Модифицированный тамавидин - RU2591524C2

Чертежи

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящая заявка испрашивает приоритет Патентной Заявки Японии 2010-293776, поданной 28 декабря 2010 г.

Настоящее изобретение относится к модифицированному тамавидину с повышенной устойчивостью к нагреванию.

Предшествующий уровень техники

Авидин представляет собой основный гликопротеин яичного белка, прочно связывающийся с биотином (витамином H). Стрептавидин представляет собой авидин-подобный белок актиномицетов (Streptomyces avidinii), его изоэлектрическая точка близка к нейтральной и в нем отсутствует полисахаридная цепь. Оба белка образуют тетрамеры с молекулярной массой около 60 кДа. Тетрамер формируется посредством слабых связей между димерами, в то время как димеры состоят из прочно связанных мономеров. Свойства авидина и стрептавидина таковы, что один мономер этих белков связывается с одной молекулой биотина. Авидин и стрептавидин обладают высокой аффинностью (Kd=10^-15-10^-14) к биотину, и данная аффинность является одной из наиболее высоких, характеризующих связывание между двумя биомолекулами. Поэтому авидин/стрептавидин-биотиновое связывание широко применяется в областях биохимии, молекулярной биологии и медицины.

У биотина небольшая молекулярная масса, составляющая 244, он устойчив к воздействию изменений pH и нагреванию, и поэтому широко применяется для мечения веществ. В методике биотинилирования, химически модифицированный биотин связывается с функциональной группой целевого соединения. Подобные биотинилирующие агенты коммерчески доступны и могут быть применены для биотинилирования веществ, таких как белки и нуклеиновые кислоты. В одном из способов биотинилирования, слитый белок, состоящий из целевого белка и последовательности, которая может быть биотинилирована биотин-лигазой в живом организме, экспрессируется как рекомбинантный белок, и полученный слитый белок может быть биотинилирован биотин-лигазой в клетке-хозяине.

Заявители открыли тамавидин 1 и тамавидин 2, представляющие собой авидин-подобные биотин-связывающие белки съедобного гриба Pueurotus cornucopiae (WO 02/072817). Тамавидин 1 и тамавидин 2 могут быть в больших количествах экспрессированы в Escherichia coli. В частности, тамавидин 2 может быть легко получен путем очистки с использованием иминобиотиновой колонки (WO 02/072817). Тамавидин 1 и тамавидин 2 формируют тетрамеры и исключительно прочно связываются с биотином. Более того, тамавидин-2 представляет собой превосходный биотин-связывающий белок в том смысле, что данный белок демонстрирует более высокую по сравнению с авидином и стрептавидином устойчивость к нагреванию и меньшее по сравнению с авидином неспецифическое связывание.

Авидин, стрептавидин и тамавидин обладают большей по сравнению с обычным белком устойчивостью к нагреванию, определяемой по методу с использованием флуоресцентного биотина (и выраженной значением температуры, при которой активность снижается до половины изначальной активности) и составляющей 79°C, 74°C и 85°C, соответственно (Takakura et al. 2009 FEBS J 276: 1383-1397).

Однако для расширения промышленной применимости, были сделаны попытки в еще большей степени повысить устойчивость авидина и стрептавидина к нагреванию. Reznik с соавт. (1996) опубликовали сообщение в отношении стрептавидина (Nat. Biotechnol., 14: 1007-1011). С целью повышения прочности слабых связей между димерами стрептавидина, они при помощи генетической инженерии мутировали остаток гистидина (His) в положении 127 в цистеин (Cys), сконструировав устойчивый к нагреванию димер связанных дисульфидной связью молекул мутантного стрептавидина. Полученный мутант сохранял 70% изначальной биотин-связывающей активности при нагревании при 90°C на протяжении 10 мин, в то время как стрептавидин дикого типа сохранял 55% изначальной биотин-связывающей активности при нагревании при 70°C на протяжении 10 мин.

В то же время, Nordlund с соавт., 2003 (J. Biol. Chem. 278: 2479-2483) опубликовали сообщение о термической стабилизации авидина; они при помощи генетической инженерии получили различные виды дисульфидных связей между субъединицами авидина для повышения устойчивости к нагреванию. Остаточная биотин-связывающая активность авидина была практически равна нулю после нагревания при 99,9°C на протяжении 2 мин, в то время как активность I117C (модифицированный авидин, в котором изолейцин в положении 117 заменен на цистеин) составляла чуть более 30%, а активность D86CI106CI117C (модифицированный авидин, в котором остаток аспарагиновой кислоты в положении 86 и остатки изолейцина в положениях 106 и 117 заменены на остатки цистеина) составляла чуть менее 50%.

