНК-конструкции, кодирующей HGF, в дозе 8 мг на пораженную конечность. Данный цикл можно повторять один раз, дважды, три раза или более.

Фактическое введенное количество, скорость и динамика введения будут зависеть от природы и тяжести нейропатии, которую лечат. В типичных воплощениях одна или более чем одна ДНК-конструкция вводится в эффективном количестве для уменьшения симптомов нейропатии, например, нейропатической боли. В некоторых воплощениях данное количество является эффективным для уменьшения симптома нейропатии в пределах 1 недели введения. В некоторых воплощениях данное количество является эффективным для уменьшения симптома нейропатии в пределах 2 недель, 3 недель или 4 недель введения.

В некоторых воплощениях вместе вводят два разных типа ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1, или два разных типа ДНК-конструкций, кодирующих HGF. В некоторых воплощениях для индукции экспрессии двух изоформ IGF-1 или HGF доставляется конструкция для двойной экспрессии.

Согласно традиционным методикам, известным специалистам в данной области, данная фармацевтическая композиция может быть приготовлена с фармацевтически приемлемым носителем и/или наполнителем, как описано выше, обеспечивая, наконец, несколько видов стандартной леарственной формы и многодозовой формы. Неограничивающие примеры данных препаратов включают раствор, суспензию или эмульсию в масле или водной среде, экстракт, эликсир, поршок, гранулу, таблетку и капсулу, но не ограничиваются ими, и могут дополнительно содержать диспергирующее средство или стабилизатор.

Для помощи в идентификации оптимальных интервалов дозировки возможно можно использовать анализы in vivo и/или in vitro. Точная доза, подлежащая применению в препарате, также будет зависеть от пути введения, серьезности состояния и должна быть определена согласно решению практика и обстоятельствам каждого субъекта. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных от опытных систем животных моделей in vitro.

Данные ДНК-конструкции могут вводиться сами по себе или в комбинации с другими лечениями, либо одновременно, либо последовательно.

6.3.6. Пациенты с нейропатией

В описанных в данном документе способах выбранные для лечения пациенты имеют нейропатию. Данные пациенты могут иметь периферическую нейропатию, черепную нейропатию, автономную нейропатию или очаговую нейропатию. Нейропатия может быть вызвана заболеваниями, повреждениями, инфекциями или состояниями недостаточности витаминов. Например, нейропатия может быть вызвана диабетом, недостаточностями витаминов, аутоиммунными заболеваниями, генетическими или наследственными расстройствами, амилоидозом, уремией, токсинами или ядами, травмой или повреждением, опухолями или может быть идиопатической. В некоторых воплощениях данные пациенты имеют диабетическую периферическую нейропатию.

Данные пациенты могут иметь один или более чем один симптом, ассоциированный с нейропатией, такой как боль (невропатическая боль), другие сенсорные дефекты (например, потеря ощущения, онемение, покалывание и т.д.), моторные дефекты (например, слабость, потеря рефлексов, потеря мышечной массы, хромание, потеря точных координированных движений и т.д.) и автономная дисфункция (например, тошнота, рвота, импотенция, головокружение, запор, диарея и т.д.).

Данных пациентов можно лечить одним или более чем одним способом лечения, известным в данной области, помимо лечения способом, предложенным в данном документе.

Способы лечения по настоящему изобретению можно использовать для лечения человеческого пацента или животного с нейропатией.

6.3.7. Порядок введения

Описанные в данном документе способы включают стадии введения терапевтически эффективного количества первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, способной экспрессировать человеческую изоформу IGF-1, и введения терапевтически эффективного количества первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, способной экспрессировать человеческую изоформу HGF. Терапевтически эффективное количество представляет собой эффективное количество в лечении данного заболевания в комбинации или индивидуально.

Стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, могут проводиться одновременно или последовательно. В некоторых воплощениях введение первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и введение первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, проводится раздельно, по меньшей мере с интервалом в несколько минут друг от друга, несколько часов друг от друга, один месяц друг от друга, два месяца друг от друга, три месяца друг от друга или шесть месяцев друг от друга. В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, проводится до стадии введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1. В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, проводится до стадии введения первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF.

В некоторых воплощениях стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, или и та, и другая повторяются. В некоторых воплощениях данная стадия повторяется дважды, три раза или более.

Данная первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, может представлять собой любую из ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1, предложенных в данном документе, или ее модификацию. Она может экспрессировать одну или более чем одну изоформу IGF-1. Она может представлять собой ДНК-конструкцию, кодирующую одну изоформу IGF-1: изоформы Еc класса I, (SEQ ID NO 16); Еа класса II (SEQ ID NO 18); Eb класса I (SEQ ID NO 20) или Еа класса I (SEQ ID NO 14). Она может представлять собой ДНК-конструкцию двойной экспрессии, кодирующую две изоформы IGF-1. В некоторых воплощениях данная ДНК-конструкция может кодировать изоформы Еc класса I (SEQ ID NO 16) и Еа класса I (SEQ ID NO 14).

Данная первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, может представлять собой любую из ДНК-конструкций, кодирующих HGF, предложенных в данном документе, или ее модификацию. Она может экспрессировать одну или более чем одну изоформу HGF. Она может представлять собой ДНК-конструкцию, кодирующую одну изоформу HGF: fIHGF (SEQ ID NO 11) или dHGF (SEQ ID NO 12). Она может представлять собой ДНК-конструкцию двойной экспрессии, кодирующую две изоформы HGF. В предпочтительных воплощениях данная ДНК-конструкция содержит полинуклеотид SEQ ID NO 13. Она может представлять собой VM202.

Данный способ может дополнительно включать стадию введения второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1. Данная вторая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, может быть такой же или отличной от первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1. Данная вторая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, может представлять собой любую из ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1, предложенных в данном документе, или ее модификацию. Стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и стадия введения второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, могут осуществляться одновременно или последовательно. В некоторых воплощениях первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, способная экспрессировать Еc класса I (SEQ ID NO 16), и вторая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, способная экспрессировать Еа класса I (SEQ ID NO 14), вводятся одновременно. В некоторых воплощениях введение первой ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, и введение второй ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, проводится раздельно, по меньшей мере с интервалом в несколько минут друг от друга, несколько часов друг от друга, одни сутки друг от друга, двое суток друг от друга, трое суток друг от друга, одна неделя друг от друга, две недели друг от друга, три недели друг от друга, один месяц друг от друга, два месяца друг от друга, три месяца друг от друга или шесть месяцев друг от друга.

Данный способ может дополнительно включать стадию введения второй ДНК-конструкции, кодирующей HGF. Данная вторая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, может быть такой же или отличной от первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF. Данная вторая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, может представлять собой любую из ДНК-конструкций, кодирующих HGF, предложенных в данном документе, или ее модификацию. Стадия введения первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, и стадия введения второй ДНК-конструкции, кодирующей HGF, могут осуществляться одновременно или последовательно. Например, первая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, способная экспрессировать fIHGF (SEQ ID NO 11), и вторая ДНК-конструкция, кодирующая HGF, способная экспрессировать dHGF (SEQ ID NO 12), могут вводиться одновременно. В некоторых воплощениях введение первой ДНК-конструкции, кодирующей HGF, и введение второй ДНК-конструкции, кодирующей HGF, проводится раздельно, по меньшей мере с интервалом в несколько минут друг от друга, несколько часов друг от друга, одни сутки друг от друга, двое суток друг от друга, трое суток друг от друга, одна неделя друг от друга, две недели друг от друга, три недели друг от друга, один месяц друг от друга, два месяца друг от друга, три месяца друг от друга или шесть месяцев друг от друга.

В некоторых воплощениях данный способ включает введение VM202 наряду с pCK-IGF-1X6 или pCK-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данный способ включает введение другой ДНК-конструкции, кодирующей HGF (например, конструкции, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO 33), наряду с pCK-IGF-1X6 или pCK-IGF-1X10.

В некоторых воплощениях данный способ включает введение VM202, наряду с pTx-IGF-1X6 или pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данный способ включает введение другой ДНК-конструкции, кодирующей HGF (например, конструкции, содержащей полинуклеотид SEQ ID NO 33), наряду с pTx-IGF-1X6 или pTx-IGF-1X10.

В некоторых воплощениях данный способ включает введение VM202 с последующим введением pCK-IGF-1X6 или pCK-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данный способ включает введение другой ДНК-конструкции, кодирующей HGF (например, pCK-HGF₇₂₈, которая представляет собой конструкцию, содержащую полинуклеотид SEQ ID NO 33), с последующим введением pCK-IGF-1X6 или pCK-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данный способ включает введение pCK-IGF-1X6 или pCK-IGF-1X10 с последующим введением VM202 или другой ДНК-конструкции, кодирующей HGF (например, рСK-HGF₇₂₈).

В некоторых воплощениях данный способ включает введение VM202 с последующим введением pTx-IGF-1X6 или pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данный способ включает введение другой ДНК-конструкции, кодирующей HGF (например, pCK-HGF₇₂₈, которая представляет собой конструкцию, содержащую полинуклеотид SEQ ID NO 33), с последующим введением pTx-IGF-1X6 или pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данный способ включает введение pTx-IGF-1X6 или pTx-IGF-1X10 с последующим введением VM202 или другой ДНК-конструкции, кодирующей HGF (например, рСK-HGF₇₂₈).

6.4. Фармацевтическая композиция, содержащая ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1, и ДНК-конструкцию, кодирующую HGF-1

В другом аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1, и ДНК-конструкцию, кодирующую HGF.

6.4.1. Фармацевтические композиции и стандартные лекарственные формы, адаптированные для инъекции

Для внутривенной, внутримышечной, внутрикожной или подкожной инъекции ДНК-конструкция может находиться в форме парентерально приемлемого водного раствора, который является непирогенным и имеет подходящий рН, изотоничность и стабильность. Специалисты релевантной квалификации в данной области легко способны готовить подходящие растворы с использованием, например, изотоничных носителей, таких как инъекционный раствор хлорида натрия, инъекционный раствор Рингера, инъекционный раствор Рингера с лактатом. Могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки по потребности.

В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит ДНК-конструкцию, кодирующую одну изоформу IGF-1. Например, данная ДНК-конструкция может экспрессировать изоформу Еc класса I (изоформа №1); изоформу Еа класса II (изоформа №2); изоформу Еb класса I (изоформа №3) или изоформу Еа класса I (изоформа №4). Данные ДНК-конструкции могут представлять собой pCK-IGF-1#1, pCK-IGF-1#2, pCK-IGF-1#3 или pCK-IGF-1#4. В некоторых воплощениях данные ДНК-конструкции могут представлять собой рТх-IGF-1#1, pTx-IGF-1#2, pTx-IGF-1#3 или pTx-IGF-1#4.

В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит более чем одну ДНК-конструкцию, причем каждая кодирует одну изоформу IGF-1. Например, данная фармацевтическая композиция может содержать (i) первую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еc класса I (изоформа №1) и вторую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еа класса II (изоформа №2); (ii) первую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еc класса I (изоформа №1) и вторую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еb класса I (изоформа №3); (iii) первую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еc класса I (изоформа №1) и вторую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еа класса I (изоформа №4); (iv) первую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еа класса II (изоформа №2) и вторую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еb класса I (изоформа №3); (v) первую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еа класса II (изоформа №2) и вторую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еа класса I (изоформа №4); (vi) первую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еb класса I (изоформа №3) и вторую ДНК-конструкцию, кодирующую изоформу Еа класса I (изоформа №4).

В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит конструкцию двойной экспрессии, причем ДНК-конструкция может экспрессировать более чем одну изоформу IGF-1. Например, данная фармацевтическая композиция может содержать конструкцию двойной экспрессии, которая может экспрессировать (i) изоформу Еc класса I (изоформа №1) и изоформу Еа класса II (изоформа №2); (ii) изоформу Еc класса I (изоформа №1) и изоформу Еb класса I (изоформа №3); (iii) изоформу Еc класса I (изоформа №1) и изоформу Еа класса I (изоформа №4); (iv) изоформу Еа класса II (изоформа №2) и изоформу Еb класса I (изоформа №3); (v) изоформу Еа класса II (изоформа №2) и изоформу Еа класса I (изоформа №4); (vi) изоформу Еb класса I (изоформа №3) и изоформу Еа класса I (изоформа №4).

В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит конструкцию двойной экспрессии: pCK-IGF-1X6 или pCK-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит конструкцию двойной экспрессии: pTx-IGF-1X6 или pTx-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит две конструкции двойной экспрессии, например, включающие и pCK-IGF-1X6, и pCK-IGF-1X10. В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит две конструкции двойной экспрессии, например, включающие и pTx-IGF-1X6, и pTx-IGF-1X10.

В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция дополнительно содержит ДНК-конструкцию, кодирующую одну изоформу HGF. Например, данная ДНК-конструкция может экспрессировать fIHGF или dHGF. В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит более чем одну ДНК-конструкцию, причем каждая кодирует одну изоформу HGF. Например, данная фармацевтическая композиция может содержать первую ДНК-конструкцию, кодирующую fIHGF, и вторую ДНК-конструкцию, кодирующую dHGF.

В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит конструкцию двойной экспрессии - ДНК-конструкцию, которая может экспрессировать более чем одну изоформу HGF. Например, данная фармацевтическая композиция может содержать конструкцию двойной экспрессии, которая может экспрессировать и fIHGF, и dHGF.

В предпочтительных воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит конструкцию двойной экспрессии - pCK-HGF-X7 (VM202). В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит две ДНК-конструкции, кодирующих HGF, причем каждая кодирует fIHGF или dHGF. В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция содержит одну ДНК-конструкцию, кодирующую HGF, способную экспрессировать fIHGF (рСK-HGF₇₂₈).

В некоторых воплощениях данная фармацевтическая композиция дополнительно содержит другое терапевтическое средство. Например, данная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другое эффективное в лечение нейропатии терапевтическое средство.

В разных воплощениях одна или более чем одна ДНК-конструкция присутствует в жидкой композиции в концентрации 0,01 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,45 мг/мл, 0,5 мг/мл или 1 мг/мл, индивидуально или в комбинации. В некоторых воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой флакон, содержащий 2 мл фармацевтической композиции с одной или более чем одной ДНК-конструкцией в концентрации 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл или 1 мг/мл, индивидуально или в комбинации. В некоторых воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой флакон, содержащий 1 мл фармацевтической композиции с одной или более чем одной ДНК-конструкцией в концентрации 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл или 1 мг/мл, индивидуально или в комбинации. В некоторых воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой флакон, содержащий меньше, чем 1 мл фармацевтической композиции с одной или более чем одной ДНК-конструкцией в концентрации 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл или 1 мг/мл, индивидуально или в комбинации.

В некоторых воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой флакон, ампулу, бутыль или предварительно заполненный шприц. В некоторых воплощениях стандартная лекарственная форма содержит 0,01 мг, 0,1 мг, 0,2 мг, 0,25 мг, 0,5 мг, 1 мг, 2,5 мг, 5 мг, 8 мг, 10 мг, 12,5 мг, 16 мг, 24 мг, 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг или 200 мг одной или более чем одной ДНК-конструкции по настоящему изобретению.

В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция в стандартной лекарственной форме находится в жидкой форме. В разных воплощениях стандартная лекарственная форма содержит от 0,1 мл до 50 мл фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях стандартная лекарственная форма содержит 0,25 мл, 0,5 мл, 1 мл, 2,5 мл, 5 мл, 7,5 мл, 10 мл, 25 мл или 50 мл фармацевтической композиции.

В конкретных воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой флакон, содержащий 0,5 мл, 1 мл, 1,5 мл или 2 мл фармацевтической композиции, в подходящих воплощениях стандартной лекарственной формы для подкожного, внутрикожного или внутримышечного введения, включая предварительно загруженные шприцы, аутоинъекторы и аутоинъекционные шприцы-ручки, причем каждый содержит заданное количество фармацевтической композиции, описанной в данном документе выше.

В разных воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой предварительно заполенный шприц, включающий шприц и заданное количество фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях предварительно заполенного шприца данный шприц приспособлен для подкожного введения. В некоторых воплощениях данный шприц подходит для самостоятельного введения. В конкретных воплощениях предварительно заполненный шприц представляет собой одноразовый шприц.

В разных воплощениях предварительно заполненный шприц содержит от примерно 0,1 мл до примерно 0,5 мл фармацевтической композиции. В некоторых воплощениях данный шприц содержит примерно 0,5 мл фармацевтической композиции. В конкретных воплощениях данный шприц содержит примерно 1,0 мл фармацевтической композиции. В конкретных воплощениях данный шприц содержит примерно 2,0 мл фармацевтической композиции.

В некоторых воплощениях стандартная лекарственная форма представляет собой шприц-ручку для автоинъекции. Данная шприц-ручка для автоинъекции включает шприц-ручку для автоинъекции, содержащую фармацевтическую композицию, как описано в данном документе. В некоторых воплощениях данная шприц-ручка для автоинъекции доставляет заданный объем фармацевтической композиции. В других воплощениях данная шприц-ручка для автоинъекции сконфигурирована для доставки установленного пользователем объема фармацевтической композиции.

В разных воплощениях данная шприц-ручка для автоинъекции содержит от примерно 0,1 мл до примерно 5,0 мл фармацевтической композиции. В конкретных воплощениях данная шприц-ручка для автоинъекции содержит примерно 0,5 мл фармацевтической композиции. В конкретных воплощениях данная шприц-ручка для автоинъекции содержит примерно 1,0 мл фармацевтической композиции. В других воплощениях данная шприц-ручка для автоинъекции содержит примерно 5,0 мл фармацевтической композиции.

