Композиции и способы, предназначенные для лечения гемоглобинопатий - RU2019127919A

1. Молекула gRNA, содержащая tracr и crRNA, где crRNA содержит нацеливающий домен, который

a) является комплементарным целевой последовательности в пределах геномной последовательности нуклеиновой кислоты в Chr11:5250094-5250237, - нить, hg38;

b) является комплементарным целевой последовательности в пределах геномной последовательности нуклеиновой кислоты в Chr11:5255022-5255164, - нить, hg38;

c) является комплементарным целевой последовательности неделеционного участка HFPH (например, неделеционного участка HPFH человека);

d) является комплементарным целевой последовательности в пределах геномной последовательности нуклеиновой кислоты между Chr11:5249833 и Chr11:5250237, - нить, hg38;

e) является комплементарным целевой последовательности в пределах геномной последовательности нуклеиновой кислоты между Chr11:5254738 и Chr11:5255164, - нить, hg38;

f) является комплементарным целевой последовательности в пределах геномной последовательности нуклеиновой кислоты в Chr11: 5249833-5249927, - нить, hg38;

g) является комплементарным целевой последовательности в пределах геномной последовательности нуклеиновой кислоты в Chr11: 5254738-5254851, - нить, hg38;

h) является комплементарным целевой последовательности в пределах геномной последовательности нуклеиновой кислоты в Chr11:5250139-5250237, - нить, hg38 или

i) их комбинации.

2. Молекула gRNA по п. 1, где нацеливающий домен содержит, например, состоит из, любую из SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 72 или их фрагмент.

3. Молекула gRNA по п. 2, где нацеливающий домен содержит, например, состоит из, любую из SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 или их фрагмент.

4. Молекула gRNA по п. 2, где нацеливающий домен содержит, например, состоит из, любую из

a) SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 51 или их фрагмент; или

b) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 54 или их фрагмент.

5. Молекула gRNA по любому из пп. 2-4, где нацеливающий домен содержит, например, состоит из 17, 18, 19 или 20 последовательных нуклеиновых кислот из любой из указанных последовательностей нацеливающего домена.

6. Молекула gRNA по п. 5, где 17, 18, 19 или 20 последовательных нуклеиновых кислот из любой из указанных последовательностей нацеливающего домена представляют собой 17, 18, 19 или 20 последовательных нуклеиновых кислот, расположенных на 3'-конце указанной последовательности нацеливающего домена.

7. Молекула gRNA по п. 5, где 17, 18, 19 или 20 последовательных нуклеиновых кислот из любой из указанных последовательностей нацеливающего домена представляют собой 17, 18, 19 или 20 последовательных нуклеиновых кислот, расположенных на 5'-конце указанной последовательности нацеливающего домена.

8. Молекула gRNA по п. 5, где 17, 18, 19 или 20 последовательных нуклеиновых кислот из любой из указанных последовательностей нацеливающего домена не содержат нуклеиновую кислоту, расположенную на 5'- или 3'-конце указанной последовательности нацеливающего домена.

9. Молекула gRNA по любому из пп. 2-8, где нацеливающий домен состоит из указанной последовательности нацеливающего домена.

10. Молекула gRNA по любому из пп. 1-9, где нацеливающий домен содержит, например, состоит из, SEQ ID NO: 67.

11. Молекула gRNA по любому из пп. 1-10, где молекула gRNA представляет собой молекулу двойной направляющей РНК.

12. Молекула gRNA по любому из пп. 1-10, где молекула gRNA представляет собой молекулу одиночной направляющей РНК.

13. Молекула gRNA по п. 12, содержащая

(a) SEQ ID NO: 195;

(b) SEQ ID NO: 231 или

(c) любую из (a) или (b), указанных выше, дополнительно содержащую на 3'-конце 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 урациловых (U) нуклеотидов; где последовательность из любой из (a) - (c) расположена в 3'-направлении, необязательно непосредственно в 3'-направлении относительно нацеливающего домена.

14. Молекула gRNA по п. 1, содержащая, например, состоящая из, последовательность:

(a) SEQ ID NO: 174;

(b) SEQ ID NO: 175 или

(c) SEQ ID NO: 176.

15. Молекула gRNA по п. 1, содержащая, например, состоящая из

(a) crRNA, содержащей, например, состоящей из, SEQ ID NO: 177, и tracr, содержащей, например, состоящей из, SEQ ID NO: 224;

(b) crRNA, содержащей, например, состоящей из, SEQ ID NO: 177, и tracr, содержащей, например, состоящей из, SEQ ID NO: 73;

(c) crRNA, содержащей, например, состоящей из, SEQ ID NO: 178, и tracr, содержащей, например, состоящей из, SEQ ID NO: 224; или

(d) crRNA, содержащей, например, состоящей из, SEQ ID NO: 178, и tracr, содержащей, например, состоящей из, SEQ ID NO: 73.

16. Молекула gRNA по любому из пп. 1-15, где

a) если система CRISPR (например, описанный в данном документе RNP), содержащая молекулу gRNA, вводится в клетку, то вставка/делеция образуется в целевой последовательности, комплементарной нацеливающему домену молекулы gRNA, или рядом с целевой последовательностью; и/или

b) если система CRISPR (например, описанный в данном документе RNP), содержащая молекулу gRNA, вводится в клетку, то создается делеция, охватывающая последовательность, например, охватывающая по сути всю последовательность, между последовательностью, комплементарной нацеливающему домену gRNA (например, на по меньшей мере 90% комплементарной нацеливающему домену gRNA, например, полностью комплементарной нацеливающему домену gRNA) в промоторном участке HBG1, и последовательностью, комплементарной нацеливающему домену gRNA (например, на по меньшей мере 90% комплементарной нацеливающему домену gRNA, например, полностью комплементарной нацеливающему домену gRNA) в промоторном участке HBG2.