Кроме того, Hytonen с соавт., (2005), J. Biol. Chem., 280: 10228-10233 опубликовали сообщение о термической стабилизации авидина без формирования дисульфидных связей. Был получен химерный белок авидина и AVR4 (белок, кодируемый геном Avidin-related gene 4), обладающий более высокой по сравнению с авидином устойчивостью к нагреванию, и полученный мутант авидина ChiAVD (I117Y) демонстрировал повышенную остаточную биотин-связывающую активность, составившую 98% после нагревания при 99,9°С на протяжении 32 мин (остаточная активность: 4% для авидина, 74% для AVR4).

Почти все устойчивые к нагреванию мутанты авидина получали с использованием бакуловирусной экспрессионной системы в клетках насекомых, в то время как мутанты стрептавидина получали с использованием экспрессионной системы на основе E.coli, что в процессе требует этапа солюбилизации нерастворимых телец включения. Таким образом, белки, подобные вышеописанным, производство каждого из которых требует значительных затрат и усилий, до настоящего момента не получили практического применения.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

Патентная литература 1: международная публикация No.WO02/072817

Патентная литература 2: международная публикация No. WO2010/018859

НЕПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

Непатентная литература 1: Takakura, et al., (2009), FEBS J., 276: 1383-1397

Непатентная литература 2: Reznik et al., (1996), Nat. Biotechnol., 14: 1007-1011

Непатентная литература 3: Nordlund et al., (2003), J. Biol. Chem., 278: 2479-2483

Непатентная литература 4: Hytonen et al., (2005), J. Biol. Chem., 280: 10228-10233

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, относится к получению модифицированного тамавидина 2, который может быть экспрессирован на высоком уровне в растворимой форме в E.coli и который обладает повышенной устойчивостью к нагреванию, за счет которой структура белка сохраняется даже после нагревания до высоких температур.

Решение проблемы

Авторы настоящего изобретения, выполнившие тщательные исследования с целью решить вышеизложенные проблемы, успешно получили модифицированный тамавидин 2, который на высоком уровне экспрессируется в E.coli в растворимой форме, обладает повышенной устойчивостью к нагреванию, за счет которой структура белка сохраняется даже после нагревания до высоких температур, и входит в объем настоящего изобретения.

Более конкретно, в настоящем изобретении, модифицированный биотин-связывающий белок, обладающий повышенной устойчивостью к нагреванию, достаточной для сохранения биотин-связывающей активности после нагревания при 99,9°C на протяжении 32 минут, получается путем замены остатка аспарагина в 115 положении аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2) нативного тамавидина 2 (далее в настоящем описании называемого «TM2») на цистеин (SEQ ID NO: 4). Данный модифицированный тамавидин 2 также обладает повышенной устойчивостью к апротонным полярным органическим растворителям.

Предпочтительные варианты осуществления

настоящего изобретения

Настоящее изобретение включает в себя следующие предпочтительные варианты осуществления.

[Вариант осуществления изобретения 1]

Модифицированный биотин-связывающий белок, включающий в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, аминокислотную последовательность, содержащую одну или более мутаций аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, либо аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, обладающий биотин-связывающей активностью, в котором остаток аспарагина в 115 положении заменен на цистеин.

[Вариант осуществления изобретения 2]

Модифицированный биотин-связывающий белок согласно варианту осуществления изобретения 1, сохраняющий после нагревания при 99,9°C на протяжении 30 мин не менее 75% биотин-связывающей активности по сравнению с таковой до нагревания.

[Вариант осуществления изобретения 3]

Модифицированный биотин-связывающий белок согласно варианту осуществления изобретения 1 или варианту осуществления изобретения 2, сохраняющий после обработки 60% апротонным полярным органическим растворителем на протяжении 30 мин не менее 50% биотин-связывающей активности по сравнению с таковой до обработки.

[Вариант осуществления изобретения 4]

Модифицированный биотин-связывающий белок согласно варианту осуществления изобретения 3, в котором апротонный полярный органический растворитель представляет собой диметилсульфоксид.

[Вариант осуществления изобретения 5]

Модифицированный биотин-связывающий белок согласно любому из вариантов осуществления изобретения 1-4, включающий в себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

[Вариант осуществления изобретения 6]

Модифицированный биотин-связывающий белок, в котором остаток аспарагина в 115 позиции SEQ ID NO: 2 заменен на цистеин.