6.4.2. Лиофилизированные препараты ДНК

В некоторых воплощениях ДНК-конструкции по настоящему изобретению приготовлены в виде лиофилизированной композиции. В конкретных воплощениях ДНК-конструкции лиофилизируют, как описано в патенте США №8389492, включенном в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

В некоторых воплощениях ДНК-конструкции готовят с некоторыми эксципиентами, например, углеводом и солью, перед лиофилизацией. Стабильность ДНК-конструкции, подлежащей применению в качестве диагностического или терапевтического средства, может быть увеличена посредством приготовления данной ДНК-конструкции перед лиофилизацией с водным раствором, содержащим стабилизирующее количество углевода.

Данный углевод может представлять собой моно-, олиго- или полисахарид, такой как сахароза, глюкоза, лактоза, трегалоза, арабиноза, пентоза, рибоза, ксилоза, галактоза, гексоза, идоза, манноза, талоза, гептоза, фруктоза, глюконовая кислота, сорбит, маннит, метил-α-глюкопиранозид, мальтоза, изоаскорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, лактон, сорбоза, глюкаровая кислота, эритроза, треоза, аллоза, альтроза, гулоза, эритрулоза, рибулоза, ксилулоза, псикоза, тагатоза, глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота, маннуроновая кислота, глюкозамин, галактозамин, нейраминовая кислота, арабинаны, фруктаны, фуканы, галактаны, галактуронаны, глюканы, маннаны, ксиланы, леван, фукоидан, каррагенан, галактокаролоза, пектины, пектиновые кислоты, амилоза, пуллулан, гликоген, амилопектин, целлюлоза, декстран, циклодекстрин, пустулан, хитин, агароза, кератин, хондроитин, дерматан, гиалуроновая кислота, альгиновая кислота, ксантановая камедь или крахмал.

В одной серии воплощений данный углевод представляет собой маннит или сахарозу.

Раствор углевода перед лиофилизацией может соответствовать углеводу в одной воде, или может быть включен буфер. Примеры таких буферов включают PBS (от англ. phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буферный раствор), HEPES (от англ. (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), TRIS или TRIS/EDTA (от англ. Ethylenediaminetetraacetic acid - этилендиаминтетрауксусная кислота). Типично раствор углевода объединяют с ДНК-конструкцией до конечной концентрации от примерно 0,05% до примерно 30% сахарозы, типично от 0,1% до примерно 15% сахарозы, как, например, от 0,2% до примерно 5%, 10% или 15% сахарозы, предпочтительно примерно от 0,5% до 10% сахарозы, от 1% до 5% сахарозы, от 1% до 3% сахарозы и наиболее предпочтително примерно 1,1% сахарозы.

Препарат ДНК по данному изобретению также может включать соль, например, NaCl или KCl. В некоторых воплощениях данная соль представляет собой NaCl. В некоторых воплощениях соль препарата ДНК находится в количестве, выбранном из группы, состоящей из от примерно 0,001% до примерно 10%, примерно от 0,1% до 5%, примерно от 0,1% до 4%, примерно от 0,5% до 2%, примерно от 0,8% до 1,5%, примерно от 0,8% до 1,2 масс/об. %. В некоторых воплощениях соль препарата ДНК находится в количестве примерно 0,9 масс/об. %.

Конечная концентрация одной или более чем одной ДНК-конструкции в жидких композициях, растворенных из лиофилизированных препаратов, может составлять от примерно 1 нг/мл до примерно 30 мг/мл. Например, конечная концентрация может составлять примерно 1 нг/мл, примерно 5 нг/мл, примерно 10 нг/мл, примерно 50 нг/мл, примерно 100 нг/мл, примерно 200 нг/мл, примерно 500 нг/мл, примерно 1 мкг/мл, примерно 5 мкг/мл, примерно 10 мкг/мл, примерно 50 мкг/мл, примерно 100 мкг/мл, примерно 200 мкг/мл, примерно 400 мкг/мл, примерно 500 мкг/мл, примерно 600 мкг/мл, примерно 800 мкг/мл, примерно 1 мг/мл, примерно 2 мг/мл, примерно 2,5 мг/мл, примерно 3 мг/мл, примерно 3,5 мг/мл, примерно 4 мг/мл, примерно 4,5 мг/мл, примерно 5 мг/мл, примерно 5,5 мг/мл, примерно 6 мг/мл, примерно 7 мг/мл, примерно 8 мг/мл, примерно 9 мг/мл, примерно 10 мг/мл, примерно 20 мг/мл или примерно 30 мг/мл, индивидуально или в комбинации. В некоторых воплощениях данного изобретения конечная концентрация одной или более чем одной ДНК-конструкции составляет от примерно 100 мкг/мл до примерно 2,5 мг/мл индивидуально или в комбинации. В конкретных воплощениях изобретения конечная концентрация одной или более чем одной ДНК-конструкции составляет от примерно 0,5 мг/мл до 1 мг/мл индивидуально или в комбинации.

Препарат ДНК по изобретению лиофилизируют при стандартных условиях, известных в данной области. Способ лиофилизации препарата ДНК по изобретению может включать (а) загрузку контейнера (например, флакона) с препаратом ДНК (например, препаратом ДНК, содержащим одну или более чем одну ДНК-конструкцию по настоящему изобретению), солью и углеводом в лиофилизатор, где данный лиофилизатор имеет исходную температуру от примерно 5°С до примерно -50°С; (b) охлаждение препарата ДНК до температур ниже нуля (например, от -10°С до -50°С); и (с) существенную сушку ДНК-препарата. Условия для лиофилизации, например, температуру и продолжительность, препарата ДНК по изобретению может корректировать обычный специалист в данной области, принимая во внимание факторы, которые влияют на параметры лиофилизации, например, используемый тип лиофилизатора, используемое количество ДНК и используемый размер контейнера.

Контейнер, содержащий лиофилизированный препарат ДНК, можно затем запечатывать и хранить в течение длительного периода времени при разных температурах (например, от комнатной температуры до примерно -180°С, предпочтительно от примерно 2-8°С до примерно -80°С, более предпочтительно от примерно -20°С до примерно -80°С и наиболее предпочтительно - примерно -20°С). В некоторых аспектах данные лиофилизированные препараты ДНК предпочтительно являются стабильными в пределах интервала от примерно 2-8°С до примерно -80°С в течение периода по меньшей мере 6 месяцев без потери значительной активности. Препарат плазмидной ДНК стабильного хранения также может соответствовать хранению плазмидной ДНК в стабильной форме в течение длительных периодов времени перед применением в качестве таковых для исследования или терапии на основе плазмиды. Срок хранения может составлять до нескольких месяцев, 1 года, 5 лет, 10 лет, 15 лет или вплоть до 20 лет. Предпочтительно данный препарат является стабильным в течение периода по меньшей мере примерно 3 лет.

6.5. Наборы для комбинированной терапии

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен набор для комбинированной терапии с ДНК-конструкцией, кодирующей IGF-1, и ДНК-конструкцией, кодирующей HGF.

Данный набор может содержать первую фармацевтическую композицию, содержащую ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1, и вторую фармацевтическую композицию, содержащую ДНК-конструкцию, кодирующую HGF. В некоторых воплощениях первая фармацевтическая композиция и вторая фармацевтическая композиция представляют собой ту же самую фармацевтическую композицию в одном контейнере. В некоторых воплощениях первая фармацевтическая композиция и вторая фармацевтическая композиция представляют собой отдельные фармацевтические композиции в двух или более чем двух отдельных контейнерах.

Данная первая фармацевтическая композиция может содержать любую предложенную в данном документе ДНК-конструкцию, кодирующую IGF-1. Например, данная ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, может представлять собой ДНК-конструкцию одиночной экспрессии, способную экспрессировать одну изоформу IGF-1, или ДНК-конструкцию двойной экспрессии, экспресирующую две изоформы IGF-1. Вторая фармацевтическая композиция может содержать любую предложенную в данном документе ДНК-конструкцию, кодирующую HGF. Например, данная ДНК-конструкция, кодирующая HGF, может представлять собой ДНК-конструкцию одиночной экспрессии, способную экспрессировать одну изоформу HGF, или ДНК-конструкцию двойной экспрессии, экспресирующую две изоформы HGF.

Данный набор может содержать одну или более чем одну разовую дозу ДНК-конструкции, кодирущей IGF-1, ДНК-конструкции, кодирущей HGF, или и той, и другой.

Данный набор может дополнительно содержать инструкцию, объясняющую способ введения ДНК-конструкции, кодирущей IGF-1, ДНК-конструкции, кодирущей HGF, или и той, и другой. Данный способ может представлять собой любой из способов введения, предложенный в данном документе.

6.6. Примеры

Следующие примеры используются таким образом, чтобы предоставлять обычным специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как сделать и применять настоящее изобретение, и не предназначены ни для того, чтобы ограничивать объем того, что авторы данного изобретения рассматривают как их изобретение, ни для того, чтобы представлять, что описанные ниже эксперименты представляют собой все или единственные проведенные эксперименты. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части представляют собой части по массе, молекулярные массы представляют собой среднемассовую молекулярную массу, температура приводится в градусах Цельсия, и давление является атмосферным или околоатмосферным. Можно использовать стандартные сокращения, например, п. н. - пара(ры) нукпеотидов; т.п.н. - тысяча(чи) пар нукпеотидов; пл - пиколитр; с - секунда(ды); мин - минута(ты); ч - час(сы); ак - аминокислота(ты); нт - нукпеотид(ды) и тому подобные.

В воплощении на практике настоящего изобретения будут применяться, если не указано иное, традиционные способы белковой химии, биохимии, методики генной инженерии и фармакологии, находящиеся в пределах квалификации в данной области.

6.6.1. Пример 1: терапевтическая эффективность совместного введения ДНК-конструкций, кодирущих IGF-1, и ДНК-конструкции, кодирущей HGF, в мышиной модели нейропатии CCI

Терапевтические эффекты совместного введения конструкции, кодирующей IGF-1, и конструкции, кодирующей HGF, анализировали в модели хронического компрессионного повреждения (CCI) у мышей, которая представляет собой широко принятую модель для исследования нейропатии. Мышиную модель CCI получали посредством хронического компрессионного повреждения (CCI) седалищного нерва, которое, как известно, инициирует несколько процессов, которые приводят к хроническому повреждению нервов на периферии. Также известно, что мыши CCI имеют невропатическую боль.

В частности, покупали 4-недельных самцов мышей ICR (с массой тела от 24 до 26 г) и использовали для получения модели CCI и анализа эффектов. Все хирургические и экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных в Сеульском национальном университете. Для осуществления CCI у мышей, у них делали тупые диссекции примерно 1 см длины для экспонирования правого седалищного нерва, который обычно находится между ягодичной мышцей и двуглавой мышцей бедра. Как только экспонировался седалищный нерв рядом с местом разделения на три ветви, на него три раза накладывали слабые лигатуры на расстоянии 0,5 мм друг от друга с использованием шелковых нитей 6-0 (Ethicon). Данные лигатуры слегка подтягивали, пока не было заметной судороги правой задней конечности. Ложнооперированным мышам делали такие же диссекции в правом бедре, но они не получали лигатур на седалищном нерве.

В сутки CCI внутримышечно инъецировали суммарно 200 мкг ДНК-конструкций, и измеряли болевую чувствительность в отношении механических стимулов посредством нити фон Фрея. Типы и количества ДНК-конструкций, инъецированных каждой группе, обобщаются ниже в ТАБЛИЦЕ 1.

Каждая группа состояла из 6 мышей, и проводили больше, чем 2 независимых эксперимента (среднее плюс/минус стандартная ошибка среднего (SEM - от англ. standard error mean); * - р меньше 0,05, ** - р меньше 0,01, *** - р меньше 0,001).

В ТАБЛИЦЕ 1 pCK-IGF-1#1, pCK-IGF-1#2, pCK-IGF-1#3 и pCK-IGF-1#4 представляют собой ДНК-конструкции, кодирующие индивидуальную человеческую изоформу IGF-1, клонированную в вектор рСK. Данные ДНК-конструкции конструировали в векторе рСK с использованием стандартных методик молекулярного клонирования. В частности, получали четыре полинуклеотида (SEQ ID NO: 15, 17, 19 и 21) посредством кастомизированного способа синтеза ДНК, обеспечиваемого Bioneer (Корея). Данные полинукпетиды синтезировали с 5'-линкером, Cla I и 3'-линкером, Sal I. Вектор рСK и полинуклеотиды подвергали рестрикции Cla I и Sal I. IGF-1 №1, кодирующую Еc класса I (изоформа №1) получали вставкой полинуклеотида SEQ ID NO 17, который представляет собой кодирующую последовательность изоформы Еc класса I и содержит по меньшей мере часть экзонов 1, 3/4, 5 и 6 гена IGF-1, в сайт клонирования вектора рСK. IGF-1 №2, кодирующую Еа класса II (изоформа №2) получали вставкой полинуклеотида SEQ ID NO 19, который представляет собой кодирующую последовательность изоформы Еа класса II и содержит по меньшей мере часть экзонов 2, 3/4 и 6 гена IGF-1, в сайт клонирования вектора рСK. IGF-1 №3, кодирующую Еb класса I (изоформа №3) получали вставкой полинуклеотида SEQ ID NO 21, который представляет собой кодирующую последовательность изоформы Еb класса I и содержит по меньшей мере часть экзонов 1, 3/4 и 5 гена IGF-1, в сайт клонирования вектора рСK. IGF-1 №4, кодирующую Еа класса I (изоформа №4) получали вставкой полинуклеотида SEQ ID NO 15, и содержит по меньшей мере часть экзонов 1, 3/4 и 6, в сайт клонирования вектора рСK. Экспрессию каждой изоформы IGF-1 от каждой плазмиды анализировали и подтверждали как in vitro, так и in vivo.

Через одну неделю после хирургии CCI и введения ДНК-конструкций оценивали развитие механической аллодинии с использованием нити фон Фрея, и симптомы боли оценивали еженедельно, как приводится на Фиг. 2А. Анализ с нитью фон Фрея проводили для измерения механической чувствительности мышей. Вкратце, животных индивидуально помещали в цилиндр над полом из металлической сетки для адаптации. Частоту механической чувствительности мышей оценивали посредством стимулирования задней лапы с использованием постоянной толщины нити (калибр 0,16).

Фиг. 2В представляет собой график, обобщающий частоту (%) отдергивания лапы, измеренную в эксперименте CCI, описанном на Фиг. 2А. Частота (%)Фиг. 2В представляет собой среднее измерений, сделанных в 1 неделю - 4 недели после хирургии CCI. Данный результат демонстрирует то, что инъекция одной VM202 или VM202 в комбинации с разными ДНК-конструкциями, кодирующими IGF-1, обеспечивает значимое снижение частоты отдергивания лапы по сравнению с одним вектором (рСK). Кроме того, инъекция VM202 в комбинации с pCK-IGF-1#1 или pCK-IGF-1#4 (т.е. ДНК-конструкция, способная экспрессировать изоформу №1 IGF-1 или изоформу №4 IGF-1) обеспечивала более значительное снижение, чем инъекция одного VM202 или VM202 в комбинации с IGF-1#2 или IGF-1#3. Данные свидетельствуют о том, что изоформа №1 IGF (Еc класса I) и изоформа №4 IGF (Еа класса I) являются особенно эффективными в лечении нейропатии при введении совместно с VM202.

IGF-1#1 и IGF-1#4, которые оказались самыми эффективными в данных, приведенных на Фиг. 2 В, анализировали далее для того, чтобы понять, могут ли быть усилены их эффекты при совместном введении. В частности, 50 мкг IGF-1 #1 и 50 мкг IGF-1#4 вводили мышам CCI совместно с VM202, и частоту отдергивания их лапы измеряли, как обобщено на Фиг. ЗА. Результат (среднее от 1 недели до 4 недель), приведенный на Фиг. ЗВ, демонстрирует то, что инъекция VM202 в комбинации как с pCK-IGF-1#1, так и с pCK-IGF-1#4 давала даже более значительное уменьшение частоты отдергивания лапы по сравнению с VM202 в комбинации с одним pCK-IGF-1#1 или с VM202 в комбинации с одним pCK-IGF-1#4. Данные свидетельстуют о том, что изоформа №1 IGF (Еc класса I) или изоформа №4 IGF (Еа класса I) в комбинации имеют даже большую терапевтическую эффективность при введении совместно с VM202.

6.6.2. Пример 2: терапевтическая эффективность серийного введения ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1, и ДНК-конструкции, кодирующей HGF, в мышиной модели нейропатии CCI

CCI нейропатию мышей получали, как приводится в Примере 1, и их делили на семь групп, как приводится в ТАБЛИЦЕ 2. Суммарно 200 мкг ДНК-конструкций внутримышечно инъецировали мышам CCI в сутки хирургии CCI (1-ая инъекция), а другую инъекцию осуществляли в неделю 3 (2-ая инъекция). ДНК-конструкции, введенные в 1-ую инъекцию и 2-ую инъекцию для каждой группы, обобщаются ниже в ТАБЛИЦЕ 2. Каждая группа состояла из 6 мышей, и проводили больше, чем 2 независимых эксперимента (среднее плюс/минус SEM (стандартная ошибка среднего); * - р меньше 0,05; ** - р меньше 0,01; *** - р меньше 0,001).

Терапевтические эффекты данных инъекций анализировали посредством измерения механической аллодинии на еженедельной основе посредством анализа с нитями фон Фрея на протяжении всего эксперимента. Экспериментальная методика обобщается на Фиг. 4А. Вкратце, животных индивидуально помещали в цилиндр над полом из металлической сетки для адаптации. Частоту механической чувствительности мышей оценивали посредством стимулирования задней лапы с использованием постоянной толщины нити (калибр 0,16). Данный анализ затем повторяли еженедельно.