17. Молекула gRNA по п. 16, где вставка/делеция не охватывает нуклеотид, расположенный между 5250092 и 5249833, - нить (hg38), где необязательно вставка/делеция не охватывает нуклеотид неделеционного HPFH или сайта связывания фактора транскрипции.

18. Молекула gRNA по любому из пп. 1-17, где если система CRISPR (например, описанный в данном документе RNP), содержащая молекулу gRNA, вводится в популяцию клеток, то вставка/делеция образуется в целевой последовательности, комплементарной нацеливающему домену молекулы gRNA, или рядом с целевой последовательностью, в по меньшей мере приблизительно 15%, например, по меньшей мере приблизительно 17%, например, по меньшей мере приблизительно 20%, например, по меньшей мере приблизительно 30%, например, по меньшей мере приблизительно 40%, например, по меньшей мере приблизительно 50%, например, по меньшей мере приблизительно 55%, например, по меньшей мере приблизительно 60%, например, по меньшей мере приблизительно 70%, например, по меньшей мере приблизительно 75% клеток популяции.

19. Молекула gRNA по любому из пп. 1-18, где если система CRISPR (например, описанный в данном документе RNP), содержащая молекулу gRNA, вводится в клетку (например, популяцию клеток), то

(a) экспрессия фетального гемоглобина повышается в указанной клетке или ее потомстве, например, ее эритроидном потомстве, например, ее потомстве, представляющем собой красные кровяные клетки, где необязательно указанная экспрессия фетального гемоглобина повышается на по меньшей мере приблизительно 15%, например, на по меньшей мере приблизительно 17%, например, на по меньшей мере приблизительно 20%, например, на по меньшей мере приблизительно 25%, например, на по меньшей мере приблизительно 30%, например, на по меньшей мере приблизительно 35%, например, на по меньшей мере приблизительно 40%, относительно уровня экспрессии фетального гемоглобина в популяции клеток, в которые молекулу gRNA не вводили, или в популяции их потомства, например, их эритроидного потомства, например, их потомства, представляющего собой красные кровяные клетки;

(b) указанная клетка или популяция клеток или их потомство, например, их эритроидное потомство, например, их потомство, представляющее собой красные кровяные клетки, продуцируют по меньшей мере приблизительно 6 пикограмм (например, по меньшей мере приблизительно 7 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 8 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 9 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 10 пикограмм, или от приблизительно 8 до приблизительно 9 пикограмм, или от приблизительно 9 до приблизительно 10 пикограмм) фетального гемоглобина на клетку;

(c) нецелевые вставки/делеции не образуются в указанной клетке, например, нецелевые вставки/делеции не образуются за пределами промоторных участков HBG1 и/или HBG2, что, например, выявляется с помощью секвенирования нового поколения и/или анализа с помощью вставки нуклеотида; и/или

(d) нецелевая вставка/делеция, например, нецелевая вставка/делеция за пределами промоторных участков HBG1 и/или HBG2, не выявляется в более чем приблизительно 5%, например, в более чем приблизительно 1%, например, в более чем приблизительно 0,1%, например, в более чем приблизительно 0,01% клеток из популяции клеток, что например, выявляется с помощью секвенирования нового поколения и/или анализа с помощью вставки нуклеотида.

20. Молекула gRNA по любому из пп. 16-19, где клетка представляет собой (или популяция клеток содержит) клетку млекопитающего, примата или человека, например, представляет собой клетку человека, где необязательно указанная клетка получена от пациента, страдающего гемоглобинопатией, например, серповидноклеточным заболеванием или талассемией, например, бета-талассемией.

21. Молекула gRNA по п. 20, где клетка представляет собой (или популяция клеток содержит) HSPC, необязательно CD34+ HSPC, необязательно CD34+CD90+ HSPC.

22. Молекула gRNA по любому из пп. 16-21, где клетка является аутологичной или аллогенной по отношению к пациенту, которому назначено введение указанной клетки.

23. Композиция, содержащая

1) одну или несколько молекул gRNA (в том числе первую молекулу gRNA) по любому из пп. 1-22 и молекулу Cas9;

2) одну или несколько молекул gRNA (в том числе первую молекулу gRNA) по любому из пп. 1-22 и нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу Cas9;

3) нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько молекул gRNA (в том числе первую молекулу gRNA) по любому из пп. 1-22, и молекулу Cas9;

4) нуклеиновую кислоту, кодирующую одну или несколько молекул gRNA (в том числе первую молекулу gRNA) по любому из пп. 1-22, и нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу Cas9; или

5) любую из указанных выше 1) - 4) и нуклеиновую кислоту, представляющую собой матрицу; или

6) любую из указанных выше 1) - 4) и нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую нуклеиновую кислоту, представляющую собой матрицу.

24. Композиция, содержащая первую молекулу gRNA по любому из пп. 1-22, которая дополнительно содержит молекулу Cas9, где необязательно молекула Cas9 представляет собой активную или неактивную Cas9 из S. pyogenes, где необязательно молекула Cas9 содержит SEQ ID NO: 205 или последовательность, которая на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична ей.