[Вариант осуществления изобретения 7]

Подложка, на которой иммобилизован белок согласно любому из вариантов осуществления изобретения 1-6.

[Вариант осуществления изобретения 8]

Нуклеиновая кислота, кодирующая белок согласно любому из вариантов осуществления изобретения 1-6.

[Вариант осуществления изобретения 9]

Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по варианту осуществления изобретения 8.

[Вариант осуществления изобретения 10]

Способ отделения, концентрирования, фиксирования, очистки и/или детекции белка согласно любому из вариантов осуществления изобретения 1-6, включающий в себя следующие этапы:

1) нагревание пробы, содержащей белок, при температуре не менее 90°C на протяжении по меньшей мере 10 мин; и

2) отбор белка, не подвергшегося тепловой денатурации на этапе 1) для последующего отделения, концентрирования, фиксирования или очистки белка и/или его детекции.

[Вариант осуществления изобретения 11]

Способ отделения, концентрирования, фиксирования, очистки и/или детекции связанной с биотином субстанции, включающий в себя следующие этапы:

1) приведение подложки согласно варианту осуществления изобретения 7 в контакт со связанной с биотином субстанцией, в результате которого связанная с биотином субстанция связывается с подложкой;

2) отмывка загрязнений, не связавшихся с подложкой, раствором, содержащим от 60% до 80% апротонного полярного органического растворителя; и

3) отбор связанной с биотином субстанции, связавшейся с подложкой, для последующего отделения, концентрирования, фиксирования или очистки субстанции и/или ее детекции.

[Вариант осуществления изобретения 12]

Способ согласно варианту осуществления изобретения 11, в котором апротонный полярный органический растворитель представляет собой диметилсульфоксид.

Полезные эффекты изобретения

В настоящем изобретении представлен модифицированный TM2, который может быть экспрессирован на высоком уровне в растворимой форме в E.coli и демонстрирует повышенную устойчивость к нагреванию, за счет которой структура белка сохраняется даже после нагревания до высоких температур. Модифицированный TM2 настоящего изобретения, обладающий высокой устойчивостью к нагреванию, может быть очищен, к примеру, при помощи температурной очистки. Модифицированный TM2 также демонстрирует повышенную устойчивость к апротонным органическим растворителям. Модифицированный TM2 настоящего изобретения, обладающий устойчивостью к органическим растворителям, может быть промыт растворителем, таким как диметилсульфоксид, для подавления неспецифической адсорбции в процессе отделения и очистки связанных с биотином субстанций. Более того, модифицированный TM2 настоящего изобретения может быть применен, к примеру, в системах иммобилизации или детектирования субстанций в органических растворителях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет собой диаграмму биотин-связывающей способности модифицированного TM2 N115C настоящего изобретения, TM2 и различных авидин-подобных белков (стрептавидин, авидин и нейтравидин). Тепловую обработку проводили при 99,9°C на протяжении 1, 2, 4, 10 и 20 мин.

Фигура 2 представляет собой диаграмму биотин-связывающей способности модифицированного TM2 N115C настоящего изобретения, TM2 и различных авидин-подобных белков (стрептавидин, авидин и нейтравидин) после тепловой обработки при 99,9°C на протяжении 32 мин.

Фигура 3 представляет собой диаграмму биотин-связывающей способности модифицированного TM2 N115C настоящего изобретения, TM2 и различных авидин-подобных белков (стрептавидин и авидин) после смешивания с биотинилированными магнитными частицами в присутствие диметилсульфоксида. Смешивание проводили при различных концентрациях диметилсульфоксида на протяжении 30 мин.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже будут описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

Тамавидин

Тамавидин представляет собой новый биотин-связывающий белок, открытый у съедобных грибов отдела Базидиомицетов Pleurotus cornucopiae (WO02/072817). В данном источнике утверждается, что:

- тамавидин 1 и тамавидин 2 на 65,5% гомологичны и прочно связывают биотин;

- тамавидин 2 экспрессируется в растворимой форме на высоком уровне E.coli; и

- культура E. coli для экспрессии тамавидина 2 через 4,5 часа дает около 1 мг чистого рекомбинантного белка на 50 мл культуральной среды. Эти показатели значительно выше таковых, демонстрируемых авидином и стрептавидином, известных как биотин-связывающие белки.