Результаты обобщаются на Фиг. 4В, предоставляя частоту (%) отдергивания лапы, измеренную в каждой группе на еженедельной основе. Данный результат подтверждает то, что инъекция ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1 (т.е. IGF-1 #1 и IGF-1#4), или инъекция ДНК-конструкции, кодирующей HGF (т.е. VM202), обеспечивает значительное уменьшение частоты отдергивания лапы по сравнению с одним вектором (рСK). Кроме того, продемонстрировали то, что инъекция ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1 (т.е. IGF-1#1 и IGF-1 #4), после инъекции ДНК-конструкции, кодирующей HGF (т.е. VM202) дополнительно уменьшает частоту отдергивания лапы (VM202 -> изоформы IGF). Это дополнительное снижение посредством 2-ой инъекции не наблюдали в группе, где IGF-1#1 и IGF-1#4 инъецировали до 2-ой инъекции VM202 (изоформы IGF -> VM202) или VM202 инъецировали перед 2-ой инъекцией VM202 (VM202 -> VM202). Следовательно, инъекция VM202 с последующей инъекцией IGF-1#1 и IGF-1#4 (VM202 -> изоформы IGF) давала самое значительное уменьшение частоты отдергивания лапы.

6.6.3. Пример 3: ДНК-конструкции, способные экспрессировать и изоформу №1 IGF-1 (Еc класса I), и изоформу №4 (Еа класса I)

Поскольку первая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, экспрессирующая IGF-1 Еc класса I (IGF-1#1) и вторая ДНК-конструкция, кодирующая IGF-1, экспрессирующая Еа класса I (IGF-1#4) совместно имели статистически значимо большую способность уменьшать механическую аллодинию в поведенческих экспериментах, описанных выше, авторы данного изобретения сконструировали несколько плазмид, разработанных для одновременной экспрессии обеих изоформ IGF-1 - Еc класса I (изоформа №1) и Еа класса I (изоформа №4), через альтернативный сплайсинг РНК-транскрипта. В частности, ДНК-конструкции получали так, чтобы они содержали последовательности экзонов 1, 3/4, 5 и 6, и интронов гена IGF-1 или их фрагменты. Несколько ДНК-конструкций, включая разные вариации, получали и анализировали на их способность экспрессировать и изоформу IGF-1 Еc класса I (изоформа №1), и изоформу Еа класса I (изоформа №4).

Каждую плазмиду конструировали с использованием рСK в качестве остова плазмиды так, чтобы она содержала вставку, связанную функциональным образом с контрольными последовательностями экспрессии рСK. Данную вставку создавали посредством объединения (1) первого полинуклеотида, кодирующего экзоны 1, 3 и 4 человеческого IGF-1 (SEQ ID NO 1); (2) второго полинуклеотида, кодирующего либо интрон 4 IGF-1 (SEQ ID NO 2), либо его фрагмент; (3) третьего полинуклеотида, кодирующего экзоны 5 и 6-1 (SEQ ID NO 3); (4) четвертого полинуклеотида, кодирующего либо интрон 5 (SEQ ID NO 4), либо его фрагмент; и (5) пятого полинуклеотид, кодирующего экзон 6-2 (SEQ ID NO 5), в которой первый полинуклеотид, второй полинуклеотид, третий полинуклеотид, четвертый полинуклеотид и пятый полинуклеотид были связаны с последовательном порядке от 5' к 3'. Данные плазмиды отличались по размеру фрагмента интрона 4 и/или интрона 5. В частности, SEQ ID NO 6 дает нукпеотидную последовательность фрагмента интрона 4, используемого в векторе pCK-IGF-1X6, и SEQ ID NO 7 дает нукпеотидную последовательность фрагмента интрона 4, используемого в векторе pCK-IGF-1-X10. SEQ ID NO 8 дает нукпеотидную последовательность фрагмента интрона 5, используемого в векторе pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF1X10.

Для анализа экспрессии изоформы №1 (Еc класса I) и изоформы №4 (Еа класса I) от разных конструкций in vivo, 9-месячным самцам мышей C57BL/6 инъецировали 50 мкг плазмиды в их мышцу Т.А. (передняя большеберцовая мышца). Их скелетные мышцы ТА получали через 5 суток после инъекции. Данные скелетные мышцы затем гомогенизировали в лизисном буфере, содержащем ингибитор протеазы, смесь ингибиторов фосфатаз (Roche Diagnostic Ltd.) и PMSF (фенилметилсульфонилфторид) (Sigma), с использованием полипропиленовых пестиков (Bel-Art Scienceware). Данные образцы центрифугировали при 12000 об./мин в течение 15 минут при 4°С, и супернатанты, содержащие общий белок, подвергали ИФА на человеческий IGF-1 (R&D Systems), как изложено в протоколе изготовителя. Выявленный уровень IGF-1 нормировали к общему количеству белковых экстрактов из ткани при измерении посредством набора для анализа белка ВСА (Thermo, IL, США). Данная экспериментальная процедура обобщается на Фиг. 5А.

Как показано на Фиг. 5Б, посредством ИФА был определен общий уровень экспрессии человеческих белков IGF-1 в мышиной мышце Т.А. Независимо от того, получала ли мышь 50 мкг конструкции, экспрессирующей одну изоформу («1» (Еc класса I) или «4» (Еа класса I)), 25 мкг первой конструкции, экспрессирующей изоформу №1 (Еc класса I), плюс 25 мкг второй конструкции, экспрессирующей изоформу №4 (Еа класса I) («1+4»), или 50 мкг одной из конструкций, экспрессирующих обе изоформы - pCK-IGF-1X6 («Х6») или pCK-IGF-1X10 («Х10»), общие уровни экспрессии белка - человеческого IGF-1 - были аналогичными.

Авторы данного изобретения использовали ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) для определения того, экспрессировали ли данные конструкции зрелые транскрипты и для изоформы №1, и для изоформы №4 одновременно. Реакции ПЦР-ОТ проводили с прямым праймером (F), который связывается с экзоном 3/4, и обратным праймером (R), который связывается с экзоном 6. Как дополнительно объясняется на Фиг. 6А, ПЦР-ОТ транскрипта изоформы №1 (Еc класса I) генерировала бы два ампликона - ампликон из 178 п. н. и ампликон из 259 п. н., тогда как ПЦР-ОТ транскрипта изоформы №4 (Еа класса I) генерировала бы один ампликон из 129 п.н.

Для ПЦР-ОТ отбирали скелетные мышцы, механически гомогенизировали с использованием полипропиленовых пестиков (Bel-Art Scienceware) и экстрагировали в RNAiso plus (Takara). Количественное измерение РНК осуществляли с использованием прибора nanodrop. Для синтеза кДНК использовали равные количества РНК с использованием обратной транскриптазы XL (AMV) (Takara), и ПЦР проводили с использованием прямого (TGA ТСТ AAG GAG GCT GGA) (SEQ ID NO 40) и обратного (СТА СТТ GCG ТТС ТТС AAA TG) (SEQ ID. NO: 41) праймеров, показанных на Фиг. 6А.

Как проиллюстрировано на Фиг. 6В, pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10 экспрессировали зрелые транскрипты как для изоформы №1 (полосы 178 п. н. и 259 п. н.), так и для изоформы №4 (полоса 129 п.н.). Экспрессию зрелых транскриптов как для изоформы №1, так и для изоформы №4 не выявляли от конструкций, отличных от pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10, причем эти данные не приводятся в данном документе.

Для того чтобы подтвердить то, что оба транскрипта двух данных изоформ эффективно транслировались в белок, авторы данного изобретения трансфицировали клетки 293Т pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10, как проиллюстрировано на Фиг. 7А. Для иммуноблоттинга клетки получали через 2 суток (48 часов) после трансфекции плазмидной ДНК, с последующим лизисом с использованием буфера RIPA со смесью ингибиторов протеазы и фосфатазы (Roche Diagnostic Ltd.). Равные количества белка разделяли на 10%-ном SDS полиакриламидном геле (от англ. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel -полиакриламидный гель в присутствии додецилсульфата натрия) и переносили на мембрану для вестерн-блоттинга (PVDF - от англ. polyvinylidenfluoride - поливинилиденфторид). Данную мембрану блокировали 1% BSA (от англ. bovine serum albumin - бычий сывороточный альбумин) (Invitrogen-Gibco) в смеси трис-забуференного физиологического раствора и полисорбата 20 (TBST - от англ. tris-buffered saline (TBS) and Polysorbate 20 (Tween 20)) (20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% NaCl и 0,1% Tween 20) в течение 1 часа и зондировали с использованием первичных антител, разведенных в блокирующем растворе, при 4°С в течение ночи. Первичные антитела, используемые для проверки уровня изоформы 1 и изоформы 4 IGF-1, были предоставлены Abclon (Корея), а антитела для IGF-1 и β-актина были приобретены у Abeam (Великобритания) и Sigma-Aldrich (США). После промывки TBST мембраны инкубировали с конъюгированным с HRP (от англ. horseradish peroxidase - пероксидаза хрена) вторичным антителом козы против мышиного или кроличьего IgG (Sigma) при комнатной температуре в течение 1 часа. Блоты затем три раза промывали TBST, и полосы белка визуализировали с использованием системы усиленной хемилюминисценции (Millipore). β-актин использовали в качестве контроля загрузки.

Данные вестерн-блоттинга, показанные на Фиг. 7 В, подтверждают то, что плазмиды pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10 экспрессируют обе изоформы IGF-1 на уровне белка.

6.6.4. Пример 4: терапевтическая эффективность совместного введения ДНК-конструкций, кодирующих HGF (VM202), и ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, экспрессирующей как изоформу №1 (Еc класса I), так и изоформу №4 (Еа класса I) IGF-1 в мышиной модели CCI нейропатии

Как обсуждалось выше в Примерах 1 и 2, одновременное или серийное введение VM202 и ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1 - pCK-IGF-1#1 и pCK-IGF-1#4, (т.е. ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, способной экспрессировать изоформу №1 IGF-1 или изоформу №4 IGF-1), обеспечивало значимое уменьшение механической аллодинии в мышиной модели CCI нейропатии.

Авторы данного изобретения анализировали, могут ли обеспечиваться одинаковые эффекты с использованием ДНК-конструкции двойной экспрессии, способной экспрессировать и изоформу №1 IGF-1, и изоформу №4 IGF-1, полученной в Примере 3. В частности, pCK-IGF-1X6 и pCK-IGF-1X10 анализировали в комбинации с VM202 в мышиной модели CCI нейропатии.

Мышей CCI делили на пять групп и вводили им суммарно 200 мкг ДНК-конструкции (как приводится в ТАБЛИЦЕ 3) посредством внутримышечных инъекций в сутки CCI. Болевую чувствительность в отношении механических стимулов измеряли в подходящие моменты времени посредством нити фон Фрея. Каждая группа состояла из 6 мышей, и осуществляли больше, чем 2 независимых эксперимента (среднее плюс/минус SEM; * - р меньше 0,05; ** - р меньше 0,01; *** - р меньше 0,001). Через одну неделю после хирургии CCI оценивали развитие механической аллодинии с использованием нити фон Фрея, и болевые симптомы оценивали еженедельно. Экспериментальная методика обобщается на Фиг. 8А.

Частоты отдергивания лапы, измеренные через одну неделю после хирургии CCI, приводятся на Фиг. 8В. Данные демонстрируют статистически значимые уменьшения механической аллодинии после одновременной внутримышечной инъекции VM202 и конструкций, кодирующих изоформу №1 и №4 IGF-1 (т.е. IGF-1 №1 и IGF-1 №4; IGF-1X6 и IGF-1X10). В частности, влияние на механическую аллодинию было лучше при введении мышам VM202 одновременно с двумя ДНК-конструкциями, кодирующими IGF-1, причем каждая кодирует изоформу №1 или №4 IGF-1, или с конструкцией двойной экспрессии pCK-IGF-1X10. Данные эффекты согласованно наблюдали до последнего измерения в четыре недели после хирургии CCI.

6.6.5. Пример 5: терапевтическая эффективность совместного введения ДНК-конструкций, кодирующих HGF (HGF728), и ДНК-конструкции, кодирующей IGF-1, экспрессирующей и изоформу №1 (Еc класса I), и изоформу №4 IGF-1 (Еа класса I), в мышиной модели CCI нейропатии Как обсуждалось выше в Примерах 1 -4, одновременное или серийное введение VM202 и ДНК-конструкций, кодирующих IGF-1, давало значительное снижение механической аллодинии в мышиной модели CCI нейропатии. Терапевтические эффекты другой ДНК-конструкции, кодирующей HGF - HGF₇₂₈ - дополнительно тестировали в комбинации с ДНК-конструкциями, кодирующими IGF-1.

В частности, мышей с CCI нейропатией получали, как приводится в Примере 1, и делили на пять групп. Как схематически показано на Фиг. 9А, внутримышечно инъецировали суммарно 200 мкг плазмидной ДНК в сутки CCI хирургии. ДНК-конструкции, введенные в каждой группе, обобщаются в ТАБЛИЦЕ 4.

Через одну неделю после хирургии CCI оценивали развитие механической аллодинии с использованием анализа с нитью фон Фрея. Вкратце, животных индивидуально помещали в цилиндр над полом из металлической сетки для адаптации. Для проверки частоты механической чувствительности мышей оценивали посредством стимулирования задней лапы с использованием постоянной толщины нити (калибр 0,16). Для определения механического порога, мышей стимулировали разной толщиной нити (калибр 0,04 ~ 2,0). Данный анализ затем повторяли еженедельно.

Частоты отдергивания лапы и механический порог, измеренные через одну неделю после CCI хирургии, приводятся на Фиг. 9В-9С, причем на Фиг. 9В приводится частота (%), и на Фиг. 9С приводится порог отдергивания лапы. Все значения приводятся в виде среднего плюс/минус стандартная ошибка среднего (SEM) из трех независимых экспериментов. Различия между значениями определеляли посредством однофакторного ANOVA (дисперсионный анализ), с последующим апостериорным критерием Тьюки или критерием множественных сравнений Бонферрони.

Данные показывают то, что инъекция pCK-HGF₇₂₈ значимо уменьшает частоту отдергивания лапы и увеличивает порог отдергивания лапы. При обработке животных pCK-HGF₇₂₈ и pCK-IGF-1X10 наблюдали большее уменьшение частоты отдергивания лапы и наблюдали большее увеличение порога механической чувствительности, которое является статистически значимым. Данные результаты демонстрируют то, что терапевтические эффекты pCK-HGF₇₂₈ также могут быть усилены совместным введением pCK-IGF-1X10. Данные эффекты согласованно наблюдали до последнего измерения в две недели после CCI хирургии.

7. Включение посредством ссылки

Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, процитированные в данной заявке, являются тем самым включенными посредством ссылки во всей их полноте для всех целей в той же самой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент, патентная заявка или другой документ были индивидуально указанными как включенные посредством ссылки для всех целей.

8. Эквиваленты

В то время как разные конкретные воплощения были проиллюстрированы и описаны, приведенное выше описание изобретения не является ограничивающим. Будет понятно, что могут быть сделаны разные изменения без отступления от сущности и объема данного(ных) изобретения(ний). Многие вариации станут очевидными для специалистов в данной области при обзоре данного описания изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> HELIXMITH CO., LTD.

<120> ЛЕЧЕНИЕ НЕЙРОПАТИИ ДНК-КОНСТРУКЦИЯМИ, КОДИРУЮЩИМИ IGF-1, И

ДНК-КОНСТРУКЦИЯМИ, КОДИРУЮЩИМИ HGF

<130> 33730-37536/WO (012WO)