25. Композиция по пп. 23-24, где молекула Cas9 содержит, например, состоит из

(a) SEQ ID NO: 233;

(b) SEQ ID NO: 234;

(c) SEQ ID NO: 235;

(d) SEQ ID NO: 236;

(e) SEQ ID NO: 237;

(f) SEQ ID NO: 238;

(g) SEQ ID NO: 239;

(h) SEQ ID NO: 240;

(i) SEQ ID NO: 241;

(j) SEQ ID NO: 242;

(k) SEQ ID NO: 243 или

(l) SEQ ID NO: 244.

26. Композиция по любому из пп. 23-25, где первая молекула gRNA и молекула Cas9 присутствуют в рибонуклеарном белковом комплексе (RNP).

27. Композиция по любому из пп. 23-26, составленная в среде, подходящей для электропорации.

28. Композиция по любому из пп. 23-27, где каждая из указанных молекул gRNA находится в RNP с молекулой Cas9, описанной в данном документе, и где каждый из указанного RNP находится в концентрации, составляющей менее приблизительно 10 мкМ, например, менее приблизительно 3 мкМ, например, менее приблизительно 1 мкМ, например, менее приблизительно 0,5 мкМ, например, менее приблизительно 0,3 мкМ, например, менее приблизительно 0,1 мкМ, где необязательно концентрация указанного RNP составляет приблизительно 2 мкМ или составляет приблизительно 1 мкМ, где необязательно композиция дополнительно содержит популяцию клеток, например, HSPC.

29. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует одну или несколько молекул gRNA по любому из пп. 1-22.

30. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 29, где необязательно указанный вектор выбран из группы, состоящей из лентивирусного вектора, аденовирусного вектора, вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), вектора на основе вируса простого герпеса (HSV), плазмиды, миникольца, наноплазмиды и РНК-вектора.

31. Способ изменения клетки (например, популяции клеток), (например, изменения структуры (например, последовательности) нуклеиновой кислоты) в целевой последовательности или рядом с ней в пределах указанной клетки, предусматривающий приведение в контакт (например, введение в указанную клетку) указанной клетки (например, популяции клеток) с

1) одной или несколькими молекулами gRNA по любому из пп. 1-22 и молекулой Cas9;

2) одной или несколькими молекулами gRNA по любому из пп. 1-22 и нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу Cas9;

3) нуклеиновой кислотой, кодирующей одну или несколько молекул gRNA по любому из пп. 1-22, и молекулой Cas9;

4) нуклеиновой кислотой, кодирующей одну или несколько молекул gRNA по любому из пп. 1-22, и нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу Cas9;

5) любой из указанных выше 1) - 4) и нуклеиновой кислотой, представляющей собой матрицу;

6) любой из указанных выше 1) - 4) и нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, кодирующую нуклеиновую кислоту, представляющую собой матрицу;

7) композицией по любому из пп. 23-28 или

8) вектором по п. 30.

32. Способ по п. 31, где клетка представляет собой клетку животного, например, клетку млекопитающего, примата или человека, например, представляет собой клетку человека, где необязательно указанную клетку получают от пациента, страдающего гемоглобинопатией, например, серповидноклеточным заболеванием или талассемией, например, бета-талассемией.

33. Способ по любому из пп. 31-32, где клетка представляет собой HSPC, необязательно CD34+ HSPC, необязательно CD34+CD90+ HSPC.

34. Способ по любому из пп. 31-33, где клетка находится в композиции, содержащей популяцию клеток, которая была обогащена клетками CD34+.

35. Способ по любому из пп. 31-34, где клетка (например, популяция клеток) была выделена из костного мозга, периферической крови (например, мобилизованной периферической крови) или пуповинной крови.

36. Способ по любому из пп. 31-35, где клетка является аутологичной или аллогенной по отношению к пациенту, которому назначено введение указанной клетки.

37. Способ по любому из пп. 31-36, где

a) изменение дает в результате вставку/делецию в последовательности геномной ДНК, комплементарной нацеливающему домену одной или нескольких молекул gRNA, или рядом с этой последовательностью; и/или

b) изменение дает в результате делецию, охватывающую последовательность, например, по сути всю последовательность, между последовательностью, комплементарной нацеливающему домену одной или нескольких молекул gRNA (например, на по меньшей мере 90% комплементарной нацеливающему домену gRNA, например, полностью комплементарной нацеливающему домену gRNA) в промоторном участке HBG1, и последовательностью, комплементарной нацеливающему домену одной или нескольких молекул gRNA (например, на по меньшей мере 90% комплементарной нацеливающему домену gRNA, например, полностью комплементарной нацеливающему домену gRNA) в промоторном участке HBG2, где необязательно делеция не охватывает нуклеотид, расположенный между 5250092 и 5249833, - нить (hg38).

38. Способ по любому из пп. 31-37, где

(a) способ дает в результате популяцию клеток, где по меньшей мере приблизительно 15%, например, по меньшей мере приблизительно 17%, например, по меньшей мере приблизительно 20%, например, по меньшей мере приблизительно 30%, например, по меньшей мере приблизительно 40%, например, по меньшей мере приблизительно 50%, например, по меньшей мере приблизительно 55%, например, по меньшей мере приблизительно 60%, например, по меньшей мере приблизительно 70%, например, по меньшей мере приблизительно 75% популяции были изменены, например, содержат вставку/делецию, где необязательно вставка/делеция выбрана из вставки/делеции, перечисленной в таблице 2-7, где необязательно клетки популяции не предусматривают делецию нуклеотида, расположенного между 5250092 и 5249833, - нить (hg38);