Во всем тексте настоящего описания, термин «тамавидин 2» относится к тамавидину 2 (TM2) или его мутанту. В настоящем изобретении предложен модифицированный TM2, обладающий повышенной устойчивостью к нагреванию за счет модификации специфического аминокислотного остатка TM2 или его мутанта. Во всем тексте настоящего описания, «тамавидин 2» и «ТМ2» относятся к ТМ2 дикого типа и его мутантам, если особо не указано иное. Однако в зависимости от контекста, эти термины могут быть использованы для общего описания ТМ2 дикого типа, его мутантов, и модифицированного ТМ2 настоящего изобретения. Помимо этого, TM2, демонстрирующий биотин-связывающую активность, может быть назван как «биотин-связывающий белок» во всем тексте настоящего описания

Более конкретно, ТМ2 (дикого типа) может в типичном случае представлять собой белок, включающий в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, либо белок, кодируемый нуклеиновой кислотой, включающей в себя нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. Или же, ТМ2 может представлять собой мутант белка, включающего в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, либо белок, кодируемый нуклеиновой кислотой, включающей в себя нуклеотидную последовательность, представленную, обладающий биотин-связывающей активностью, сходной с таковой тамавидина 2. Мутант ТМ2 может представлять собой белок, включающий в себя аминокислотную последовательность, содержащую делецию, замену, инсерцию и/или одну или более добавочных аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Данная замена может быть консервативной заменой. Термин «консервативная замена» относится к замещению специфического аминокислотного остатка на любой остаток, имеющий сходные физико-химические характеристики. Неограничивающие примеры консервативных замен включают в себя замены друг на друга аминокислотных остатков, содержащих алифатические группы, такие как взаимные замены в группе Ile, Val, Leu и Ala, и замены друг на друга полярных остатков, такие как взаимные замены в парах Lys и Arg, Glu и Asp и Gln, и Asn.

Мутант, содержащий делецию, замену, инсерцию и/или одну или более добавочных аминокислот, может быть получен при помощи какой-либо из известных технологий, таких как сайт-направленный мутагенез (к примеру, источник Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, pp. 6487-6500, 1982, полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки) ДНК, кодирующей белок дикого типа. Во всем тексте настоящего описания, термин «одна или более аминокислот» относится к аминокислоте или аминокислотам, которые могут быть делетированы, заменены и/или добавлены при помощи сайт-направленного мутагенеза. Или же, термин «одна или более аминокислот» в настоящем описании в некоторых может относится к одной или нескольким аминокислотам.

TM2 настоящего изобретения включает без ограничения белок, состоящий из аминокислотной последовательности, содержащей делецию, замену, инсерцию или добавление от 1 до 10, предпочтительно 9 или менее, 7 или менее, 5 или менее, 3 или менее, 2 или менее, более предпочтительно одной или менее аминокислоты в SEQ ID NO: 2 и обладающий биотин-связывающей активностью.

В настоящем изобретении, к примеру, тамавидин, обладающий высокой связывающей способностью и низким неспецифическим связыванием (WO2010/018859) может без ограничения применяться как мутант ТМ2. Примеры мутантов тамавидина 2 могут представлять собой биотин-связывающий белок, включающий в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько мутаций аминокислот в последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, либо аминокислотную последовательности, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и обладающий биотин-связывающей активностью, в котором один или более остатков выбраны из группы, включающей:

1) остаток аргинина в положении 104 последовательности SEQ ID NO: 2;

2) остаток лизина в положении 141 последовательности SEQ ID NO: 2;

3) остаток лизина в положении 26 последовательности SEQ ID NO: 2; и

4) остаток лизина в положении 73 последовательности SEQ ID NO: 2

заменены на кислый или нейтральный аминокислотный остаток. Более предпочтительно, биотин-связывающий белок может быть выбран из группы, включающей:

биотин-связывающий белок (R104E-K141E), в котором остаток аргинина в положении 104 SEQ ID NO: 2 заменен на остаток глутаминовой кислоты, и остаток лизина в положении 141 заменен на остаток глутаминовой кислоты;

биотин-связывающий белок (D40N-R104E), в котором остаток аспарагиновой кислоты в положении 40 SEQ ID NO: 2 заменен на остаток аспарагина, и остаток аргинина в положении 104 заменен на остаток глутаминовой кислоты;

биотин-связывающий белок (D40N-K141E), в котором остаток аспарагиновой кислоты в положении 40 SEQ ID NO: 2 заменен на остаток аспарагина, и остаток лизина в положении 141 заменен на остаток глутаминовой кислоты;