<140>

<141>

<150> 62/699,667

<151> 2018-07-17

<160> 41

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 402

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60

aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120

accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180

gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240

tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300

gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360

gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga ag 402

<210> 2

<211> 1505

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60

tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120

gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc 180

tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac 240

atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagcc 300

cttggcaaat aatgtgatgt acccaagcct cagtttcatc agtaacattg ggataataat 360

aatatctacc acatcagttt gttgtcaaaa ttaagtagct catgcatata ctttgagatg 420

cttttcacat gcctgcataa agtaattgtt ggaccatcgt taatgtctgc cataattgca 480

cttaataaca aagcttgtaa cctttcaagt tctgagattc tacaatcttc caaagaaaat 540

aaaaggctaa tgggaactat tcaaaattca tattcagtag caagcataat taaacatgaa 600

acattaaaaa tagaaatttc tgtttggcta taagaatgcc tagacatttg taatgatcaa 660

aatctgcagg catcattttc taagagctag actgtaaaca aacctcagag gtaccaacta 720

tgccatcagt agtacataaa acatctgatg cacatttagt cacttgatcg atttctcttg 780

aatgagtgaa cgaatgaaca aatgaatata agagattaaa attttagcca ttaagtagaa 840

agaataagaa ctaaagagaa ggtaaaggag gaaaaagaga aggcaaggaa gttgagtaag 900

ggaagaaata gctctcgttt aagtattttg gggactctgt tgaaaaaaga aatgccaaca 960

tgtggtttta atctttggag ctagaactaa taatattgtg caaaagcaca agatgagaga 1020

tcaagaagtt caccatgaca ccttcgctgc ttcctggtct taaacctcag ctgaggctgg 1080

aagaggacca tggtggctta ttggagatgt gaccccaggg agcccctctg aaggatggaa 1140

ggggactggg caagacccaa cacacacaga acacagtagc cactggccag gcaggaagca 1200

aggatctcag aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag 1260

gcagattcat tctttctctt cccaggtgac ccagcgcctc ttggtttcta actggggagg 1320

gggtaggtgt caagagatga gtcccaaagt tctggaatgg tgggtcttgt gactgaggtc 1380

tagacccctc tccagcatga gtgctgtctc ctgcatcata tggagcctgg gcattctgag 1440

ctcattcaaa gggacaccat gggaaccact tgttctcaat gcaattattt ttgtgatgtt 1500

tacag 1505

<210> 3

<211> 75

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga gaaggaaagg aagtacattt 60

gaagaacgca agtag 75

<210> 4

<211> 15250

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

aggacaggag gattaaacag acagaggcaa ggatgatgag agaggagcag acagcaagaa 60

tgaaaagcag aaaatacaat agaggaaatg aagaaaagta ggcctgctgg agctagatga 120

tgatgtgatg gaaatagaag taacctttta gagaatctcg ctaagaaaca tggagaaaac 180

ggaaaagaaa aatgtaatgc cctagaaagc gcaaagaaag acagtggcaa aaatgaaaaa 240

aaaaaataaa aattataaaa gaggcaaaaa aagacacact attctctgcc tctaaaacac 300

aattaaataa aagaatttaa ataaaaatta aggcttctat atgcattttt aaattttgta 360

tgaatctgtt atggaagaat tgcctatgtc aatatatgtt cagagttaaa tattagcccc 420

aaatgctcag caagactgaa ttgtgtcata gaagttccca gattcccttt tcccgcaatg 480

tcattggagg ctgcatttct tagtcaagtc cagggtttag gccaaagggc atccggtatt 540

gcctaaaacc ctgtgaggtc tgtgaggtaa cttttgagaa gaggtcactg cactcttcat 600

cttttttgca ctttggaatc agatataaaa gatgtataag tttgctaggg ctgccataac 660

aaagtatcat aggctaggta gtttaaacca cagaaattga ttttttcata gttctgggag 720

ttgaaagtcc aaaatcaaag tatcagccct tgcaagggcc ttagagaagg ctctgtcatg 780

ggctcctccc ctcggcttgt aggtggcctc cttcttctcc ccctgtgtct tcacttcatc 840

ttccctccat acatatctct gtgtctaaac atcctctgtg tgaaacaaca ccagccaggt 900

tggatttggg cccaccccac tgacctcatt ttaacttaat tatctctgta aagactctgt 960

ctccaaatac agtcatattt tgacgtactg ggagttaggg cttcaacaca tgaatttgga 1020

cacaattcag ccagtgacag aagacttctg atctctgatg ataaccactg cattttgatt 1080

acagctccta gaaaacactc ccctccacca ccccaccaca gatctatttt tatatctgaa 1140

accctgagtt tctgctccat gagaacccca ggaacatact atgttagatc tggaagaagc 1200

ctcagaaatc cccttatttt gaagactagg acactgagat ccagaagtgg gtaaagatgt 1260

gcttgggttc taagctgctc ttcttttggc caggagacaa cagcacataa tcaaagtggg 1320

tcaactaaga aagaattcca gaaggaaaag agagggcaga aatgaaggga gagaatgaga 1380

gcaaaagtgc tggatttccc tgagggtgaa gaaaagttaa atagaatcac agaattcaga 1440

ttttagagat cttctccttc agatcccttg gtttaatcag taggattggg gtcttcatag 1500

ataataaagc aaaaactctc gccatcctcc aagttgtgaa ttagaagagc tgagaaaggg 1560

tacaagacgg aagttctcta ccaaacaaat ggtgacattt tggggtaaga atatgactaa 1620

cccagaagtg aagcatttca tccaagtagt ctattttgaa gatgtcatgg tataaaggaa 1680

cctcctttct gcctggtcct ccatgcctct gccatgcttt ttactccagg atcacccttt 1740

ctagtggttc actgaaaacc caggattact taaatatgat ggacatgttc acggctcaat 1800

ccaggaggaa aaggtcgaac tgaaagcatg ccaaagcccc acatgggagc caagccactg 1860

ctgctgtggt tgcaaagtgg atcctggctt atcagagcag agagaagcca ggctcgtgcc 1920

ttagcccaag tggccagtca ccttattcag gagatactaa gttctccagc taagacatcc 1980

atgctttggg accagctgca gacagaagcc aattcctact acaaccatca ccttagagta 2040

gcatatagac acagatggct cttcaaagga ccacagttcc atggaataac taagaattca 2100

tgtcctgtgg aaaggtttga ataaactata attataccca atcataaatt tcattcaaga 2160

agaactaaag caaaggcaaa gacagagaga agaaggaagg aaggagggag ggagggaggg 2220

aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaggaagg aaggaaggaa ggaaagggaa 2280

ggaagaacaa aaagactttc tagttaaaga atgcttaact agcaaactat gtactataag 2340

acagttcttt tcggaatgag ttttatcaac tctaaagcaa ttatcttgaa tgcctacatg 2400

tgattactga ataatatgaa ccaagaaaac agaaagaatc tatattatct ttccatttcc 2460

ttctttccag tatcaatacc caagcctcta gtgatacatg gcatataatg ttggatggat 2520

ggatggatgg atggatggat ggatggatgg atggatggat gaatggatgg ttggatggac 2580

aaatgagtaa cataggctga tgaatagtgg tagaaagaca caccataaaa acaagtggca 2640

cttctgagat gaaatgattc ctattctcct acacaagaca gtgaggcaag tacagagtaa 2700

aaaaggaaag gcataggagc tatgcttata caagtattgt atgtttggaa tttccttcgc 2760

tggccaaatt gaaattgttc aaggacctat tgctacaggt ggcaactggc taagaatttc 2820

atagtgaata ttatacacct attactcccc ttaatgtttc tttgaagtaa gcagaatatt 2880

aataatcatt taaaattcca gtgtttcaac ttcaattgtt tcctagggca aattgataat 2940

tgtgtgtaaa actaattgga atatgtatgg aataatcatc ctgaaataaa attggtgaaa 3000

agtatttgtt attgggcatc tacaatgtgc aaacctctgt actaggcatg aacaagagtt 3060

ataagcattg gagaggctaa aatatagtcc ttaaggctgg gcacagtggc tcatgcctgt 3120

aatcctagca ctttgggagg ccaaggcggg cagattgcct gagctcagga gttcaagacc 3180

agcctgggca acatagcgaa accccatctc tactaaaaat acaaaaaaat tacctgggca 3240

tggtggcacg cacctgtaat cccagctact caggaggctg aggcatgaga attccttgaa 3300

cctgggaggc agaggttgca gcgagccgag atcctgccgc tgcatcccag cttgggtgac 3360

agagtgagac tctgtctcaa aaaaaaatta aataataaat aaatagtaaa atacagtcat 3420

taagagtaca aaatgtagat tcagactacc tgggttcaaa tcttggctct tacttgcatt 3480

gtggctttgg gcagatcatg taacttatgt gtgcctcagt ttcctcatct gttaaatagg 3540

ggcaacaact gaatctacct tattcagttg ttgtgagggt ttattgagat tgtgtgtgtg 3600

tatgtgtgtg agtgtagtgt gtgcatgtgt gtgtctgtgc aaggagtggg aggtgtatat 3660

tcagagacac atattacagc acttaaaatg gtatctagca cttagtaagc attattcaag 3720

ttttagttaa cattatttta cttacctctg aaaattggag ctatgtgaaa aagaagttgg 3780

tctcctgaag tagaagccag tcttgtgtca ccaaaaactt caagcccaag cttgccaacg 3840

cttttccatg atgtggtagt agagtttcaa gcatgtggta ggataagaga actcaatgac 3900

ctaagaacca ttccaaccca gagaacccct ggttctatga ataattccaa cttaaatagg 3960

tagcttggct ctcccaagtg agagccattg cttctgtttc cgggtcatat aatgaacttt 4020

cagaaaacca ccatttttct caaccagtta aaattaagtg taatacgtgc tttcatttca 4080

tggtgcctgg ggaaaattta attgtagtat gaactccagt tattggtagt cttaagtaaa 4140

attgccaaaa taaatagaaa tgcaggatat ttctgggctc acacagcttc cgggacactt 4200

tagtttcttg ggctgccaat ccagtgcctt tcacaagcat ttgatctttt ttcaaacatc 4260

tcttgaaaac aaacaaaacc tcacacagct tctaatgtgt gcactgttcg aatgtaaggg 4320

tggaaaagga ggcaaagaaa tgagctccca aagagcaatt ccccttctct cgcctccatc 4380

ccttgacgac ctccctccca ctaaagggaa acattgtttt cttaggtaat aaattctgca 4440

atttctcaag tccattaaca tccactgggc aagatgagat ctattctttt tatttgccca 4500

taggaaaaga atagtgcttt tttgcaatat tcactagata acacagagtt gacttttaat 4560

ccaagggcaa cattgatagt ctctagttaa aggggaagcc ttcaggagca atgaaaagat 4620

taatagtttt agatgaagca gaatccaaat ccctttttat gagttttgaa atatccagtt 4680

tgtatgctca cctcaatact taaagcccag ttactgattc ctttggccta agcaagacag 4740

gtcaattttt aaagagggag tagctgaggt tagcaaaaat tctccaggtc cacaaaactt 4800

ccagacctgc aaggtgaaaa tcagcttttc tgtcatccct aaaggcctaa ctggaatcag 4860

aacttttccc tgatgcccac atatttggag gtcctttttt aatgggactc cttaatgcct 4920

ttagtgccat cccattttca tccagtgtcc aaaagaaatg atttaaaaat ataaacgtat 4980

gtttaaattc cagaagagag aaatggagat tgagaacaat agggaaatga tgagagctat 5040

gggaaaagag gtttatgagt ccatgtctga ttcttccaga gagcccctaa gaaagttctt 5100

atcataccag gaactcaatt ataactttca ttgcctattg ttagatgagt aacaggagct 5160

agaaaacatt ttggaaattc ccatctttat ttttttaact aatatgatta tagttttaag 5220

aaccattggt caagaagcta actttttaaa aagtggaagt atgatggtta gaaataagaa 5280

tgctaaaggt gcatcaagct gattttaatt ctaaatgtcc ttggcagcaa tttagaatct 5340

gtaataaact acaccaaaca gttttgaggg gaaggggatt agtttctccc cttccttcgt 5400

gtgtgtgtgt gcgcgtgtgt gtgtgtgcac ctttgtgttc tagcattgtt gcacccatta 5460

cagagctggg gggaactatt ttccaaaatt ataggtgaga acagtttctt ggattgtctt 5520

tcagtgaagg taaattcctc tgtaaaaact aaccatcatt cagtaaaaac tgcaggattc 5580

ctttgtcttc tcaaaagcct gtttctcatc ctaaattaaa aattattcag gaaatagaga 5640

ggacattatt ggaggggtgg aaataagttg gttttctttt tattgtatct tttgaggatc 5700

cagggacttc taccatttcc catctaacat acagagaagg attctctagg tccctgtcta 5760

tagactgcag taactttcct atagaaccaa tttgcaattt tagaaatttc taggtctaat 5820

tattgaccca ttacaaccaa aggtcaatgc atccagccaa tcttccttct atcatcccct 5880

gcccttactt ctattaggga ctgggattac aggcaaaacc catcaaatgc ctcttctacc 5940

actttcccat ttcttaacca ttagcctcta acttcctcta ttcagtttct catatgcttt 6000

catgcccatt gggtcagata aaggaacatt catttatttg agtaggcatc tgttatgatc 6060

actccggaaa aaagatgaca atgggttacc ttgtcctcct gggcttctct aactgacatg 6120

gtcaaaatgc ccatatgaag ataagatgtt aagagcaaga tttatgaaaa gctgagtatg 6180

atggcagctc ttgtctcata aaataactcg aaagttccca gtgaaagacc aagaaatttt 6240

acatcaaacc caaaccggcc aaatggtcca agcttccaag ctgggatcca tggctaaagt 6300

ttctacaaaa ttctgggtac aatgtataaa cattcacttg gggctttctg tctagccagc 6360

accaagaggt caagtaatca aggaccaact agccctgcca tctgtgaaaa tatgtgctat 6420

tttcacggct ttagttcaca attatggcaa gacaaaagtt ccaaataatt aggagcaaga 6480

ccatggcagg ttgacggttg agtaaggttc tcaatcagcc gacaattgta gagttgggga 6540

tgtgcaatgt ttatgtcatg gtgtaagtat gtggcatgct tgactagctt gtgaggcact 6600

ggaagactag aaggaatgaa aaatatgaat gaatcaataa atgcatagta taattactgt 6660

tattttgtca gtattgtttt acctaggtca ctattgaatg ctctgatttg tctctttata 6720

aataataata tgttttcttc ttcaaaagaa cactaggatg aaggtagagg tgcttttggc 6780

acaatgccac aattctgatt tttttaaaac tgtatgcatg cataaaatgt tcttgagcca 6840

ttctctgcct tggaatagca ctggctggca ttctgcatgt ttacttttat atgctgaagg 6900

cccccatcaa cctcaaacag aggcaaatca atttaacttc tcatagtgtt attttgttca 6960

tcctaaaagt tcaagagagc cttccaaact tccaaaattt ctctcaattc agtgaggagg 7020

aaaattcaga acacagcatt tgaatgttct gcccagattt gtcacacaca caaggaatga 7080

gtgaaagagg gcaacaccct ttcctcctaa ccctgtgaac tcatcactat tgcattgaaa 7140

tgacaccaaa aggtaaaaac cctaggcctc acatctccca agaacactgc aataggagtt 7200

actgcataca ccagtttaag taactctagc ataaattgta tgtcagatga aacaatggca 7260

ttttggaggc ttaagagaaa aagaataatc aaatccagtt tttaggtact aatgtgctga 7320

atctttagca catagcagca aaattgctag aatctggtgt ttcacttttt aaaataccac 7380

atttgaacct ttcagcaatt ccaaaatcaa ctccctctgc gaaagataat aagcttaaac 7440

attttttaaa tttaaaaatg taacacaaac aaacagctaa gcaaacaagc tgcccataaa 7500

atcaacagtc tggggagccc tgatcctgaa gtattttaca acatccttca tgactattaa 7560

aggcaacata aacacctctt gtcagcaagg gaaactaccc ttggcatttt tttttctttg 7620

ttccccaggc ttttaaacca ttttgataga gattttttac atcacaggca gaaatatttg 7680

aaatagagtc aggtggtagt ctttaaaaga gtaagaaagt tgctaagtca agataatctt 7740

ggaataaagt cctctgattc ctggggattc ctagggatgc cccagtcact agaaaacaga 7800

gctgtaagtc cactctccca gcactcaacg gagctccgga aaccaaggag ctagctactg 7860

tttccccaca ttcagccaga gaaagggcag cactctagca tgcaaactgc tttgacaata 7920

gtaacaatta aaaagtaaat taaaaagaat cataatagct gatattgatt aggtacttgc 7980

cctgtggcaa gagctatagg gaatcacctc atttaatctt cacatgaagc ttgcagagtg 8040

agtaccacaa ttatcactat tgtatagaca ggaaaactca ggctgagtat ggctaagtgt 8100

cttgccaacg tcttgggcta acaagcggtc aagcagaatc caaacccgag atagatagac 8160

cacagtgtgc taatcaagca ctgcactctc tcctgcattt cttagttgat atttaccata 8220

tacaatctgt cacttgtatg agatggcagg gggttctgtg ctatttgtcc ttgtagagaa 8280

taccacagga agaaagtaag cagccatgca atatttgctg ttgacctgaa ctccattcca 8340

tcattcctgc aggaaattcg catccattaa atgagcattt cctggtttgc cactttgctc 8400

aaacactttg cttggatctg gagaggatat agaagtgaag gaaatatgct acctgctctc 8460

aaggaactta tgttttagtg gagagacaaa catgcagaat ttactctaca gaacatcaat 8520

gcttgagcaa atgtagaccc agagagggct cttacagcac acaagccaga acagactgat 8580

ggtgctaaca attaggttca aggtttttct aaacagtaga ctctcctgca tacaactata 8640

ccgcatgcca ggtaaatgac tgagggttat tacatccaat tataacacca ctgtgatgta 8700

ggtgctctta ccccacactt tcattttaca gaagaggaaa ttgaggacag cacaatgtag 8760

tgattatcaa aggtcacacg actactgtgt gggagagcta ggatttaaac cagatgcata 8820

agatgaggtc ctccaagaaa cagaagatga gaaggtgtta aatgagcagg ggttttatta 8880

gggggaatta atgtgtgaac agaaataggg gaggataggc aaagccatca gattgcaagg 8940

caagcctaac cccaagggaa ggagagagag agagtagatt ggttggaaac atttttggtg 9000

ggtctatggt ctaaggaaag ttcagcaaag tcatcatgga gtttttgagc caaagttggg 9060

caatacagtt gcccaacaaa tttctgtgtt tctcagaaat aggtctgcct caatgtcccc 9120

accatacttg gtcactggct cttgggaggg gcctgccctg ttccaatcca ctagagccaa 9180

agaagagccg ttgtactggc agggggtggg ggaattccta caaccacata aaaagtgggg 9240

tgaggtttcc agaaaaaaac gtgatgctgg gctaaccaaa actgtgtcca gtaagtacat 9300

atccctcact ctgttaaaga agcagccaca taaacaagga gtacacgttt ctcaaaatgt 9360

gcaccttgtt ctttggtttt gaagtcacat cccaaagtgc tgagtagatc gcatgaccct 9420

cgctttgcct ggctgccaga gaggaaaggc tgatccaact ctcctggaat ttgaacttgt 9480

gattccctga agtaaagaga tatcaaagtt gatactgaga catctaaatc atcctccacc 9540

atttcacatg tccccaggcc aagccagcaa aattgctata gcacatccct ttcaacaggt 9600

aaagggctga tatctgagcc ctctttccaa tcatccactg ctcttttctt ctcattttgc 9660

cctttttggg agcaggtcaa tgctgagtta gtactttatg ctgtacaata agctgctgat 9720

attccatgct ggacagaatt ttcccagtat tttttataga gtgccaggct tttcctagac 9780

ttcatgtcat acaatactta acttgtttgg agtgggtgga gatggaaaca tagtctattg 9840

aaaacatcac tgcttcctcc ctgaagttta aagagcctat ttttatcctt ttagattcta 9900

tctctcaggc aaaatctcat aaagataagt ggggaggaaa aaaagggggt tataatacct 9960

agggagtttg cttttgctaa ttgaatactg tgctcctaga cttctataaa taccattaca 10020

aatgggtccc agcttgtggt aatactcacc ctcctcattg agtcttctgt cccatggcac 10080

agcctttccc tccaaactag catctacccc catctggaag catgggcagc tcatgatatt 10140

atcaactatt gctattggaa agtgatttgg acttgaaagc actagatatt ttttacctct 10200

tggggaggca gtttagcaga gtggttaact ggtgagctcc agaatcagaa ggaataggtc 10260

caaattccaa ccactattac atctccatca taagaaatta ggcaagttgt ttatcctaag 10320

tttcagattc cttaaagata aaacagtcaa gacagtagta cttatccctg agagaagtat 10380

aggaaacaag aaaatatatg caatttacat acatactaca atccccagca catgacaaat 10440

gttcaagtaa tgggaactgt tattatttta gccctttgtc tatcagtttg ttcctctgtg 10500

acctcaagca cattactaaa tgttagcgag cttcagcttg tacgtgggac tgacaggaat 10560

aacaccgcat cacctcatgt ggtgattgta aggattcagt gatattattt tgtaaactgt 10620

aaagcctttg caaatgttaa gcaagattat tattattgcc gttgttatta gtcctcagtg 10680

atcttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttggagacag agttttactc 10740