(b) изменение дает в результате клетку (например, популяцию клеток), которая способна к дифференцировке в дифференцированную клетку эритроидного ростка (например, красную кровяную клетку), и где указанная дифференцированная клетка характеризуется повышенным уровнем фетального гемоглобина, например, по сравнению с неизмененной клеткой (например, популяцией клеток);

(c) изменение дает в результате популяцию клеток, которая способна к дифференцировке в популяцию дифференцированных клеток, например, популяцию клеток эритроидного ростка (например, популяцию красных кровяных клеток), и где указанная популяция дифференцированных клеток характеризуется повышенным процентным содержанием F-клеток (например, процентным содержанием F-клеток, которое повышено на по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30% или по меньшей мере приблизительно 40%), например, по сравнению с популяцией неизмененных клеток; и/или

(d) изменение дает в результате клетку (например, популяцию клеток), которая способна к дифференцировке в дифференцированную клетку, например, клетку эритроидного ростка (например, красную кровяную клетку), и где указанная дифференцированная клетка продуцирует по меньшей мере приблизительно 6 пикограмм (например, по меньшей мере приблизительно 7 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 8 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 9 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 10 пикограмм, или от приблизительно 8 до приблизительно 9 пикограмм, или от приблизительно 9 до приблизительно 10 пикограмм) фетального гемоглобина на клетку.

39. Клетка, измененная с помощью способа по любому из пп. 31-38, или клетка, получаемая с помощью способа по любому из пп. 31-38.

40. Клетка, содержащая вставку/делецию, описанную в таблице 7-2, где необязательно клетка не предусматривает делецию нуклеотида, расположенного между 5250092 и 5249833, - нить (hg38).

41. Клетка, содержащая первую молекулу gRNA по любому из пп. 1-22, или композицию по любому из пп. 23-28, нуклеиновую кислоту по п. 29 или вектор по п. 30.

42. Клетка по любому из пп. 39-41, где клетка способна к дифференцировке в дифференцированную клетку, например, клетку эритроидного ростка (например, красную кровяную клетку), и где указанная дифференцированная клетка характеризуется повышенным уровнем фетального гемоглобина, например, по сравнению с клеткой такого же типа, которая не была модифицирована с тем, чтобы содержать молекулу gRNA, где необязательно дифференцированная клетка (например, клетка эритроидного ростка, например, красная кровяная клетка) продуцирует по меньшей мере приблизительно 6 пикограмм (например, по меньшей мере приблизительно 7 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 8 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 9 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 10 пикограмм, или от приблизительно 8 до приблизительно 9 пикограмм, или от приблизительно 9 до приблизительно 10 пикограмм) фетального гемоглобина, например, по сравнению с дифференцированной клеткой такого же типа, которая не была модифицирована с тем, чтобы содержать молекулу gRNA.

43. Клетка по любому из пп. 39-42, которую приводили в контакт с веществом, стимулирующим размножение стволовых клеток.

44. Клетка по п. 43, где вещество, стимулирующее размножение стволовых клеток, представляет собой

a) (1r,4r)-N¹-(2-бензил-7-(2-метил-2H-тетразол-5-ил)-9H-пиримидо[4,5-b]индол-4-ил)циклогексан-1,4-диамин;

b) метил-4-(3-пиперидин-1-илпропиламино)-9H-пиримидо[4,5-b]индол-7-карбоксилат;

c) 4-(2-(2-(бензо[b]тиофен-3-ил)-9-изопропил-9H-пурин-6-иламино)этил)фенол;

d) (S)-2-(6-(2-(1H-индол-3-ил)этиламино)-2-(5-фторпиридин-3-ил)-9H-пурин-9-ил)пропан-1-ол или

e) их комбинации (например, комбинацию (1r,4r)-N¹-(2-бензил-7-(2-метил-2H-тетразол-5-ил)-9H-пиримидо[4,5-b]индол-4-ил)циклогексан-1,4-диамина и (S)-2-(6-(2-(1H-индол-3-ил)этиламино)-2-(5-фторпиридин-3-ил)-9H-пурин-9-ил)пропан-1-ола).

45. Клетка, содержащая

a) вставку/делецию в последовательности геномной ДНК, комплементарной нацеливающему домену молекулы gRNA по любому из пп. 1-22, или рядом с этой последовательностью; и/или

b) делецию, охватывающую последовательность, например, по сути всю последовательность, между последовательностью, комплементарной нацеливающему домену молекулы gRNA по любому из пп. 1-22 (например, на по меньшей мере 90% комплементарной нацеливающему домену gRNA, например, полностью комплементарной нацеливающему домену gRNA) в промоторном участке HBG1, и последовательностью, комплементарной нацеливающему домену молекулы gRNA по любому из пп. 1-22 (например, на по меньшей мере 90% комплементарной нацеливающему домену gRNA, например, полностью комплементарной нацеливающему домену gRNA) в промоторном участке HBG2, где необязательно делеция не охватывает нуклеотид, расположенный между 5250092 и 5249833, - нить (hg38).

46. Клетка по любому из пп. 39-45, где клетка представляет собой клетку животного, например, клетку млекопитающего, примата или человека, например, представляет собой клетку человека, где необязательно указанная клетка получена от пациента, страдающего гемоглобинопатией, например, серповидноклеточным заболеванием или талассемией, например, бета-талассемией.

47. Клетка по любому из пп. 39-46, где клетка представляет собой HSPC, необязательно CD34+ HSPC, необязательно CD34+CD90+ HSPC.