биотин-связывающий белок ((D40N-R104E-K141E), в котором остаток аспарагиновой кислоты в положении 40 SEQ ID NO: 2 заменен на остаток аспарагина, остаток аргинина в положении 104 заменен на остаток глутаминовой кислоты, и остаток лизина в положении 141 заменен на остаток глутаминовой кислоты;

Сайт-направленный мутагенез может быть реализован, к примеру, при помощи синтетического олигонуклеотидного праймера, комплементарного предназначенной для внесения мутации одноцепочечной фаговой ДНК за исключением специфического некомплементарного участка, т.е. желаемой мутации. Более конкретно, синтетический олигонуклеотид используется в качестве праймера для синтеза цепи, комплементарной фаговой ДНК, и клетка-хозяин трасформируется полученной двухцепочечной ДНК. Трансформированная бактериальная культура высевается на агар, в результате чего формируются бляшки, сформированные потомством единичной клетки, содержащей фаг. В результате, в теории, 50% новых колоний содержат фаги, несущие мутацию в одноцепочечной ДНК, в то время как 50% содержат изначальную последовательность. Полученные бляшки гибридизуют с синтетическим зондом, меченым при помощи киназной реакции, в условиях, подходящих для гибридизации с ДНК, полностью идентичной таковой, несущей желаемую мутацию, но не с ДНК, содержащей изначальную последовательность. Далее, бляшки, гибридизовавшиеся с зондом, выкалывают и культивируют для выделения ДНК.

Примерами способа введения делеции, замены, инсерции или добавления одной или более аминокислот в аминокислотную последовательность биологически активного пептида с сохранением его активности включают способ, предполагающий обработку гена мутагеном, а также способ, подразумевающий селективное расщепление гена, удаление, замену, инсерцию или добавление выбранного нуклеотида с последующим лигированием вырезанного фрагмента, дополнительно к вышеописанному сайт-направленному мутагенезу.

Мутант TM2 также может представлять собой белок, включающий в себя аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 80%, предпочтительно 85% или более, 90% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более, и более предпочтительно - 99,2% и более аминокислот и обладающий биотин-связывающей активностью, сходной с таковой TM2.

Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен путем визуальной оценки либо математического расчета. Или же, процент идентичности двух белковых последовательностей может быть выполнен путем сопоставления последовательностей при помощи компьютерной программы GAP, доступной в Копьютерной Генетической Группе Университета Висконсин (UWGCG) и основанной на алгоритме Needleman, S. B. и Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970). Предпочтительные параметры по умолчанию программы GAP включают: (1) scoring matrix (матрица замен): blosum62 согласно описанному Henikoff, S. и Henikoff, J. G., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992); (2) gap weights (штраф за наличие пропуска) - 12; (3) gap length weights (штраф за элонгацию пропуска) - 4; и (4) penalty for terminal gaps (штраф за концевые пропуски) - нет.

Любая другая программа, используемая специалистами в данной области техники, может быть использована для сравнения последовательности. Процент идентичности может быть определен, к примеру, путем сравнения последовательностей при помощи программы BLAST, описанной Altschul et. al., (Nucl. Acids Res., 25, pp. 3389-3402, 1997). Данная программа доступна на веб-сайтах Национального Института Биотехнологической Информации (NCBI) или Японского Банка Данных ДНК (DDBJ) в сети Интернет. Условия (параметры) поиска идентичности при помощи программы BLAST детально описаны на данных сайтах. Хотя данные параметры могут быть при необходимости частично модифицированы, поиск обычно проводится с использованием значений, установленных по умолчанию. Или же, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен при помощи такой программы, как программное обеспечение для процессинга генетической информации GENETYX версии 7 (доступно у Genetyx Corporation) или с использованием алгоритма FASTA, при этом поиск может быть проведен с использованием значений параметров по умолчанию.

Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен путем визуальной оценки и математического расчета, либо, предпочтительно, путем сопоставления последовательностей при помощи компьютерной программы. Типичной предпочтительной программой является версия 10.0 программы «GAP» - Висконсинский пакет программ Генетической Компьютерной Группы (GCG, Madison, Wisconsin) (Devereux, et al., (1984), Nucl. Acids Res., 12: 387). Программа «GAP» позволяет выполнять сравнения между двумя аминокислотными последовательностями, а также между нуклеотидной и аминокислотной последовательностями, в дополнение к сравнению двух нуклеотидных последовательностей. Предпочтительные значения параметров по умолчанию для программы «GAP» включают: (1) использование GCG унарной матрицы сравнения (содержащей значение «1» для идентичностей и значение «0» для отсутствия идентичности) для нуклеотидов, и взвешенной матрицы сравнения аминокислот Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986, согласно описанному Schwartz и Dayhoff, eds., “Atlas of Polypeptide Sequence and Structure,” National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979, либо других аналогичных матриц сравнения; (2) штраф за наличие любого пропуска аминокислот - 30, и дополнительный штраф за каждый символ в пропуске - 1, либо штраф за наличие любого пропуска аминокислот - 50, и дополнительный штраф за каждый символ в пропуске - 3; (3) штраф за концевые пропуски - нет; и (4) максимальный штраф за длинные пропуски - нет. Также могут быть использованы другие программы сравнения последовательностей, используемые специалистами в данной области техники. К примеру, могут быть использованы программа BLASTN версии 2.2.7, доступна на веб-сайте Национальной Медицинской Библиотеки (США): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html, либо алгоритм UW-BLAST 2.0. Установка стандартных значений параметров по умолчанию для UW-BLAST 2.0 описана на интернет-сайте http://blast.wustl.edu. Кроме того, алгоритм BLAST использует матрицу сравнения аминокислот BLOSUM62, и могут быть использованы следующие опциональные параметры: (A) включение фильтра для маскировки сегментов анализируемой последовательности с низким композиционным разнообразием (выявленные при помощи программы SEG Wootton и Federhen (Computers and Chemistry, 1993); см. также Wootton and Federhen, 1996, “Analysis of compositionally biased regions in sequence databases”, Methods Enzymol., 266: 544-71) либо сегментов, содержащих внутренние повторы с короткой длиной периода (выявленные при помощи программы XNU Claverie и States (Computers and Chemistry, 1993)), и (B) использование порогового значения статистической значимости выявляемых совпадений с последовательностями базы данных, или значения E (ожидаемая вероятность случайного выявления совпадений, в соответствии со статистической моделью (Karlin and Altschul, 1990); если статистическая значимость совпадения больше значения E, данное совпадение не включается в результаты анализа); предпочтительные пороговые значения E равны 0,5, либо, в порядке повышения предпочтительности, 0,25, 0,1, 0,05, 0,01, 0,001, 0,0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50, 1e-75, или 1e-100.

Мутант TM2 также может представлять собой белок, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, гибридизующуюся с комплементарной цепью последовательности SEQ ID NO: 1 в жестких условиях, и обладающий биотин-связывающей активностью, сходной с таковой ТМ2.

В тексте данного описания, термин «в жестких условиях» относится к гибридизации, проводимой в условиях умеренной или высокой жесткости. Более конкретно, «условия умеренной жесткости» могут быть легко определены специалистами в данной области техники, к примеру, исходя из длины ДНК. Базовые условия были опубликованы Sambrook с соавт., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, chapter 6, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, и включают использование раствора для предварительной промывки 5×SSC, 0,5% SDS, и 1,0 mM EDTA (pH 8.0), гибридизацию в условиях: около 50% формамида, от 2×SSC до 6×SSC, предпочтительно от 5×SSC до 6×SSC, и 0,5% SDS, при температуре около 42°C (либо в других сходных гибридизационных растворах, таких как раствор Старка, около 50% формамида, при температуре около 42°C), промывку в условиях, к примеру, при темепературе от приблизительно 50°C до 68°C, в растворе от 0,1 до 6×SSC, и 0,1% SDS. Предпочтительно, умеренно жесткие условия включают условия гибридизации (и промывки): около 50°C, 6×SSC, и 0,5% SDS. Условия высокой жесткости также могут быть легко определены специалистами в данной области техники, к примеру, исходя из длины ДНК.

В общем случае, подобные условия высокой жесткости включают гибридизацию при более высоких температурах и/или более низкой концентрации соли по сравнению с условиями умеренной жесткости (к примеру, гибридизация в присутствии приблизительно 0,5% SDS при температуре около 65°C, раствором 6×SSC-0,2×SSC, предпочтительно 6×SSC, более предпочтительно 2×SSC, более предпочтительно 0,2×SSC-0,1×SSC), и/или промывку, а также включают гибридизацию в вышеприведенных условиях в сочетании с промывкой при температуре от приблизительно 65°C до 68°C, раствором 0,2×SSC-0,1×SSC, и 0,1% SDS. В качестве буферного раствора для гибридизации и промывки, SSC (1×SSC: 0,15 M NaCl и 15 mM цитрат натрия) может быть заменен на SSPE (1×SSPE: 0,15 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄, и 1,25 mM EDTA; pH 7,4). Промывка проводится на протяжении от приблизительно 15 мин до 1 часа после завершения гибридизации.