tgtcgccaag gctggaatgc agtggcacaa tctcagctca ctgcaacctc cgcctcctgg 10800

gttcaagcaa ttttcctgcc tcagcctcct gagtagctga aactacaggc acacgccacc 10860

acaccaggct aattttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccatgt tggccaggct 10920

ggtctccagc tcctgacctc aagtgatctg cccacctcgg cctcccaaag tgctgggatt 10980

acaggtgtga gccaccacac ctggcacagt aatcttaatt gaaaagtctg tggatagctt 11040

tccaaaggaa agcttggagc ttggataaga accaagagat aatgggagaa ggtgaatggc 11100

ctcttcaggg ccttttctag caccctaaat atgcgtgtct gtccataatg ggtaatcata 11160

tatatcacaa atcaaaccct ccacaaactt atttcctaat gtgtttgtta acctttcctt 11220

ctaaagggta aacttcttta accaacccca gtgagctgga ggatcaatgt tttcttaata 11280

gtcttacctt cgttggtgtc aataggaaac agtatttact cactactgtt ttccttttaa 11340

aaatctgtct agttgcatac tagaaacagt ttcagctggt ttgtttgtat tggacaagct 11400

gctgaagtga aaagtttttg cttgactgaa tgtgagacag tttcataact cttcaagaag 11460

tgcaccaaag gtgggtgcca gctctgatga cggctgcttc taacatgcct ccacttgccg 11520

cccattgtca agggtggctg gcgtaattaa gttaagacaa tgagcaaagc aacagatgca 11580

actgagacct agtccctgag tgcttttgtt ttgtcactgt cattgtctgc aacaaagaag 11640

tcacatgtga cagcctggga agagagccaa atgcaaacca gacgatatcc cagctggttt 11700

gaatggcctc caccgtgcac gtgtgtgcat gggaatcatg ctacttggta cagcatctgc 11760

ttcactcaag tgagtttcag cccatggctt tgctgtgatg ctgagacaga cccagaagaa 11820

acagaccagg gaatccctcc gctcagactt tacactttat accttgtgct ttgagagaaa 11880

agaaaaagaa tctctctatt ggagacaaaa aataggatgt atgtggttgg tcaatctaac 11940

ctcaattctt tttgctatag ccccccgcta atttaaagag tgaagcatag atggtatctt 12000

aatgttttct tgtagaaatt tgggattaat ttggcttgag aggaagaatg gagattaaac 12060

gctttatgag gctttctttt aatttgttcc catttcattc ctgaatattt tcttagtttg 12120

ggcattgcag atgtttaaag aacttcttat tttgagctgg tatgcctctt aaacagaaaa 12180

acaaaaggta aaattcaaat tagtgtgttt ctccgcctgt taattaattt ggttagtagt 12240

taggcagaga gatggcatcc ttaataatat ctattttgcg ggtttgatca gctacagacc 12300

atcaacagtg ttgattgaga attgaacaaa aacatttcaa ggagtttggg aacattaggg 12360

atgctattct gtggccccat gtgtccttct ctcatttttc tagagaactc ctataagaaa 12420

gcagaacacg gccaggcatg atggctcatg cctgtaatcc cagcacttca ggaggctgag 12480

gcaggcagat cacctgaggt caggagttca agaccagcct ggccaacatg gtgaaaccct 12540

atctctatta aaaatacaaa aaattagctg ggcatgatgg cgcgtgcctg taatcccagc 12600

tacttgggag gctgaggcag gagaatcact tgaactggga ggcaaaggtt gcagtgagcc 12660

tagatcacac cactgcactc cagcctgggt gacagagtga gactccaact caaaaaaaag 12720

aaagaaagaa agaaagaaag cagaacccaa tggaagatta agaacacaca tttagcttac 12780

gcctgtaata ccagcacttt gggaggccaa ggcgggtgga tcacaaggtc agaagttcga 12840

gaccaacctg gccaatatgg tgaaacccca tctctactaa aaagtacaaa aattagccat 12900

gcatggtggc aggcgtctgt aatcccagct actacagagg ctgaggcagg agaatcactt 12960

gaacccggga ggcagaggtt gcagtgagct gagaacgcgc cactgcactc cagcctgggt 13020

gacagagcga gactccatct caaaaaaaaa aaacaacaaa aaaaaacaaa acacaagttt 13080

actgggaact tagcagtaga tgctttgcac cacaacaaat gtatcttaag tggtcttttg 13140

tgatatttga gggaaagtgc cagaatttaa aacaaatggc atttcaagtt attctataca 13200

aatgcccagt ttctttctac catctttttt tcctttttgc agtggtcact gagctatttt 13260

agtgaatgtt tttacacaat gatgccatct tccttctact cagtcagtac aagatgttga 13320

ccatcgactc ataaaacact agctaccttt catgaaggac ttggtgataa ctctcatgtt 13380

ccaagtagaa ccggaaaaca tgtgtaagaa aacctgccga tccctatggg ccttggccaa 13440

taggtattat tcccaagggg tggcagttta tctttttccc cagccttcat attaaaacct 13500

ctcaccttct ccaggtctca ggtctgtgta atctcaaatg tgctttagct cctcacaata 13560

ttgtaactgt gtgggtgttc attaccttag ccagaagaca gtttacagat tccaggtctc 13620

atggagagaa cttttgtttt tggttatgaa cctcactgta taccaataat tatccattac 13680

atccttctgt agagggctct ctggctagag ataaaaccaa aaaaagaagt acctcaggtt 13740

tatgcatata aatgccagtt cctccttgat tttatttcaa aactcctgtc tacatacttt 13800

gcaatttaaa tacattcaag gataaagtaa taactgtagg aaaagtatta taatataatg 13860

acttagttct gcacatcaca agggggtccc tcatactcat tcattcattt cactcatttt 13920

acagatattt attgagcacc tgcaataacc tgcacactgc tctagacact gggactataa 13980

cagtaaacag acagatacat ctctggtctc acagggcttc tattctaagc aaaactcaat 14040

atccaggccg ggtgcagtgg ctcatgcctg gaatgccagc actttgggag accaaggcca 14100

ggcagatcac ctgagcccac tagttgaaga ccagcctggg caatatagca aaaccccgtc 14160

tctacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaattgtcaa ggcatggtgg catgcgcctg 14220

tggtcccagc tacttaggag gctgaggcag gaggattgtg taagcctggg aggcagaggt 14280

tgcagtgacc tgagatggca ccaccacact ccagcctggg caacagagtg agaccctgtc 14340

caaaaaaaaa aaaccctcac tatccttaag ataacatcat tgcttgttga tgagtgaatg 14400

ttaacaccaa attaggaacc caggactttt agtcttggca tggttacttt ccaataaaga 14460

tgacaatact aagaagagaa aaatgattta ataatgataa tagtggctaa tacttatgta 14520

gtgcttacca tgtgccaggt ctattgtaag tacttttata tatattaatt atttaatctt 14580

tgatcctata aggtagatat tattgttacc ctagtttata gatgaagaaa cggaaacaca 14640

agagattgcc actcatacaa gtttacacag ccagaaaata gaaaagctac gagttgagct 14700

cagcccagta tgtctatgat tttacagact caaaattaat tataagattt cctaatcttc 14760

gatttctgaa actctgcctt gctctagagg aaaacaagaa aaacaatgaa aaataaatgt 14820

ctctttttta caaaaattaa aacagaacaa actgcaataa aacaacagag gatgaatcca 14880

gaatgtgatt gatttttttt cttactagga aaggatctag aggccagaag gctggatttt 14940

tcaggatctc ctttcaatca atgaatctgt gatagaagca gatgaatcaa atctcatctt 15000

tgtgtgatta taaagctgtc tgtggtattc acgccaccag gggtacatag aagatgcctg 15060

agtgaggttt ggcaaaagta ctaagggcct gtccacctat acatgccctt ctcaggaaaa 15120

ccaaggttca agctctctat tagctcaact ggtaaggcgt aagacatgga aggttgaggc 15180

ccaatgttag aaatagatgg atacataaaa cttcatcaag ttaatgtcac tttttctcct 15240

ttatttatag 15250

<210> 5

<211> 60

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

gaagtacatt tgaagaacgc aagtagaggg agtgcaggaa acaagaacta caggatgtag 60

<210> 6

<211> 375

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60

tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120

gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttggtcac tctgcattgc aaatttcccc 180

tcccaccgct atggacgatg tgatgattgg aagatgttac aaaacagtgg ctaaacaaac 240

atgggctttg gtgtcagaca aaagtgaagt cctggctttc tcacacacca gcttagagag 300

aaaagacttt taggtgaatg tggcaggaaa gcgtgcttgc tggggcaaag gcagattcat 360

tctttctctt cccag 375

<210> 7

<211> 300

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 7

gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt ctctctcttg tgcatgtggg 60

tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta caagtcagaa aagctccttt 120

gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa caaacatggg ctttggtgtc 180

agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta gagagaaaag acttttaggt 240

gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga ttcattcttt ctcttcccag 300

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 8

ctttttctcc tttatttata g 21

<210> 9

<211> 933

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 9

atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60

aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120

accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180

gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240

tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300

gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360

gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420

gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480

tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540

acatccccat ctctttggtc actctgcatt gcaaatttcc cctcccaccg ctatggacga 600

tgtgatgatt ggaagatgtt acaaaacagt ggctaaacaa acatgggctt tggtgtcaga 660

caaaagtgaa gtcctggctt tctcacacac cagcttagag agaaaagact tttaggtgaa 720

tgtggcagga aagcgtgctt gctggggcaa aggcagattc attctttctc ttcccagtat 780

cagcccccat ctaccaacaa gaacacgaag tctcagagaa ggaaaggaag tacatttgaa 840

gaacgcaagt agctttttct cctttattta taggaagtac atttgaagaa cgcaagtaga 900

gggagtgcag gaaacaagaa ctacaggatg tag 933

<210> 10

<211> 858

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 10

atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60

aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120

accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180

gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240

tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300

gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360

gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggtaagccc acctgggtgg 420

gatccagcca tcctcaagtg gtctctctct tgtgcatgtg ggtgggccaa gcagaaatcc 480

tgccccatag tctcctggct tacaagtcag aaaagctcct ttgcaccaaa gggatggatt 540

acatccccat ctctttgcta aacaaacatg ggctttggtg tcagacaaaa gtgaagtcct 600

ggctttctca cacaccagct tagagagaaa agacttttag gtgaatgtgg caggaaagcg 660

tgcttgctgg ggcaaaggca gattcattct ttctcttccc agtatcagcc cccatctacc 720

aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtagctt 780

tttctccttt atttatagga agtacatttg aagaacgcaa gtagagggag tgcaggaaac 840

aagaactaca ggatgtag 858

<210> 11

<211> 728

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr

165 170 175

Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser

180 185 190

Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu

195 200 205

Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp

210 215 220

His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro

225 230 235 240

His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp

245 250 255

Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr

260 265 270

Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys

275 280 285

Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu

290 295 300

Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile

305 310 315 320

Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu

325 330 335

His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn

340 345 350

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr

355 360 365

Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp

370 375 380

Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met

385 390 395 400

Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp

405 410 415

Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala

420 425 430

Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His

435 440 445

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys

450 455 460

Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu

465 470 475 480

Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val

485 490 495

Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg

500 505 510

Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp

515 520 525

Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr

530 535 540

Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys

545 550 555 560

Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly

565 570 575

Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp

580 585 590

Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu

595 600 605

Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn

610 615 620

Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu

625 630 635 640

Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu

645 650 655

Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp

660 665 670

Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu

675 680 685

Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly

690 695 700

Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile

705 710 715 720

Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser

725

<210> 12

<211> 723

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 12

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg

165 170 175

Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg

180 185 190

Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr

195 200 205

Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly

210 215 220

Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe

225 230 235 240

Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg

245 250 255

Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His

260 265 270

Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met

275 280 285

Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln

290 295 300

Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro

305 310 315 320

Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro

325 330 335

Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro

340 345 350

Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg

355 360 365

Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln

370 375 380

Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln

385 390 395 400

Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp

405 410 415

Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu

420 425 430

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr

435 440 445

Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys

450 455 460

Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile

465 470 475 480

Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr

485 490 495

Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His

500 505 510

Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg

515 520 525

Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly

530 535 540

Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu

545 550 555 560

Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu

565 570 575

Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile

580 585 590

Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser

595 600 605

Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu

610 615 620

Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His

625 630 635 640

His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala

645 650 655

Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu

660 665 670

Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro

675 680 685

Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val

690 695 700

Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val

705 710 715 720

Pro Gln Ser

<210> 13

<211> 3679

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 13

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc 780

ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat 840

aaagcctgtt aacaaaacac aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat 900

gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg 960

cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa 1020

aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag 1080

ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta 1140

ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa 1200

gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg 1260

tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct 1320

caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 1380

agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 1440

gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 1500

tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 1560

taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1620

tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1680

aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1740

ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1800

caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1860

taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1920

ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1980

gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 2040

agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 2100

tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 2160

ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 2220

caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 2280

cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 2340

tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 2400

tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 2460

aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 2520

tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 2580

ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2640

tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2700

atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2760

tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2820

agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2880

ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2940

cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 3000

aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 3060

gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 3120

ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 3180

ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 3240

gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 3300

atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 3360

caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 3420

ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 3480

gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 3540

aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3600

tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3660

taaggtacca cagtcatag 3679

<210> 14

<211> 153

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe

1 5 10 15

Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu

20 25 30

Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala

35 40 45

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

50 55 60

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

65 70 75 80

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys

85 90 95

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu

100 105 110

Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp

115 120 125

Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly

130 135 140

Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met

145 150

<210> 15

<211> 462

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 15

atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60

aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120

accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180

gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240

tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300

gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360

gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac 420

gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac tacaggatgt ag 462

<210> 16

<211> 158

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 16

Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe

1 5 10 15

Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu

20 25 30

Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala

35 40 45

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

50 55 60

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

65 70 75 80

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys

85 90 95

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu

100 105 110

Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp

115 120 125

Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr

130 135 140

Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys

145 150 155

<210> 17

<211> 477

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 17

atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60

aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120

accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180

gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240

tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300

gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360

gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420

aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtag 477

<210> 18

<211> 137

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 18

Met Ile Thr Pro Thr Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu

1 5 10 15

Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala

20 25 30

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

35 40 45

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys

65 70 75 80

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu

85 90 95

Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp

100 105 110

Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly

115 120 125

Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met

130 135

<210> 19

<211> 414

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 19

atgattacac ctacagtgaa gatgcacacc atgtcctcct cgcatctctt ctacctggcg 60

ctgtgcctgc tcaccttcac cagctctgcc acggctggac cggagacgct ctgcggggct 120

gagctggtgg atgctcttca gttcgtgtgt ggagacaggg gcttttattt caacaagccc 180

acagggtatg gctccagcag tcggagggcg cctcagacag gcatcgtgga tgagtgctgc 240

ttccggagct gtgatctaag gaggctggag atgtattgcg cacccctcaa gcctgccaag 300

tcagctcgct ctgtccgtgc ccagcgccac accgacatgc ccaagaccca gaaggaagta 360

catttgaaga acgcaagtag agggagtgca ggaaacaaga actacaggat gtag 414

<210> 20

<211> 195

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 20

Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe

1 5 10 15

Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu

20 25 30

Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala

35 40 45

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

50 55 60

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

65 70 75 80

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys

85 90 95

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu

100 105 110

Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp

115 120 125

Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr

130 135 140

Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu

145 150 155 160

Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys

165 170 175

Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys

180 185 190

Lys Gly Lys

195

<210> 21

<211> 588

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 21

atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60

aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120

accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180

gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240

tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300

gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360

gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420

aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggttggccaa agacacatcc aggaggggaa 480

cagaaggagg ggacagaagc aagtctgcag atcagaggaa agaagaaaga gcagaggagg 540

gagattggaa gtagaaatgc tgaatgcaga ggcaaaaaag gaaaatga 588

<210> 22

<211> 482

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 22

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

ag 482

<210> 23

<211> 1675

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 23

cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa gggggaccct ggtgtttcac 60

aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct cagtgttcag aagttgaatg 120

catgacctgc aatggggaga gttatcgagg tctcatggat catacagaat caggcaagat 180

ttgtcagcgc tgggatcatc agacaccaca ccggcacaaa ttcttgcctg aaagatatcc 240

cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcccgat ggccagccga ggccatggtg 300