48. Клетка по любому из пп. 39-47, где клетка (например, популяция клеток) была выделена из костного мозга, периферической крови (например, мобилизованной периферической крови) или пуповинной крови.

49. Клетка по любому из пп. 39-48, где клетка является аутологичной или аллогенной по отношению к пациенту, которому назначено введение указанной клетки.

50. Популяция клеток, содержащая клетку по любому из пп. 39-49, где необязательно по меньшей мере приблизительно 50%, например, по меньшей мере приблизительно 60%, например, по меньшей мере приблизительно 70%, например, по меньшей мере приблизительно 80%, например, по меньшей мере приблизительно 90% (например, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%) клеток популяции представляют собой клетку по любому из пп. 39-49.

51. Популяция клеток по п. 50, где популяция клеток способна к дифференцировке в популяцию дифференцированных клеток, например, популяцию клеток эритроидного ростка (например, популяцию красных кровяных клеток), и где указанная популяция дифференцированных клеток характеризуется повышенным процентным содержанием F-клеток (например, процентным содержанием F-клеток, которое повышено на по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 17%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30% или по меньшей мере приблизительно 40%), например, по сравнению с популяцией немодифицированных клеток такого же типа; где необязательно F-клетки популяции дифференцированных клеток продуцируют в среднем по меньшей мере приблизительно 6 пикограмм (например, по меньшей мере приблизительно 7 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 8 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 9 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 10 пикограмм, или от приблизительно 8 до приблизительно 9 пикограмм, или от приблизительно 9 до приблизительно 10 пикограмм) фетального гемоглобина на клетку.

52. Популяция клеток по любому из пп. 50-51, содержащая

1) по меньшей мере 1e6 CD34+ клеток/кг веса тела пациента, которому клетки назначены для введения;

2) по меньшей мере 2e6 CD34+ клеток/кг веса тела пациента, которому клетки назначены для введения;

3) по меньшей мере 3e6 CD34+ клеток/кг веса тела пациента, которому клетки назначены для введения;

4) по меньшей мере 4e6 CD34+ клеток/кг веса тела пациента, которому клетки назначены для введения; или

5) от 2e6 до 10e6 CD34+ клеток/кг веса тела пациента, которому клетки назначены для введения.

53. Популяция клеток по любому из пп. 50-52, где по меньшей мере приблизительно 40%, например, по меньшей мере приблизительно 50%, (например, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80% или по меньшей мере приблизительно 90%) клеток из популяции представляют собой клетки CD34+, где необязательно по меньшей мере приблизительно 10%, например, по меньшей мере приблизительно 15%, например, по меньшей мере приблизительно 20%, например, по меньшей мере приблизительно 30% клеток из популяции представляют собой клетки CD34+CD90+.

54. Популяция клеток по любому из пп. 50-53, где популяция клеток получена из пуповинной крови, периферической крови (например, мобилизованной периферической крови) или костного мозга, например, получена из костного мозга.

55. Популяция клеток по любому из пп. 50-54, где популяция клеток содержит, например, состоит из, клетки млекопитающего, например, клетки человека, где необязательно популяция клеток получена от пациента, страдающего гемоглобинопатией, например, серповидноклеточным заболеванием или талассемией, например, бета-талассемией.

56. Популяция клеток по любому из пп. 50-55, где популяция клеток является (i) аутологичной по отношению к пациенту, которому она назначена для введения, или (ii) аллогенной по отношению к пациенту, которому она назначена для введения.

57. Популяция клеток по любому из пп. 50-56, содержащая паттерн вставки/делеции, описанный в таблице 7-2, где необязательно вставки/делеции паттерна вставки/делеции, описанного в таблице 7-2, выявляются в по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% клеток популяции.

58. Композиция, содержащая клетку по любому из пп. 39-49 или популяцию клеток по любому из пп. 50-57, необязательно содержащая фармацевтически приемлемую среду, например, фармацевтически приемлемую среду, подходящую для криоконсервации.

59. Способ лечения гемоглобинопатии, предусматривающий введение пациенту клетки по любому из пп. 39-49 или популяции клеток по любому из пп. 50-57 или композиции по п. 58.

60. Способ повышения экспрессии фетального гемоглобина у млекопитающего, предусматривающий введение пациенту клетки по любому из пп. 39-49 или популяции клеток по любому из пп. 50-57 или композиции по п. 58.

61. Способ по п. 60, где гемоглобинопатия представляет собой бета-талассемию или серповидноклеточное заболевание.

62. Способ получения клетки (например, популяции клеток), предусматривающий

(a) обеспечение клетки (например, популяции клеток) (например, HSPC (например, популяции HSPC));

(b) культивирование указанной клетки (например, указанной популяции клеток) ex vivo в среде для культивирования клеток, содержащей вещество, стимулирующее размножение стволовых клеток; и

(c) введение в указанную клетку первой молекулы gRNA по любому из пп. 1-22, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей первую молекулу gRNA по любому из пп. 1-22, композиции по любому из пп. 23-28, нуклеиновой кислоты по п. 29 или вектора по п. 30.

63. Способ по п. 62, где после указанного введения на стадии (c) указанная клетка (например, популяция клеток) способна к дифференцировке в дифференцированную клетку (например, популяцию дифференцированных клеток), например, клетку эритроидного ростка (например, популяцию клеток эритроидного ростка), например, красную кровяную клетку (например, популяцию красных кровяных клеток), и где указанная дифференцированная клетка (например, популяция дифференцированных клеток) продуцирует повышенный уровень фетального гемоглобина, например, по сравнению с такой же клеткой, которую не подвергали стадии (c).