Также может быть использован коммерчески доступный набор для гибридизации, включающий в себя зонд, не являющийся радиоактивным. Более конкретно, возможна гибридизация с использованием ECL-системы с прямым мечением и детекцией (производимый Amersham). К примеру, гибридизация в жестких условиях осуществляется с использованием включенного в набор гибридизационного буфера, в который добавляют блокирующий реагент и NaCl в концентрациях 5% (в/о) и 0,5 M, соответственно, в следующих условиях: 42°C на протяжении 4 часов с двухкратной промывкой 0,4% SDS, 0,5×SSC при 55°C на протяжении 20 мин и однократной промывкой 2×SSC при комнатной температуре на протяжении 5 мин.

Биотин-связывающая активность мутанта TM2 может быть определена при помощи любого известного способа, к примеру, с использованием флуоресцентного биотина согласно описанному Kada с соавт., (Biochim. Biophys. Acta, 1427: 33-43 (1999)). Данный процесс представляет собой аналитическую систему, в которой используется способность биотин-связывающего белка тушить флуоресценцию флуоресцентного биотина при связывании последнего с его биотин-связывающим сайтом. Или же, биотин-связывающая способность мутантного белка может быть изучена при помощи сенсора, способного измерять связывание между белком и биотином, такого как биосенсор, к примеру BIAcore, основанный на принципе поверхностного плазмонного резонанса. Или же, активность также может быть изучена другими способами, к примеру, с использованием HABA (2-(4'-гидроксиазобензол)бензойной кислоты Benzoic Acid) или биотинилированной HRP (пероксидазы хрена).

Модифицированный тамавидин настоящего изобретения, обладающий улучшенной устойчивостью к нагреванию

Модифицированный ТМ2 настоящего изобретения представляет собой белок, включающий в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, аминокислотную последовательность, содержащую одну или более мутаций аминокислот в последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, либо аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и сохраняющую белковую структуру, предпочтительно обладающую биотин-связывающей активностью, в которой остаток аспарагина в 115 положении заменен на цистеин.

Кроме того, модифицированный ТМ2 настоящего изобретения отличается тем, что остаток аминокислоты, соответствующий остатку аспарагина в 115 положении

SEQ ID NO: 2 TM2 дикого типа или мутанта TM2, заменен на цистеин.

Устойчивый к нагреванию модифицированный тамавидин 2 настоящего изобретения получали следующим образом.

Ген получали дизайном мутанта, в котором N115 тамавидина 2 заменен на цистеин(Cys). Данный ген вставляли в экспрессионный вектор и экспрессировали в E. coli. Экспрессируемый мутант (TM2 N115C) в виде растворимого белка экспрессировали на высоком уровне, как и тамавидин 2 (TM2). В результате очистки при помощи аффинной хроматографии на иминобиотиновой агарозе получали около 14 мг TM2 N115C на 300 мл культуральной среды.

Полученный модифицированный тамавидин 2 анализировали следующим образом.

Биотин-связывающую активность очищенного TM2 N115C определяли с использованием BIAcore (анализатор связывания биологических проб). Результаты демонстрируют, что TM2 N115C демонстрирует высокую биотин-связывающую активность того же уровня, что и ТМ2. Кроме того, TM2 N115C, TM2, авидин, нейтравидин и стрептавидин нагревали при 99,9°C на протяжении от 30 до 32 мин, иммобилизовали на микропланшетах и обрабатывали биотинилированной пероксилазой хрена (HRP) c последующим определением активности HRP. Результаты демонстрируют, что в то время как почти никакой активности не было выявлено для авидина, нейтравидина и стрептавидина, TM2 сохранял 12% изначальной биотин-связывающей активности, а TM2 N115C сохранял свою активность практически полностью (от 92% до 100%). Удивительно, что TM2 N115C почти полностью сохраняет активность после нагревания при 99,9°C на протяжении около 30 мин, с учетом опубликованных данных, демонстрирующих, что мутант авидина I117C полностью теряет активность после нагревания при 99,9°C на протяжении 5 мин (Nordlund et al., (2003), J. Biol. Chem., 278: 2479-2483), а активность мутанта стрептавидина H127C снижается до 20% при 95°C на протяжении 10 мин (Reznik et al., (1996), Nat. Biotechnol. ,14: 1007-1011). Данная устойчивость к нагреванию сопоставима с таковой для вышеописанного мутанта авидина ChiAVD (I117Y), полученного химеризацией авидина (Hytonen et al., (2005), J. Biol. Chem., 280: 10228-10233).