ctatactctt gaccctcaca cccgctggga gtactgtgca attaaaacat gcgctgacaa 360

tactatgaat gacactgatg ttcctttgga aacaactgaa tgcatccaag gtcaaggaga 420

aggctacagg ggcactgtca ataccatttg gaatggaatt ccatgtcagc gttgggattc 480

tcagtatcct cacgagcatg acatgactcc tgaaaatttc aagtgcaagg acctacgaga 540

aaattactgc cgaaatccag atgggtctga atcaccctgg tgttttacca ctgatccaaa 600

catccgagtt ggctactgct cccaaattcc aaactgtgat atgtcacatg gacaagattg 660

ttatcgtggg aatggcaaaa attatatggg caacttatcc caaacaagat ctggactaac 720

atgttcaatg tgggacaaga acatggaaga cttacatcgt catatcttct gggaaccaga 780

tgcaagtaag ctgaatgaga attactgccg aaatccagat gatgatgctc atggaccctg 840

gtgctacacg ggaaatccac tcattccttg ggattattgc cctatttctc gttgtgaagg 900

tgataccaca cctacaatag tcaatttaga ccatcccgta atatcttgtg ccaaaacgaa 960

acaattgcga gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt 1020

gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac 1080

tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca 1140

tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt 1200

atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga 1260

tgattttgtt agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag 1320

ttgcagtgtt tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt 1380

ggcacatctc tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac 1440

tctgaatgag tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg 1500

ggattatggt ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat 1560

tgttcctggt cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata 1620

ttatgcaaaa tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag 1675

<210> 24

<211> 3756

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 24

cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60

atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240

tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300

ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct 360

acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg 420

gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480

tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga 540

cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 600

accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 660

accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga 720

gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt atgcatgcta 780

tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg tgatggtata 840

gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 900

ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tatctctatt ggctatatgc 960

caatactctg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtcccat 1020

ttattattta caaattcaca tatacaacaa cgccgtcccc cgtgcccgca gtttttatta 1080

aacatagcgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1140

cggtagcggc ggagcttcca catccgagcc ctggtcccat gcctccagcg gctcatggtc 1200

gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca caatgcccac 1260

caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1320

agattgggct cgcaccgctg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1380

aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1440

aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 1500

taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 1560

ttgacacgaa gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattctgcag 1620

atatccagca cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 1680

ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 1740

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1800

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 1860

ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga 1920

aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag 1980

cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 2040

tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 2100

tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 2160

ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg 2220

tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 2280

tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 2340

gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 2400

cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca 2460

gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt 2520

tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 2580

agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 2640

agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga 2700

aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc 2760

ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca 2820

gctggcaatt ccggttcgct tgctgtccat aaaaccgccc agtctagcta tcgccatgta 2880

agcccactgc aagctacctg ctttctcttt gcgcttgcgt tttcccttgt ccagatagcc 2940

cagtagctga cattcatccg gggtcagcac cgtttctgcg gactggcttt ctacgtgaaa 3000

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 3060

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 3120

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 3180

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 3240

ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 3300

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 3360

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 3420

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 3480

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 3540

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 3600

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 3660

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 3720

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatg 3756

<210> 25

<211> 4956

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 25

gtaagaacag tatgaagaaa agagatgaag cctctgtctt ttttacatgt taacagtctc 60

atattagtcc ttcagaataa ttctacaatc ctaaaataac ttagccaact tgctgaattg 120

tattacggca aggtttatat gaattcatga ctgatattta gcaaatgatt aattaatatg 180

ttaataaaat gtagccaaaa caatatctta ccttaatgcc tcaatttgta gatctcggta 240

tttgtgaaat aataacgtaa acttcgttta aaaggattct tcttcctgtc tttgagaaag 300

tacggcactg tgcaggggga gaggttgatt gtgaaaaatc agaggtagat gagaatctta 360

ctgagggctg agggttcttt aaccttggtg gatctcaaca ttggttgcac attaaaatca 420

cctgctgcaa gcccttgacg aatcttactt agaagatgac aacacagaac aattaaatca 480

gaatctctgg ggagaatagg gcaccagtat tttttgagct cccaccatga ttccaaagtg 540

cagccaaatt tgagaaccac tgctaaaagc tcaagcttca gattgaccag cttttccatc 600

tcacctatcg cctaaagacc aaattggata aatgtgttca ttacgacaga tgggtactat 660

ttaaagatga gtaaacacaa tatacttagg ctcgtcagac tgagagtttt aatcatcact 720

gaggaaaaac atagatatct aatactgact ggagtattag tcaaggctta tttcacacac 780

aattttatca gaaaccaaag tagtttaaaa cagctctccc cttattagta atgcattgga 840

gggtttactt taccatgtac cttgctgagc actgtacctt gttaatctca tttacttgta 900

atgagaacca cacagcgggt agttttattg gttctatttt acctacatga caaaactgaa 960

gcataaaaac acttagtaag ttttcagtgt catgcacaac taggaagtga catggccaga 1020

atataagccc agtcaccatc actctataac ctgcgctttt aacaacttca gggcatgaca 1080

catttggccg gtcagtagaa cccatgctgt gatttgtttt tgcagtggtg gtgatgactg 1140

ccttgttgaa tccacttttt attctattcc attttgggga cacaattctg caagatgatt 1200

cttcattagg aaacagagat gagttattga ccaacacaga aagaaaaaga gtttgttgct 1260

ccacactggg attaaaccta tgatcttggc ctaattaaca ctagctagta agtgtccaag 1320

ctgatcatct ctacaacatt tcaataacag aaaacaacaa ttttcaaaat tagttactta 1380

caattatgta gaaatgcctc taaaacacag tattttcctt atattacaaa aacaaaaatt 1440

ataattggtt ttgtcctctt ttgagagttt gcatggtgtt actccctgca tagtgaagaa 1500

aacattttat ttaagtagat ggatctaagt ttttcatgaa caaaggaatg acatttgaaa 1560

tcaatcctac cctagtccag gagaatgcat tagattaacc tagtagaggt cttatttcac 1620

cctgagtttt ctatgatcgt gattctctgc tggaggagta attgtgaaat agatctctct 1680

gggaactggc ttcctagtcc aatcagctct tttaccaatg aacacttcct tgtgatatag 1740

atgtttatgg ccgagaggat ccagtatatt aataaaatcc ctttttgtat tcaatgaggg 1800

aaacacataa ttttcatcaa ttagcagctt attggaatat ctgcatgatg gtttaacact 1860

tttaagtgtt gactaaagat taattttaca gaaaatagaa aaagaaatat gtttctgtct 1920

ggaggaatga tttattgttg acccctaaat tgaaatattt tactagtggc ttaatggaaa 1980

gatgatgaaa gatgatgaaa ttaatgtaga agcttaacta gaaaatcagg tgacctgata 2040

tctacatctg tatccttcat tggccaccca gcattcatta atgaatcaga tgatggaata 2100

gatcaagttt cctaggaaca cagtgaatat taaaagaaaa caaagggagc ctagcaccta 2160

gaagacctag tttatatttc aaagtatatt tggatgtaac ccaattttaa acatttcctc 2220

acttgtctct cttaaagcct tgccaacagc aaggacagag aaccaaaaat agtgtatata 2280

tgaataaatg cttattacag aatctgctga ctggcacatg ctttgtgtgt aatgggttct 2340

cataaacact tgttgaatga acacacataa gtgaaagagc atggctaggc ttcatccctt 2400

ggtcaaatat ggggtgctaa agaaaagcag gggaaataca ttgggacact aacaaaaaaa 2460

aacagttaat ttaggtaaaa gataaaatac accacagaat gaagaaaaga gatgacccag 2520

actgctcttt aaccttcatg tcctagagag gtttttgata tgaattgcat tcagaattgt 2580

ggaaaggagc ccatcttttc tcttcatttt gattttatta actccaatgg gggaatttta 2640

ttcgtgtttt ggccatatct acttttgatt tctacattat tctctcttcc tttctacctg 2700

tatttgtcct aataaattgt tgacttatta attcactact tcctcacagc ttttttttgg 2760

ctttacaaat ccactggaaa ggtatatggg tgtatcactt tgtgtatttc ggtgtgcatg 2820

tgtagagggg acaaaaatcc tctctcaaac tataaatatt gagtatttgt gtattgaaca 2880

tttgctataa ctactaggtt tcttaaataa tcttaatata taaaatgata tagaaaaagg 2940

gaaattatag ttcgtattat tcatctaagt gaagagatta aaacccaggg agtaaataaa 3000

ttgtctaagg actaaggttg tatactattt aggtgataga tatggggcaa ccgtatgggt 3060

tttatgatta acaaataaac ttctcaccac tctaccatat caacttttcc ataaaagaga 3120

gctatagtat tctttgctta aataaatttg attagtgcat gacttcttga aaacatataa 3180

agcaaaagtc acatttgatt ctatcagaaa agtgagtaag ccatggccca aacaaaagat 3240

gcattaaaat attctggaat gatggagcta aaagtaagaa aaatgacttt ttaaaaaagt 3300

ttactgttag gaattgtgaa attatgctga attttagttg cattataatt tttgtcagtc 3360

atacggtctg acaacctgtc ttatttctat ttccccatat gaggaatgct agttaagtat 3420

ggatattaac tattactact tagatgcatt gaagttgcat aatatggata atacttcact 3480

ggttccctga aaatgtttag ttagtaataa gtctcttaca ctatttgttt tgtccaataa 3540

tttatatttt ctgaagactt aactctagaa tacactcatg tcaaaatgaa agaatttcat 3600

tgcaaaatat tgcttggtac atgacgcata cctgtatttg ttttgtgtca caacatgaaa 3660

aatgatggtt tattagaagt ttcattgggt aggaaacaca tttgaatggt atttactaag 3720

atactaaaat ccttggactt cactctaatt ttagtgccat ttagaactca aggtctcagt 3780

aaaagtagaa ataaagcctg ttaacaaaac acaaactgaa tattaaaaat gtaactggat 3840

tttcaaagaa atgtttactg gtattacctg tagatgtata ttctttatta tgatcttttg 3900

tgtaaagtct ggcagacaaa tgcaatatct aattgttgag tccaatatca caagcagtac 3960

aaaagtataa aaaagacttg gccttttcta atgtgttaaa atactttatg ctggtaataa 4020

cactaagagt agggcactag aaattttaag tgaagataat gtgttgcagt tactgcactc 4080

aatggcttac tattataaac caaaactggg atcactaagc tccagtcagt caaaatgatc 4140

aaaattattg aagagaataa gcaattctgt tctttattag gacacagtag atacagacta 4200

caaagtggag tgtgcttaat aagaggtagc atttgttaag tgtcaattac tctattatcc 4260

cttggagctt ctcaaaataa ccatataagg tgtaagatgt taaaggttat ggttacactc 4320

agtgcacagg taagctaata ggctgagaga agctaaatta cttactgggg tctcacagta 4380

agaaagtgag ctgaagtttc agcccagatt taactggatt ctgggctctt tattcatgtt 4440

acttcatgaa tctgtttctc aattgtgcag aaaaaagggg gctatttata agaaaagcaa 4500

taaacaaaca agtaatgatc tcaaataagt aatgcaagaa atagtgagat ttcaaaatca 4560

gtggcagcga tttctcagtt ctgtcctaag tggccttgct caatcacctg ctatctttta 4620

gtggagcttt gaaattatgt ttcagacaac ttcgattcag ttctagaatg tttgactcag 4680

caaattcaca ggctcatctt tctaacttga tggtgaatat ggaaattcag ctaaatggat 4740

gttaataaaa ttcaaacgtt ttaaggacag atggaaatga cagaatttta aggtaaaata 4800

tatgaaggaa tataagataa aggatttttc taccttcagc aaaaacatac ccactaatta 4860

gtaaaattaa taggcgaaaa aaagttgcat gctcttatac tgtaatgatt atcattttaa 4920

aactagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaaga 4956

<210> 26

<211> 7113

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 26

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa 780

agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct 840

tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat 900

cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat 960

cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag 1020

tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca 1080

tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact 1140

atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca 1200

ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac 1260

acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg 1320

gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg 1380

taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg 1440

aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca 1500

gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga 1560

cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac 1620

tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga 1680

ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg 1740

ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca 1800

agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact 1860

tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa 1920

ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag 1980

aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga 2040

aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc 2100

accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct 2160

ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat 2220

agatgtttat ggccgagagg atccagtata ttaataaaat ccctttttgt attcaatgag 2280

ggaaacacat aattttcatc aattagcagc ttattggaat atctgcatga tggtttaaca 2340

cttttaagtg ttgactaaag attaatttta cagaaaatag aaaaagaaat atgtttctgt 2400

ctggaggaat gatttattgt tgacccctaa attgaaatat tttactagtg gcttaatgga 2460

aagatgatga aagatgatga aattaatgta gaagcttaac tagaaaatca ggtgacctga 2520

tatctacatc tgtatccttc attggccacc cagcattcat taatgaatca gatgatggaa 2580

tagatcaagt ttcctaggaa cacagtgaat attaaaagaa aacaaaggga gcctagcacc 2640

tagaagacct agtttatatt tcaaagtata tttggatgta acccaatttt aaacatttcc 2700

tcacttgtct ctcttaaagc cttgccaaca gcaaggacag agaaccaaaa atagtgtata 2760

tatgaataaa tgcttattac agaatctgct gactggcaca tgctttgtgt gtaatgggtt 2820

ctcataaaca cttgttgaat gaacacacat aagtgaaaga gcatggctag gcttcatccc 2880

ttggtcaaat atggggtgct aaagaaaagc aggggaaata cattgggaca ctaacaaaaa 2940

aaaacagtta atttaggtaa aagataaaat acaccacaga atgaagaaaa gagatgaccc 3000

agactgctct ttaaccttca tgtcctagag aggtttttga tatgaattgc attcagaatt 3060

gtggaaagga gcccatcttt tctcttcatt ttgattttat taactccaat gggggaattt 3120

tattcgtgtt ttggccatat ctacttttga tttctacatt attctctctt cctttctacc 3180

tgtatttgtc ctaataaatt gttgacttat taattcacta cttcctcaca gctttttttt 3240

ggctttacaa atccactgga aaggtatatg ggtgtatcac tttgtgtatt tcggtgtgca 3300

tgtgtagagg ggacaaaaat cctctctcaa actataaata ttgagtattt gtgtattgaa 3360

catttgctat aactactagg tttcttaaat aatcttaata tataaaatga tatagaaaaa 3420

gggaaattat agttcgtatt attcatctaa gtgaagagat taaaacccag ggagtaaata 3480

aattgtctaa ggactaaggt tgtatactat ttaggtgata gatatggggc aaccgtatgg 3540

gttttatgat taacaaataa acttctcacc actctaccat atcaactttt ccataaaaga 3600

gagctatagt attctttgct taaataaatt tgattagtgc atgacttctt gaaaacatat 3660

aaagcaaaag tcacatttga ttctatcaga aaagtgagta agccatggcc caaacaaaag 3720

atgcattaaa atattctgga atgatggagc taaaagtaag aaaaatgact ttttaaaaaa 3780

gtttactgtt aggaattgtg aaattatgct gaattttagt tgcattataa tttttgtcag 3840

tcatacggtc tgacaacctg tcttatttct atttccccat atgaggaatg ctagttaagt 3900

atggatatta actattacta cttagatgca ttgaagttgc ataatatgga taatacttca 3960

ctggttccct gaaaatgttt agttagtaat aagtctctta cactatttgt tttgtccaat 4020

aatttatatt ttctgaagac ttaactctag aatacactca tgtcaaaatg aaagaatttc 4080

attgcaaaat attgcttggt acatgacgca tacctgtatt tgttttgtgt cacaacatga 4140

aaaatgatgg tttattagaa gtttcattgg gtaggaaaca catttgaatg gtatttacta 4200

agatactaaa atccttggac ttcactctaa ttttagtgcc atttagaact caaggtctca 4260

gtaaaagtag aaataaagcc tgttaacaaa acacaaactg aatattaaaa atgtaactgg 4320

attttcaaag aaatgtttac tggtattacc tgtagatgta tattctttat tatgatcttt 4380

tgtgtaaagt ctggcagaca aatgcaatat ctaattgttg agtccaatat cacaagcagt 4440

acaaaagtat aaaaaagact tggccttttc taatgtgtta aaatacttta tgctggtaat 4500

aacactaaga gtagggcact agaaatttta agtgaagata atgtgttgca gttactgcac 4560

tcaatggctt actattataa accaaaactg ggatcactaa gctccagtca gtcaaaatga 4620

tcaaaattat tgaagagaat aagcaattct gttctttatt aggacacagt agatacagac 4680

tacaaagtgg agtgtgctta ataagaggta gcatttgtta agtgtcaatt actctattat 4740

cccttggagc ttctcaaaat aaccatataa ggtgtaagat gttaaaggtt atggttacac 4800

tcagtgcaca ggtaagctaa taggctgaga gaagctaaat tacttactgg ggtctcacag 4860

taagaaagtg agctgaagtt tcagcccaga tttaactgga ttctgggctc tttattcatg 4920

ttacttcatg aatctgtttc tcaattgtgc agaaaaaagg gggctattta taagaaaagc 4980

aataaacaaa caagtaatga tctcaaataa gtaatgcaag aaatagtgag atttcaaaat 5040

cagtggcagc gatttctcag ttctgtccta agtggccttg ctcaatcacc tgctatcttt 5100

tagtggagct ttgaaattat gtttcagaca acttcgattc agttctagaa tgtttgactc 5160

agcaaattca caggctcatc tttctaactt gatggtgaat atggaaattc agctaaatgg 5220

atgttaataa aattcaaacg ttttaaggac agatggaaat gacagaattt taaggtaaaa 5280

tatatgaagg aatataagat aaaggatttt tctaccttca gcaaaaacat acccactaat 5340

tagtaaaatt aataggcgaa aaaaagttgc atgctcttat actgtaatga ttatcatttt 5400

aaaactagct ttttgccttc gagctatcgg ggtaaagacc tacaggaaaa ctactgtcga 5460

aatcctcgag gggaagaagg gggaccctgg tgtttcacaa gcaatccaga ggtacgctac 5520

gaagtctgtg acattcctca gtgttcagaa gttgaatgca tgacctgcaa tggggagagt 5580

tatcgaggtc tcatggatca tacagaatca ggcaagattt gtcagcgctg ggatcatcag 5640

acaccacacc ggcacaaatt cttgcctgaa agatatcccg acaagggctt tgatgataat 5700

tattgccgca atcccgatgg ccagccgagg ccatggtgct atactcttga ccctcacacc 5760

cgctgggagt actgtgcaat taaaacatgc gctgacaata ctatgaatga cactgatgtt 5820

cctttggaaa caactgaatg catccaaggt caaggagaag gctacagggg cactgtcaat 5880

accatttgga atggaattcc atgtcagcgt tgggattctc agtatcctca cgagcatgac 5940