64. Способ по любому из пп. 62-63, где вещество, стимулирующее размножение стволовых клеток, представляет собой

a) (1r,4r)-N1-(2-бензил-7-(2-метил-2H-тетразол-5-ил)-9H-пиримидо[4,5-b]индол-4-ил)циклогексан-1,4-диамин;

b) метил-4-(3-пиперидин-1-илпропиламино)-9H-пиримидо[4,5-b]индол-7-карбоксилат;

c) 4-(2-(2-(бензо[b]тиофен-3-ил)-9-изопропил-9H-пурин-6-иламино)этил)фенол;

d) (S)-2-(6-(2-(1H-индол-3-ил)этиламино)-2-(5-фторпиридин-3-ил)-9H-пурин-9-ил)пропан-1-ол или

e) их комбинации (например, комбинацию (1r,4r)-N1-(2-бензил-7-(2-метил-2H-тетразол-5-ил)-9H-пиримидо[4,5-b]индол-4-ил)циклогексан-1,4-диамина и (S)-2-(6-(2-(1H-индол-3-ил)этиламино)-2-(5-фторпиридин-3-ил)-9H-пурин-9-ил)пропан-1-ола).

65. Способ по любому из пп. 62-64, где среда для культивирования клеток содержит тромбопоэтин (Tpo), лиганд Flt3 (Flt-3L) и фактор стволовых клеток (SCF) человека, где необязательно среда для культивирования клеток дополнительно содержит интерлейкин-6 (IL-6) человека; где необязательно среда для культивирования клеток содержит тромбопоэтин (Tpo), лиганд Flt3 (Flt-3L), фактор стволовых клеток (SCF) человека, и если присутствует, IL-6 человека, каждый в концентрации, находящейся в диапазоне от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл, при этом необязательно каждый в концентрации, составляющей приблизительно 50 нг/мл, например, в концентрации, составляющей 50 нг/мл.

66. Способ по любому из пп. 62-65, где среда для культивирования клеток содержит вещество, стимулирующее размножение стволовых клеток, в концентрации, находящейся в диапазоне от приблизительно 1 нМ до приблизительно 1 мМ, необязательно в концентрации, находящейся в диапазоне от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 100 нМ, необязательно в концентрации, находящейся в диапазоне от приблизительно 500 нМ до приблизительно 750 нМ, необязательно в концентрации, составляющей приблизительно 500 нМ, например, в концентрации, составляющей 500 нМ, или в концентрации, составляющей приблизительно 750 нМ, например, в концентрации, составляющей 750 нМ.

67. Способ по любому из пп. 62-66, где культивирование на стадии (b) предусматривает период культивирования перед введением на стадии (c), где необязательно период культивирования перед введением на стадии (c) составляет по меньшей мере 12 часов, например, представляет собой период, составляющий от приблизительно 1 дня до приблизительно 12 дней, например, представляет собой период, составляющий от приблизительно 1 дня до приблизительно 6 дней, например, представляет собой период, составляющий от приблизительно 1 дня до приблизительно 3 дней, например, представляет собой период, составляющий от приблизительно 1 дня до приблизительно 2 дней, например, представляет собой период, составляющий приблизительно 2 дня.

68. Способ по любому из пп. 62-67, где культивирование на стадии (b) предусматривает период культивирования перед введением на стадии (c), где необязательно период культивирования после введения на стадии (c) составляет по меньшей мере 12 часов, например, представляет собой период, составляющий от приблизительно 1 дня до приблизительно 12 дней, например, представляет собой период, составляющий от приблизительно 1 дня до приблизительно 6 дней, например, представляет собой период, составляющий от приблизительно 2 дней до приблизительно 4 дней, например, представляет собой период, составляющий приблизительно 2 дня, или представляет собой период, составляющий приблизительно 3 дня, или представляет собой период, составляющий приблизительно 4 дня.

69. Способ по любому из пп. 62-68, где популяция клеток увеличивается ex vivo в по меньшей мере 3 раза, например, в по меньшей мере 4 раза, например, в по меньшей мере 5 раз, например, в по меньшей мере 10 раз.

70. Способ по любому из пп. 62-69, где введение на стадии (c) предусматривает электропорацию.

71. Способ по любому из пп. 62-70, где клетка (например, популяция клеток), предусмотренная на стадии (a), представляет собой клетку человека (например, популяцию клеток человека).

72. Способ по п. 71, где клетка (например, популяция клеток), предусмотренная на стадии (a), выделена из костного мозга, периферической крови (например, мобилизованной периферической крови) или пуповинной крови.

73. Способ по п. 72, где

(i) клетка (например, популяция клеток), предусмотренная на стадии (a), выделена из костного мозга, например, выделена из костного мозга пациента, страдающего гемоглобинопатией, где необязательно гемоглобинопатия представляет собой серповидноклеточное заболевание или талассемию, где необязательно талассемия представляет собой бета-талассемию; или

(ii) клетка (например, популяция клеток), предусмотренная на стадии (a), выделена из периферической крови, например, выделена из периферической крови пациента, страдающего гемоглобинопатией, где необязательно гемоглобинопатия представляет собой серповидноклеточное заболевание или талассемию, где необязательно талассемия представляет собой бета-талассемию; где необязательно периферическая кровь представляет собой мобилизованную периферическую кровь, где необязательно мобилизованная периферическая кровь подвергнута мобилизации с применением плериксафора, G-CSF или их комбинации.