atgactcctg aaaatttcaa gtgcaaggac ctacgagaaa attactgccg aaatccagat 6000

gggtctgaat caccctggtg ttttaccact gatccaaaca tccgagttgg ctactgctcc 6060

caaattccaa actgtgatat gtcacatgga caagattgtt atcgtgggaa tggcaaaaat 6120

tatatgggca acttatccca aacaagatct ggactaacat gttcaatgtg ggacaagaac 6180

atggaagact tacatcgtca tatcttctgg gaaccagatg caagtaagct gaatgagaat 6240

tactgccgaa atccagatga tgatgctcat ggaccctggt gctacacggg aaatccactc 6300

attccttggg attattgccc tatttctcgt tgtgaaggtg ataccacacc tacaatagtc 6360

aatttagacc atcccgtaat atcttgtgcc aaaacgaaac aattgcgagt tgtaaatggg 6420

attccaacac gaacaaacat aggatggatg gttagtttga gatacagaaa taaacatatc 6480

tgcggaggat cattgataaa ggagagttgg gttcttactg cacgacagtg tttcccttct 6540

cgagacttga aagattatga agcttggctt ggaattcatg atgtccacgg aagaggagat 6600

gagaaatgca aacaggttct caatgtttcc cagctggtat atggccctga aggatcagat 6660

ctggttttaa tgaagcttgc caggcctgct gtcctggatg attttgttag tacgattgat 6720

ttacctaatt atggatgcac aattcctgaa aagaccagtt gcagtgttta tggctggggc 6780

tacactggat tgatcaacta tgatggccta ttacgagtgg cacatctcta tataatggga 6840

aatgagaaat gcagccagca tcatcgaggg aaggtgactc tgaatgagtc tgaaatatgt 6900

gctggggctg aaaagattgg atcaggacca tgtgaggggg attatggtgg cccacttgtt 6960

tgtgagcaac ataaaatgag aatggttctt ggtgtcattg ttcctggtcg tggatgtgcc 7020

attccaaatc gtcctggtat ttttgtccga gtagcatatt atgcaaaatg gatacacaaa 7080

attattttaa catataaggt accacagtca tag 7113

<210> 27

<211> 6190

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 27

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa 780

agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct 840

tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat 900

cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat 960

cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag 1020

tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca 1080

tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact 1140

atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca 1200

ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac 1260

acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg 1320

gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg 1380

taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg 1440

aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca 1500

gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga 1560

cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac 1620

tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga 1680

ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg 1740

ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca 1800

agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact 1860

tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa 1920

ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag 1980

aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga 2040

aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc 2100

accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct 2160

ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat 2220

agatgtttat ggccgagagg atctcttcct ttctacctgt atttgtccta ataaattgtt 2280

gacttattaa ttcactactt cctcacagct tttttttggc tttacaaatc cactggaaag 2340

gtatatgggt gtatcacttt gtgtatttcg gtgtgcatgt gtagagggga caaaaatcct 2400

ctctcaaact ataaatattg agtatttgtg tattgaacat ttgctataac tactaggttt 2460

cttaaataat cttaatatat aaaatgatat agaaaaaggg aaattatagt tcgtattatt 2520

catctaagtg aagagattaa aacccaggga gtaaataaat tgtctaagga ctaaggttgt 2580

atactattta ggtgatagat atggggcaac cgtatgggtt ttatgattaa caaataaact 2640

tctcaccact ctaccatatc aacttttcca taaaagagag ctatagtatt ctttgcttaa 2700

ataaatttga ttagtgcatg acttcttgaa aacatataaa gcaaaagtca catttgattc 2760

tatcagaaaa gtgagtaagc catggcccaa acaaaagatg cattaaaata ttctggaatg 2820

atggagctaa aagtaagaaa aatgactttt taaaaaagtt tactgttagg aattgtgaaa 2880

ttatgctgaa ttttagttgc attataattt ttgtcagtca tacggtctga caacctgtct 2940

tatttctatt tccccatatg aggaatgcta gttaagtatg gatattaact attactactt 3000

agatgcattg aagttgcata atatggataa tacttcactg gttccctgaa aatgtttagt 3060

tagtaataag tctcttacac tatttgtttt gtccaataat ttatattttc tgaagactta 3120

actctagaat acactcatgt caaaatgaaa gaatttcatt gcaaaatatt gcttggtaca 3180

tgacgcatac ctgtatttgt tttgtgtcac aacatgaaaa atgatggttt attagaagtt 3240

tcattgggta ggaaacacat ttgaatggta tttactaaga tactaaaatc cttggacttc 3300

actctaattt tagtgccatt tagaactcaa ggtctcagta aaagtagaaa taaagcctgt 3360

taacaaaaca caaactgaat attaaaaatg taactggatt ttcaaagaaa tgtttactgg 3420

tattacctgt agatgtatat tctttattat gatcttttgt gtaaagtctg gcagacaaat 3480

gcaatatcta attgttgagt ccaatatcac aagcagtaca aaagtataaa aaagacttgg 3540

ccttttctaa tgtgttaaaa tactttatgc tggtaataac actaagagta gggcactaga 3600

aattttaagt gaagataatg tgttgcagtt actgcactca atggcttact attataaacc 3660

aaaactggga tcactaagct ccagtcagtc aaaatgatca aaattattga agagaataag 3720

caattctgtt ctttattagg acacagtaga tacagactac aaagtggagt gtgcttaata 3780

agaggtagca tttgttaagt gtcaattact ctattatccc ttggagcttc tcaaaataac 3840

catataaggt gtaagatgtt aaaggttatg gttacactca gtgcacaggt aagctaatag 3900

gctgagagaa gctaaattac ttactggggt ctcacagtaa gaaagtgagc tgaagtttca 3960

gcccagattt aactggattc tgggctcttt attcatgtta cttcatgaat ctgtttctca 4020

attgtgcaga aaaaaggggg ctatttataa gaaaagcaat aaacaaacaa gtaatgatct 4080

caaataagta atgcaagaaa tagtgagatt tcaaaatcag tggcagcgat ttctcagttc 4140

tgtcctaagt ggccttgctc aatcacctgc tatcttttag tggagctttg aaattatgtt 4200

tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc aaattcacag gctcatcttt 4260

ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg ttaataaaat tcaaacgttt 4320

taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat atgaaggaat ataagataaa 4380

ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag taaaattaat aggcgaaaaa 4440

aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa actagctttt tgccttcgag 4500

ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat cctcgagggg aagaaggggg 4560

accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa gtctgtgaca ttcctcagtg 4620

ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat cgaggtctca tggatcatac 4680

agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca ccacaccggc acaaattctt 4740

gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat tgccgcaatc ccgatggcca 4800

gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc tgggagtact gtgcaattaa 4860

aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct ttggaaacaa ctgaatgcat 4920

ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc atttggaatg gaattccatg 4980

tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg actcctgaaa atttcaagtg 5040

caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg tctgaatcac cctggtgttt 5100

taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa attccaaact gtgatatgtc 5160

acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat atgggcaact tatcccaaac 5220

aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg gaagacttac atcgtcatat 5280

cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac tgccgaaatc cagatgatga 5340

tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt ccttgggatt attgccctat 5400

ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat ttagaccatc ccgtaatatc 5460

ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt ccaacacgaa caaacatagg 5520

atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc ggaggatcat tgataaagga 5580

gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga gacttgaaag attatgaagc 5640

ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag aaatgcaaac aggttctcaa 5700

tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg gttttaatga agcttgccag 5760

gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta cctaattatg gatgcacaat 5820

tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac actggattga tcaactatga 5880

tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat gagaaatgca gccagcatca 5940

tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct ggggctgaaa agattggatc 6000

aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt gagcaacata aaatgagaat 6060

ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt ccaaatcgtc ctggtatttt 6120

tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt attttaacat ataaggtacc 6180

acagtcatag 6190

<210> 28

<211> 5190

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 28

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa 780

agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct 840

tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat 900

cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat 960

cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag 1020

tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca 1080

tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact 1140

atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca 1200

ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac 1260

acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg 1320

gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg 1380

taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg 1440

aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca 1500

gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga 1560

cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac 1620

tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga 1680

ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg 1740

ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca 1800

agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact 1860

tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa 1920

ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag 1980

aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga 2040

aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc 2100

accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct 2160

ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat 2220

agatgtttat ggccgagagg atcctgggta ggaaacacat ttgaatggta tttactaaga 2280

tactaaaatc cttggacttc actctaattt tagtgccatt tagaactcaa ggtctcagta 2340

aaagtagaaa taaagcctgt taacaaaaca caaactgaat attaaaaatg taactggatt 2400

ttcaaagaaa tgtttactgg tattacctgt agatgtatat tctttattat gatcttttgt 2460

gtaaagtctg gcagacaaat gcaatatcta attgttgagt ccaatatcac aagcagtaca 2520

aaagtataaa aaagacttgg ccttttctaa tgtgttaaaa tactttatgc tggtaataac 2580

actaagagta gggcactaga aattttaagt gaagataatg tgttgcagtt actgcactca 2640

atggcttact attataaacc aaaactggga tcactaagct ccagtcagtc aaaatgatca 2700

aaattattga agagaataag caattctgtt ctttattagg acacagtaga tacagactac 2760

aaagtggagt gtgcttaata agaggtagca tttgttaagt gtcaattact ctattatccc 2820

ttggagcttc tcaaaataac catataaggt gtaagatgtt aaaggttatg gttacactca 2880

gtgcacaggt aagctaatag gctgagagaa gctaaattac ttactggggt ctcacagtaa 2940

gaaagtgagc tgaagtttca gcccagattt aactggattc tgggctcttt attcatgtta 3000

cttcatgaat ctgtttctca attgtgcaga aaaaaggggg ctatttataa gaaaagcaat 3060

aaacaaacaa gtaatgatct caaataagta atgcaagaaa tagtgagatt tcaaaatcag 3120

tggcagcgat ttctcagttc tgtcctaagt ggccttgctc aatcacctgc tatcttttag 3180

tggagctttg aaattatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc 3240

aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg 3300

ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat 3360

atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag 3420

taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa 3480

actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 3540

cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 3600

gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat 3660

cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca 3720

ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 3780

tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc 3840

tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct 3900

ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc 3960

atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg 4020

actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg 4080

tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa 4140

attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat 4200

atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg 4260

gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac 4320

tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt 4380

ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat 4440

ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt 4500

ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 4560

ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 4620

gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 4680

aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 4740

gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta 4800

cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac 4860

actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat 4920

gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct 4980

ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt 5040

gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt 5100

ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt 5160

attttaacat ataaggtacc acagtcatag 5190

<210> 29

<211> 4241

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 29

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgaa ataataacgt aaacttcgtt taaaaggatt cttcttcctg tctttgagaa 780

agtacggcac tgtgcagggg gagaggttga ttgtgaaaaa tcagaggtag atgagaatct 840

tactgagggc tgagggttct ttaaccttgg tggatctcaa cattggttgc acattaaaat 900

cacctgctgc aagcccttga cgaatcttac ttagaagatg acaacacaga acaattaaat 960

cagaatctct ggggagaata gggcaccagt attttttgag ctcccaccat gattccaaag 1020

tgcagccaaa tttgagaacc actgctaaaa gctcaagctt cagattgacc agcttttcca 1080

tctcacctat cgcctaaaga ccaaattgga taaatgtgtt cattacgaca gatgggtact 1140

atttaaagat gagtaaacac aatatactta ggctcgtcag actgagagtt ttaatcatca 1200

ctgaggaaaa acatagatat ctaatactga ctggagtatt agtcaaggct tatttcacac 1260

acaattttat cagaaaccaa agtagtttaa aacagctctc cccttattag taatgcattg 1320

gagggtttac tttaccatgt accttgctga gcactgtacc ttgttaatct catttacttg 1380

taatgagaac cacacagcgg gtagttttat tggttctatt ttacctacat gacaaaactg 1440

aagcataaaa acacttagta agttttcagt gtcatgcaca actaggaagt gacatggcca 1500

gaatataagc ccagtcacca tcactctata acctgcgctt ttaacaactt cagggcatga 1560

cacatttggc cggtcagtag aacccatgct gtgatttgtt tttgcagtgg tggtgatgac 1620

tgccttgttg aatccacttt ttattctatt ccattttggg gacacaattc tgcaagatga 1680

ttcttcatta ggaaacagag atgagttatt gaccaacaca gaaagaaaaa gagtttgttg 1740

ctccacactg ggattaaacc tatgatcttg gcctaattaa cactagctag taagtgtcca 1800

agctgatcat ctctacaaca tttcaataac agaaaacaac aattttcaaa attagttact 1860

tacaattatg tagaaatgcc tctaaaacac agtattttcc ttatattaca aaaacaaaaa 1920

ttataattgg ttttgtcctc ttttgagagt ttgcatggtg ttactccctg catagtgaag 1980

aaaacatttt atttaagtag atggatctaa gtttttcatg aacaaaggaa tgacatttga 2040

aatcaatcct accctagtcc aggagaatgc attagattaa cctagtagag gtcttatttc 2100

accctgagtt ttctatgatc gtgattctct gctggaggag taattgtgaa atagatctct 2160

ctgggaactg gcttcctagt ccaatcagct cttttaccaa tgaacacttc cttgtgatat 2220

agatgtttat ggccgagagg atccttatgt ttcagacaac ttcgattcag ttctagaatg 2280

tttgactcag caaattcaca ggctcatctt tctaacttga tggtgaatat ggaaattcag 2340

ctaaatggat gttaataaaa ttcaaacgtt ttaaggacag atggaaatga cagaatttta 2400

aggtaaaata tatgaaggaa tataagataa aggatttttc taccttcagc aaaaacatac 2460

ccactaatta gtaaaattaa taggcgaaaa aaagttgcat gctcttatac tgtaatgatt 2520

atcattttaa aactagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaagaccta caggaaaact 2580

actgtcgaaa tcctcgaggg gaagaagggg gaccctggtg tttcacaagc aatccagagg 2640

tacgctacga agtctgtgac attcctcagt gttcagaagt tgaatgcatg acctgcaatg 2700

gggagagtta tcgaggtctc atggatcata cagaatcagg caagatttgt cagcgctggg 2760

atcatcagac accacaccgg cacaaattct tgcctgaaag atatcccgac aagggctttg 2820

atgataatta ttgccgcaat cccgatggcc agccgaggcc atggtgctat actcttgacc 2880

ctcacacccg ctgggagtac tgtgcaatta aaacatgcgc tgacaatact atgaatgaca 2940

ctgatgttcc tttggaaaca actgaatgca tccaaggtca aggagaaggc tacaggggca 3000

ctgtcaatac catttggaat ggaattccat gtcagcgttg ggattctcag tatcctcacg 3060

agcatgacat gactcctgaa aatttcaagt gcaaggacct acgagaaaat tactgccgaa 3120

atccagatgg gtctgaatca ccctggtgtt ttaccactga tccaaacatc cgagttggct 3180

actgctccca aattccaaac tgtgatatgt cacatggaca agattgttat cgtgggaatg 3240

gcaaaaatta tatgggcaac ttatcccaaa caagatctgg actaacatgt tcaatgtggg 3300

acaagaacat ggaagactta catcgtcata tcttctggga accagatgca agtaagctga 3360

atgagaatta ctgccgaaat ccagatgatg atgctcatgg accctggtgc tacacgggaa 3420

atccactcat tccttgggat tattgcccta tttctcgttg tgaaggtgat accacaccta 3480

caatagtcaa tttagaccat cccgtaatat cttgtgccaa aacgaaacaa ttgcgagttg 3540

taaatgggat tccaacacga acaaacatag gatggatggt tagtttgaga tacagaaata 3600

aacatatctg cggaggatca ttgataaagg agagttgggt tcttactgca cgacagtgtt 3660

tcccttctcg agacttgaaa gattatgaag cttggcttgg aattcatgat gtccacggaa 3720

gaggagatga gaaatgcaaa caggttctca atgtttccca gctggtatat ggccctgaag 3780

gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca ggcctgctgt cctggatgat tttgttagta 3840

cgattgattt acctaattat ggatgcacaa ttcctgaaaa gaccagttgc agtgtttatg 3900

gctggggcta cactggattg atcaactatg atggcctatt acgagtggca catctctata 3960

taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc atcgagggaa ggtgactctg aatgagtctg 4020

aaatatgtgc tggggctgaa aagattggat caggaccatg tgagggggat tatggtggcc 4080

cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa tggttcttgg tgtcattgtt cctggtcgtg 4140

gatgtgccat tccaaatcgt cctggtattt ttgtccgagt agcatattat gcaaaatgga 4200

tacacaaaat tattttaaca tataaggtac cacagtcata g 4241

<210> 30

<211> 5602

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 30

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tccagtatat taataaaatc cctttttgta ttcaatgagg gaaacacata 780