74. Способ по любому из пп. 62-73, где популяция клеток, предусмотренная на стадии (a), является обогащенной клетками CD34+.

75. Способ по любому из пп. 62-74, где после введения на стадии (c) клетку (например, популяцию клеток) подвергают криоконсервации.

76. Способ по любому из пп. 62-75, где после введения на стадии (c) клетка (например, популяция клеток) содержит

a) вставку/делецию в последовательности геномной ДНК, комплементарной нацеливающему домену первой молекулы gRNA, или рядом с этой последовательностью; и/или

b) делецию, охватывающую последовательность, например, по сути всю последовательность, между последовательностью, комплементарной нацеливающему домену первой молекулы gRNA (например, на по меньшей мере 90% комплементарной нацеливающему домену gRNA, например, полностью комплементарной нацеливающему домену gRNA) в промоторном участке HBG1, и последовательностью, комплементарной нацеливающему домену первой молекулы gRNA (например, на по меньшей мере 90% комплементарной нацеливающему домену gRNA, например, полностью комплементарной нацеливающему домену gRNA) в промоторном участке HBG2, где необязательно вставка/делеция, например, делеция, не охватывает нуклеотид, расположенный между 5250092 и 5249833, - нить (hg38).

77. Способ по любому из пп. 62-76, где

(a) после введения на стадии (c) по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% клеток, относящихся к популяции клеток, содержат вставку/делецию в последовательности геномной ДНК, комплементарной нацеливающему домену первой молекулы gRNA, или рядом с этой последовательностью, где необязательно вставка/делеция выбрана из вставки/делеции, перечисленной в таблице 2-7, где необязательно клетка, относящаяся к популяции, не предусматривает делецию нуклеотида, расположенного между 5250092 и 5249833, - нить (hg38);

(b) после введения на стадии (c) клетка (например, популяция клеток) способна к дифференцировке в дифференцированную клетку эритроидного ростка (например, красную кровяную клетку), и где указанная дифференцированная клетка характеризуется повышенным уровнем фетального гемоглобина, например, по сравнению с неизмененной клеткой (например, популяцией клеток);

(c) после введения на стадии (c) популяция клеток способна к дифференцировке в популяцию дифференцированных клеток, например, популяцию клеток эритроидного ростка (например, популяцию красных кровяных клеток), и где указанная популяция дифференцированных клеток характеризуется повышенным процентным содержанием F-клеток (например, процентным содержанием F-клеток, которое повышено на по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30% или по меньшей мере приблизительно 40%), например, по сравнению с популяцией неизмененных клеток;

(d) после введения на стадии (c) клетка (например, популяция клеток) способна к дифференцировке в дифференцированную клетку, например, клетку эритроидного ростка (например, красную кровяную клетку), и где указанная дифференцированная клетка (например, популяция дифференцированных клеток) продуцирует по меньшей мере приблизительно 6 пикограмм (например, по меньшей мере приблизительно 7 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 8 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 9 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 10 пикограмм, или от приблизительно 8 до приблизительно 9 пикограмм, или от приблизительно 9 до приблизительно 10 пикограмм) фетального гемоглобина на клетку;

(e) после введения на стадии (c) нецелевые вставки/делеции не образуются в указанной клетке, например, нецелевые вставки/делеции не образуются за пределами промоторных участков HBG1 и/или HBG2, что, например, выявляется с помощью секвенирования нового поколения и/или анализа с помощью вставки нуклеотида; и/или

(f) после введения на стадии (c) нецелевую вставку/делецию, например, нецелевую вставку/делецию за пределами промоторных участков HBG1 и/или HBG2, не выявляют в более чем приблизительно 5%, например, в более чем приблизительно 1%, например, в более чем приблизительно 0,1%, например, в более чем приблизительно 0,01%, клеток из популяции клеток, что, например, выявляется с помощью секвенирования нового поколения и/или анализа с помощью вставки нуклеотида.

78. Клетка (например, популяция клеток), получаемая с помощью способа по любому из пп. 62-77.

79. Клетка, где

(a) по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% клеток из популяции клеток содержат вставку/делецию в последовательности геномной ДНК, комплементарной нацеливающему домену молекулы gRNA по любому из пп. 1-22, или рядом с этой последовательностью, где необязательно вставка/делеция выбрана из вставки/делеции, перечисленной в таблице 2-7, где необязательно клетка, относящаяся к популяции, не предусматривает делецию нуклеотида, расположенного между 5250092 и 5249833, - нить (hg38);

(b) клетка (например, популяция клеток) способна к дифференцировке в дифференцированную клетку эритроидного ростка (например, красную кровяную клетку), и где указанная дифференцированная клетка характеризуется повышенным уровнем фетального гемоглобина, например, по сравнению с неизмененной клеткой (например, популяцией клеток);

(c) популяция клеток способна к дифференцировке в популяцию дифференцированных клеток, например, популяцию клеток эритроидного ростка (например, популяцию красных кровяных клеток), и где указанная популяция дифференцированных клеток характеризуется повышенным процентным содержанием F-клеток (например, процентным содержанием F-клеток, которое повышено на по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30% или по меньшей мере приблизительно 40%), например, по сравнению с популяцией неизмененных клеток;

(d) клетка (например, популяция клеток) способна к дифференцировке в дифференцированную клетку, например, клетку эритроидного ростка (например, красную кровяную клетку), и где указанная дифференцированная клетка (например, популяция дифференцированных клеток) продуцирует по меньшей мере приблизительно 6 пикограмм (например, по меньшей мере приблизительно 7 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 8 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 9 пикограмм, по меньшей мере приблизительно 10 пикограмм, или от приблизительно 8 до приблизительно 9 пикограмм, или от приблизительно 9 до приблизительно 10 пикограмм) фетального гемоглобина на клетку;