attttcatca attagcagct tattggaata tctgcatgat ggtttaacac ttttaagtgt 840

tgactaaaga ttaattttac agaaaataga aaaagaaata tgtttctgtc tggaggaatg 900

atttattgtt gacccctaaa ttgaaatatt ttactagtgg cttaatggaa agatgatgaa 960

agatgatgaa attaatgtag aagcttaact agaaaatcag gtgacctgat atctacatct 1020

gtatccttca ttggccaccc agcattcatt aatgaatcag atgatggaat agatcaagtt 1080

tcctaggaac acagtgaata ttaaaagaaa acaaagggag cctagcacct agaagaccta 1140

gtttatattt caaagtatat ttggatgtaa cccaatttta aacatttcct cacttgtctc 1200

tcttaaagcc ttgccaacag caaggacaga gaaccaaaaa tagtgtatat atgaataaat 1260

gcttattaca gaatctgctg actggcacat gctttgtgtg taatgggttc tcataaacac 1320

ttgttgaatg aacacacata agtgaaagag catggctagg cttcatccct tggtcaaata 1380

tggggtgcta aagaaaagca ggggaaatac attgggacac taacaaaaaa aaacagttaa 1440

tttaggtaaa agataaaata caccacagaa tgaagaaaag agatgaccca gactgctctt 1500

taaccttcat gtcctagaga ggtttttgat atgaattgca ttcagaattg tggaaaggag 1560

cccatctttt ctcttcattt tgattttatt aactccaatg ggggaatttt attcgtgttt 1620

tggccatatc tacttttgat ttctacatta ttctctcttc ctttctacct gtatttgtcc 1680

taataaattg ttgacttatt aattcactac ttcctcacag cttttttttg gctttacaaa 1740

tccactggaa aggtatatgg gtgtatcact ttgtgtattt cggtgtgcat gtgtagaggg 1800

gacaaaaatc ctctctcaaa ctataaatat tgagtatttg tgtattgaac atttgctata 1860

actactaggt ttcttaaata atcttaatat ataaaatgat atagaaaaag ggaaattata 1920

gttcgtatta ttcatctaag tgaagagatt aaaacccagg gagtaaataa attgtctaag 1980

gactaaggtt gtatactatt taggtgatag atatggggca accgtatggg ttttatgatt 2040

aacaaataaa cttctcacca ctctaccata tcaacttttc cataaaagag agctatagta 2100

ttctttgctt aaataaattt gattagtgca tgacttcttg aaaacatata aagcaaaagt 2160

cacatttgat tctatcagaa aagtgagtaa gccatggccc aaacaaaaga tgcattaaaa 2220

tattctggaa tgatggagct aaaagtaaga aaaatgactt tttaaaaaag tttactgtta 2280

ggaattgtga aattatgctg aattttagtt gcattataat ttttgtcagt catacggtct 2340

gacaacctgt cttatttcta tttccccata tgaggaatgc tagttaagta tggatattaa 2400

ctattactac ttagatgcat tgaagttgca taatatggat aatacttcac tggttccctg 2460

aaaatgttta gttagtaata agtctcttac actatttgtt ttgtccaata atttatattt 2520

tctgaagact taactctaga atacactcat gtcaaaatga aagaatttca ttgcaaaata 2580

ttgcttggta catgacgcat acctgtattt gttttgtgtc acaacatgaa aaatgatggt 2640

ttattagaag tttcattggg taggaaacac atttgaatgg tatttactaa gatactaaaa 2700

tccttggact tcactctaat tttagtgcca tttagaactc aaggtctcag taaaagtaga 2760

aataaagcct gttaacaaaa cacaaactga atattaaaaa tgtaactgga ttttcaaaga 2820

aatgtttact ggtattacct gtagatgtat attctttatt atgatctttt gtgtaaagtc 2880

tggcagacaa atgcaatatc taattgttga gtccaatatc acaagcagta caaaagtata 2940

aaaaagactt ggccttttct aatgtgttaa aatactttat gctggtaata acactaagag 3000

tagggcacta gaaattttaa gtgaagataa tgtgttgcag ttactgcact caatggctta 3060

ctattataaa ccaaaactgg gatcactaag ctccagtcag tcaaaatgat caaaattatt 3120

gaagagaata agcaattctg ttctttatta ggacacagta gatacagact acaaagtgga 3180

gtgtgcttaa taagaggtag catttgttaa gtgtcaatta ctctattatc ccttggagct 3240

tctcaaaata accatataag gtgtaagatg ttaaaggtta tggttacact cagtgcacag 3300

gtaagctaat aggctgagag aagctaaatt acttactggg gtctcacagt aagaaagtga 3360

gctgaagttt cagcccagat ttaactggat tctgggctct ttattcatgt tacttcatga 3420

atctgtttct caattgtgca gaaaaaaggg ggctatttat aagaaaagca ataaacaaac 3480

aagtaatgat ctcaaataag taatgcaaga aatagtgaga tttcaaaatc agtggcagcg 3540

atttctcagt tctgtcctaa gtggccttgc tcaatcacct gctatctttt agtggagctt 3600

tgaaattatg tttcagacaa cttcgattca gttctagaat gtttgactca gcaaattcac 3660

aggctcatct ttctaacttg atggtgaata tggaaattca gctaaatgga tgttaataaa 3720

attcaaacgt tttaaggaca gatggaaatg acagaatttt aaggtaaaat atatgaagga 3780

atataagata aaggattttt ctaccttcag caaaaacata cccactaatt agtaaaatta 3840

ataggcgaaa aaaagttgca tgctcttata ctgtaatgat tatcatttta aaactagctt 3900

tttgccttcg agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcctcgagg 3960

ggaagaaggg ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga 4020

cattcctcag tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat ggggagagtt atcgaggtct 4080

catggatcat acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg gatcatcaga caccacaccg 4140

gcacaaattc ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt gatgataatt attgccgcaa 4200

tcccgatggc cagccgaggc catggtgcta tactcttgac cctcacaccc gctgggagta 4260

ctgtgcaatt aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc ctttggaaac 4320

aactgaatgc atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc actgtcaata ccatttggaa 4380

tggaattcca tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac gagcatgaca tgactcctga 4440

aaatttcaag tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga aatccagatg ggtctgaatc 4500

accctggtgt tttaccactg atccaaacat ccgagttggc tactgctccc aaattccaaa 4560

ctgtgatatg tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat ggcaaaaatt atatgggcaa 4620

cttatcccaa acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg gacaagaaca tggaagactt 4680

acatcgtcat atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg aatgagaatt actgccgaaa 4740

tccagatgat gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga aatccactca ttccttggga 4800

ttattgccct atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct acaatagtca atttagacca 4860

tcccgtaata tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt gtaaatggga ttccaacacg 4920

aacaaacata ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat aaacatatct gcggaggatc 4980

attgataaag gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt ttcccttctc gagacttgaa 5040

agattatgaa gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga agaggagatg agaaatgcaa 5100

acaggttctc aatgtttccc agctggtata tggccctgaa ggatcagatc tggttttaat 5160

gaagcttgcc aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt acgattgatt tacctaatta 5220

tggatgcaca attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat ggctggggct acactggatt 5280

gatcaactat gatggcctat tacgagtggc acatctctat ataatgggaa atgagaaatg 5340

cagccagcat catcgaggga aggtgactct gaatgagtct gaaatatgtg ctggggctga 5400

aaagattgga tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc ccacttgttt gtgagcaaca 5460

taaaatgaga atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt ggatgtgcca ttccaaatcg 5520

tcctggtatt tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg atacacaaaa ttattttaac 5580

atataaggta ccacagtcat ag 5602

<210> 31

<211> 4680

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 31

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tctcttcctt tctacctgta tttgtcctaa taaattgttg acttattaat 780

ytcactactt cctcacagct tttttttggc tttacaaatc cactggaaag gtatatgggt 840

gtatcacttt gtgtatttcg gtgtgcatgt gtagagggga caaaaatcct ctctcaaact 900

ataaatattg agtatttgtg tattgaacat ttgctataac tactaggttt cttaaataat 960

cttaatatat aaaatgatat agaaaaaggg aaattatagt tcgtattatt catctaagtg 1020

aagagattaa aacccaggga gtaaataaat tgtctaagga ctaaggttgt atactattta 1080

ggtgatagat atggggcaac cgtatgggtt ttatgattaa caaataaact tctcaccact 1140

ctaccatatc aacttttcca taaaagagag ctatagtatt ctttgcttaa ataaatttga 1200

ttagtgcatg acttcttgaa aacatataaa gcaaaagtca catttgattc tatcagaaaa 1260

gtgagtaagc catggcccaa acaaaagatg cattaaaata ttctggaatg atggagctaa 1320

aagtaagaaa aatgactttt taaaaaagtt tactgttagg aattgtgaaa ttatgctgaa 1380

ttttagttgc attataattt ttgtcagtca tacggtctga caacctgtct tatttctatt 1440

tccccatatg aggaatgcta gttaagtatg gatattaact attactactt agatgcattg 1500

aagttgcata atatggataa tacttcactg gttccctgaa aatgtttagt tagtaataag 1560

tctcttacac tatttgtttt gtccaataat ttatattttc tgaagactta actctagaat 1620

acactcatgt caaaatgaaa gaatttcatt gcaaaatatt gcttggtaca tgacgcatac 1680

ctgtatttgt tttgtgtcac aacatgaaaa atgatggttt attagaagtt tcattgggta 1740

ggaaacacat ttgaatggta tttactaaga tactaaaatc cttggacttc actctaattt 1800

tagtgccatt tagaactcaa ggtctcagta aaagtagaaa taaagcctgt taacaaaaca 1860

caaactgaat attaaaaatg taactggatt ttcaaagaaa tgtttactgg tattacctgt 1920

agatgtatat tctttattat gatcttttgt gtaaagtctg gcagacaaat gcaatatcta 1980

attgttgagt ccaatatcac aagcagtaca aaagtataaa aaagacttgg ccttttctaa 2040

tgtgttaaaa tactttatgc tggtaataac actaagagta gggcactaga aattttaagt 2100

gaagataatg tgttgcagtt actgcactca atggcttact attataaacc aaaactggga 2160

tcactaagct ccagtcagtc aaaatgatca aaattattga agagaataag caattctgtt 2220

ctttattagg acacagtaga tacagactac aaagtggagt gtgcttaata agaggtagca 2280

tttgttaagt gtcaattact ctattatccc ttggagcttc tcaaaataac catataaggt 2340

gtaagatgtt aaaggttatg gttacactca gtgcacaggt aagctaatag gctgagagaa 2400

gctaaattac ttactggggt ctcacagtaa gaaagtgagc tgaagtttca gcccagattt 2460

aactggattc tgggctcttt attcatgtta cttcatgaat ctgtttctca attgtgcaga 2520

aaaaaggggg ctatttataa gaaaagcaat aaacaaacaa gtaatgatct caaataagta 2580

atgcaagaaa tagtgagatt tcaaaatcag tggcagcgat ttctcagttc tgtcctaagt 2640

ggccttgctc aatcacctgc tatcttttag tggagctttg aaattatgtt tcagacaact 2700

tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat 2760

ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga 2820

tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat atgaaggaat ataagataaa ggatttttct 2880

accttcagca aaaacatacc cactaattag taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg 2940

ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa actagctttt tgccttcgag ctatcggggt 3000

aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt 3060

ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt 3120

gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc 3180

aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga 3240

tatcccgaca agggctttga tgataattat tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca 3300

tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct 3360

gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa 3420

ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg 3480

gattctcagt atcctcacga gcatgacatg actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta 3540

cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg tctgaatcac cctggtgttt taccactgat 3600

ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa attccaaact gtgatatgtc acatggacaa 3660

gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat atgggcaact tatcccaaac aagatctgga 3720

ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa 3780

ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga 3840

ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt 3900

gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa 3960

acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt 4020

agtttgagat acagaaataa acatatctgc ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt 4080

cttactgcac gacagtgttt cccttctcga gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga 4140

attcatgatg tccacggaag aggagatgag aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag 4200

ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc 4260

ctggatgatt ttgttagtac gattgattta cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag 4320

accagttgca gtgtttatgg ctggggctac actggattga tcaactatga tggcctatta 4380

cgagtggcac atctctatat aatgggaaat gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag 4440

gtgactctga atgagtctga aatatgtgct ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt 4500

gagggggatt atggtggccc acttgtttgt gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt 4560

gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta 4620

gcatattatg caaaatggat acacaaaatt attttaacat ataaggtacc acagtcatag 4680

<210> 32

<211> 2730

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 32

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540

tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600

tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660

tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720

tatttgtgga tccttatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc 780

aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg 840

ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat 900

atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag 960

taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa 1020

actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 1080

cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 1140

gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat 1200

cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca 1260

ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 1320

tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc 1380

tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct 1440

ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc 1500

atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg 1560

actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg 1620

tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa 1680

attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat 1740

atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg 1800

gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac 1860

tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt 1920

ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat 1980

ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt 2040

ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 2100

ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 2160

gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 2220

aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 2280

gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta 2340

cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac 2400

actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat 2460

gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct 2520

ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt 2580

gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt 2640

ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt 2700

attttaacat ataaggtacc acagtcatag 2730

<210> 33

<211> 2187

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 33

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660

ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720

caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780

cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840

gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900

gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960

tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020

cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080

gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140

ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200

ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260

gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320

cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380

tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440

gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca 1500

acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560

ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620

ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa 1680

tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740

ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800

aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860

ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920

aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg 1980

gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040

caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100

aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160

ttaacatata aggtaccaca gtcatag 2187

<210> 34

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер

<400> 34

agctggcaat tccggttcgc ttgctgcgtc agaccccgta 40

<210> 35

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер

<400> 35

tacggggtct gacgcagcaa gcgaaccgga attgccagct 40

<210> 36

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер

<400> 36

ctaatccata acatggctct agacttaagg cagcggcaga 40

<210> 37

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер

<400> 37

tctgccgctg ccttaagtct agagccatgt tatggattag 40

<210> 38

<211> 3250

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 38

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180

ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240

attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300

aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360

gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420

taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480

gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540

cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600

cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660

attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720

aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780

agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840

ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900

cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960

ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020

tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080

tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140

agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200

tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260

cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320

tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatgt cgacctcgag tctagagggc 1380

ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1440

gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 1500

aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 1560

tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggagtcga 1620

aattcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc 1680

gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc 1740

acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat 1800

gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt 1860

cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg 1920

cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg 1980

agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc 2040

aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag 2100

gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc 2160

ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag 2220

ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag 2280

aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg 2340

ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa 2400

tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc 2460

cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc 2520

aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgcgt cagaccccgt 2580

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 2640

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 2700

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta 2760

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 2820

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 2880

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 2940

gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 3000

aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 3060

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 3120

cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 3180

cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 3240

tgctcacatg 3250

<210> 39

<211> 4108

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 39

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 60

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 120

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 180

ctggcctttt gctcacatgc gcgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca 240

attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 300

aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 360

gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 420

taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac 480

gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt acgggacttt 540

cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 600

cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 660

attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 720

aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 780

agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac 840

ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg 900

cggattcccc gtgccaagag tgacgtaagt accgcctata gactctatag gcacacccct 960

ttggctctta tgcatgctat actgtttttg gcttggggcc tatacacccc cgcttcctta 1020

tgctataggt gatggtatag cttagcctat aggtgtgggt tattgaccat tattgaccac 1080

tcccctattg gtgacgatac tttccattac taatccataa catggctcta gacttaaggc 1140

agcggcagaa gaagatgtag gcagctgagt tgttgtattc tgataagagt cagaggtaac 1200

tcccgttgcg gtgctgttaa cggtggaggg cagtgtagtc tgagcagtac tcgttgctgc 1260

cgcgcgcgcc accagacata atagctgaca gactaacaga ctgttccttt ccatgggtct 1320

tttctgcagt caccgtcctt gacacgaagc ttatcgatat gggaaaaatc agcagtcttc 1380

caacccaatt atttaagtgc tgcttttgtg atttcttgaa ggtgaagatg cacaccatgt 1440

cctcctcgca tctcttctac ctggcgctgt gcctgctcac cttcaccagc tctgccacgg 1500

ctggaccgga gacgctctgc ggggctgagc tggtggatgc tcttcagttc gtgtgtggag 1560

acaggggctt ttatttcaac aagcccacag ggtatggctc cagcagtcgg agggcgcctc 1620

agacaggcat cgtggatgag tgctgcttcc ggagctgtga tctaaggagg ctggagatgt 1680

attgcgcacc cctcaagcct gccaagtcag ctcgctctgt ccgtgcccag cgccacaccg 1740

acatgcccaa gacccagaag gtaagcccac ctgggtggga tccagccatc ctcaagtggt 1800

ctctctcttg tgcatgtggg tgggccaagc agaaatcctg ccccatagtc tcctggctta 1860

caagtcagaa aagctccttt gcaccaaagg gatggattac atccccatct ctttgctaaa 1920

caaacatggg ctttggtgtc agacaaaagt gaagtcctgg ctttctcaca caccagctta 1980

gagagaaaag acttttaggt gaatgtggca ggaaagcgtg cttgctgggg caaaggcaga 2040

ttcattcttt ctcttcccag tatcagcccc catctaccaa caagaacacg aagtctcaga 2100

gaaggaaagg aagtacattt gaagaacgca agtagctttt tctcctttat ttataggaag 2160

tacatttgaa gaacgcaagt agagggagtg caggaaacaa gaactacagg atgtaggtcg 2220

acctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt 2280

gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 2340

ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 2400

ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 2460

ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg 2520

ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc 2580

aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc 2640

cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa 2700

gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct 2760

ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac 2820

aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa 2880

tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac 2940

tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag 3000

cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt 3060

cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag 3120

gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc 3180

agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc 3240

cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc 3300

ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt 3360

tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccggttcgct 3420

tgctgcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3480

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3540

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3600

tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3660

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3720

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3780

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3840

acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3900

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3960

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 4020

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 4080

ggccttttgc tggccttttg ctcacatg 4108

<210> 40

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер

<400> 40

tgatctaagg aggctgga 18

<210> 41

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

праймер

<400> 41

ctacttgcgt tcttcaaatg 20

<---

Реферат

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к терапевтическим ДНК-конструкциям, и может быть использовано в медицине для лечения нейропатии. Предложены фармацевтические композиции, включающие экспрессионные ДНК-конструкции, кодирующие человеческую изоформу инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) и человеческую изоформу фактора роста гепатоцитов (HGF). Изобретение обеспечивает эффективное лечение нейропатических пациентов. 2 н. и 8 з. п. ф-лы, 18 ил., 4 табл., 5 пр.

Формула