(e) нецелевые вставки/делеции не образуются в указанной клетке, например, нецелевые вставки/делеции не образуются за пределами промоторных участков HBG1 и/или HBG2, что, например, выявляется с помощью секвенирования нового поколения и/или анализа с помощью вставки нуклеотида;

(f) нецелевая вставка/делеция, например, нецелевая вставка/делеция за пределами промоторных участков HBG1 и/или HBG2, не выявляется в более чем приблизительно 5%, например, в более чем приблизительно 1%, например, в более чем приблизительно 0,1%, например, в более чем приблизительно 0,01% клеток, относящихся к популяции клеток, что, например, выявляется с помощью секвенирования нового поколения и/или анализа с помощью вставки нуклеотида; и/или

(g) указанная клетка или ее потомство выявляются у пациента, которому их трансплантировали, через более 16 недель, более 20 недель или более 24 недель после трансплантации, что необязательно выявляется с помощью выявления вставки/делеции в последовательности геномной ДНК, комплементарной нацеливающему домену молекулы gRNA по любому из пп. 1-22, или рядом с этой последовательностью, где необязательно вставка/делеция выбрана из вставки/делеции, перечисленной в таблице 2-7.

80. Клетка по любому из пп. 78-79, где клетка представляет собой клетку животного, например, клетку млекопитающего, примата или человека, например, представляет собой клетку человека, где необязательно указанная клетка получена от пациента, страдающего гемоглобинопатией, например, серповидноклеточным заболеванием или талассемией, например, бета-талассемией.

81. Клетка по любому из пп. 78-80, где клетка представляет собой HSPC, необязательно CD34+ HSPC, необязательно CD34+CD90+ HSPC.

82. Клетка по любому из пп. 78-81, где клетка (например, популяция клеток) была выделена из костного мозга, периферической крови (например, мобилизованной периферической крови) или пуповинной крови.

83. Клетка по любому из пп. 78-82, где клетка является аутологичной или аллогенной по отношению к пациенту, которому назначено введение указанной клетки.

84. Способ лечения гемоглобинопатии, предусматривающий введение пациенту-человеку композиции, содержащей клетку по любому из пп. 39-49 или 78-83 или популяцию клеток по любому из пп. 50-57.

85. Способ повышения экспрессии фетального гемоглобина у пациента-человека, предусматривающий введение указанному пациенту-человеку композиции, содержащей клетку по любому из пп. 39-49 или 78-83 или популяцию клеток по любому из пп. 50-57.

86. Способ по п. 84, где гемоглобинопатия представляет собой бета-талассемию или серповидноклеточное заболевание.

87. Способ по любому из пп. 84-86, где пациенту-человеку вводят композицию, содержащую по меньшей мере приблизительно 2e6 клеток, охарактеризованных в любом из пп. 39-57 или пп. 78-83, на кг веса тела пациента-человека, например, по меньшей мере приблизительно 2e6 клеток CD34+, указанных в любом из пп. 39-57 или 78-83, на кг веса тела пациента-человека.

88. Способ по любому из пп. 84-87, где клетку или популяцию клеток или их потомство выявляют у пациента-человека через более 16 недель, более 20 недель или более 24 недель после введения, причем выявление необязательно осуществляют с помощью выявления вставки/делеции в последовательности геномной ДНК, комплементарной нацеливающему домену молекулы gRNA по любому из пп. 1-22, или рядом с этой последовательностью, где необязательно вставка/делеция выбрана из вставки/делеции, перечисленной в таблице 2-7; где необязательно уровень выявления вставки/делеции в эталонной популяции клеток (например, клеток CD34+) через более 16 недель, более 20 недель или более 24 недель после введения снижается на не более чем 50%, не более чем 40%, не более чем 30%, не более чем 20%, не более чем 10%, не более чем 5% или не более чем 1% относительно уровня выявления вставки/делеции в популяции клеток непосредственно перед введением.

89. Молекула gRNA по любому из пп. 1-22, композиция по любому из пп. 23-28 или 58, нуклеиновая кислота по п. 29, вектор по п. 30, клетка по любому из пп. 39-49 или 78-83 или популяция клеток по любому из пп. 50-57 для применения в качестве лекарственного препарата.

90. Молекула gRNA по любому из пп. 1-22, композиция по любому из пп. 23-28 или 58, нуклеиновая кислота по п. 29, вектор по п. 30, клетка по любому из пп. 39-49 или 78-83 или популяция клеток по любому из пп. 50-57 для применения в получении лекарственного препарата.

91. Молекула gRNA по любому из пп. 1-22, композиция по любому из пп. 23-28 или 58, нуклеиновая кислота по п. 29, вектор по п. 30, клетка по любому из пп. 39-49 или 78-83 или популяция клеток по любому из пп. 50-57 для применения в лечении заболевания.

92. Молекула gRNA по любому из пп. 1-22, композиция по любому из пп. 23-28 или 58, нуклеиновая кислота по п. 29, вектор по п. 30, клетка по любому из пп. 39-49 или 78-83 или популяция клеток по любому из пп. 50-57 для применения в лечении заболевания, где заболевание представляет собой гемоглобинопатию, где необязательно гемоглобинопатия представляет собой серповидноклеточное заболевание или талассемию (например, бета-талассемию).