Во всем тексте настоящего описания, термин «тамавидин 2 (ТМ2)» соответствует вышеопределенному.

Подобный модифицированный TM2 сохраняет структуру белка даже после нагревания. Модифицированный ТМ2 настоящего изобретения сохраняет 75% или более, 80% или более, более предпочтительно 85% или более, 90% или более, 92% или более, и наиболее предпочтительно - 95% или более биотин-связывающей активности, которая была до тепловой обработки. Верхний предел температуры нагревания не превышает 100°C. Время тепловой обработки составляет по меньшей мере 10 мин, предпочтительно 20 мин или более, 30 мин или более, наиболее предпочтительно - 32 мин.

Кроме того, даже после обработки апротонным полярным органическим растворителем, подобный модифицированный TM2 сохраняет по меньшей мере 50% биотин-связывающей активности, которая была до обработки. Концентрация органического растворителя, используемого при обработке, составляет по меньшей мере 60% или более, предпочтительно 65% или более, 70% или более, 75% или более, и наиболее предпочтительно - 80%. Верхний предел концентрации органического растворителя не превышает 90%. Время обработки апротонным полярным органическим растворителем составляет по меньшей мере 10 мин, предпочтительно 20 мин или более, наиболее предпочтительно - 30 мин или более. Данная обработка может проводится, без ограничения, при комнатной температуре (25°C).

Примеры используемых в данном контексте апротонных полярных органических растворителей включают без ограничения диметилсульфоксид (DMSO), тетрагидрофуран (THF), ацетон, ацетонитрил и N,N-диметилформамид (DMF). Особенно предпочтительным апротонным полярным растворителем является DMSO.

Используемая в настоящем тексте фраза «сохраняет структуру белка» после тепловой обработки означает, что даже после тепловой обработки модифицированный ТМ2 настоящего изобретения сохраняет ту же конформацию белка, как и изначальный ТМ2. Термин «конформация белка» относится к вторичной и более высоким структурам белка, предпочтительно к третичной или четвертичной структуре.

Используемая в настоящем тексте фраза «сохраняет по меньшей мере 50% биотин-связывающей активности» означает, что модифицированный ТМ2 настоящего изобретения сохраняет биотин-связывающую активность, которая измеряется после тепловой обработки или обработки растворителем, на уровне по меньшей мере 50% от таковой до обработки. Верхний предел температуры при тепловой обработке составляет 100°C.

Кроме того, модифицированный ТМ2 настоящего изобретения, представляющий собой белок, включающий себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и обладающий биотин-связывающей активностью, отличается тем, что аспарагин в положении 115 SEQ ID NO: 2 заменен на цистеин. Более предпочтительно, модифицированный ТМ2 настоящего изобретения (TM2 N115C) отличается тем, что аспарагин в положении 115 SEQ ID NO: 2 заменен на цистеин (SEQ ID NO: 4).

Аминокислотные остатки, желательно не модифицированные в модифицированном TM2 настоящего изобретения

Модификация аминокислотных остатков в модифицированном ТМ2 настоящего изобретения не должна влиять на биотин-связывающую активность. В свете этого, предпочтительным является, чтобы четыре остатка триптофана (W69, W80, W96 и W108) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 не были модифицированы в мутанте тамавидина 2, хотя это и не является обязательным. Или же, в случае, если эти аминокислотные остатки модифицируются, данные аминокислоты предпочтительно заменяются таковыми, имеющими сходные свойства или структуру, к примеру, фенилаланином (F). Кроме этого, желательным является, чтобы аминокислотные остатки (N14, S18, Y34, S36, S76, T78 и D116), которые могут напрямую взаимодействовать с биотином, также оставались немодифицированными. Или же, в случае, если эти аминокислотные остатки модифицируются, данные аминокислоты предпочтительно заменяются таковыми, имеющими сходные свойства или структуру, таким образом, чтобы сохранять способность связываться биотином. К примеру, аспарагин (N14) заменяется на глутамин (Q) или аспарагиновую кислоту (D), предпочтительно на аспарагиновую кислоту; аспарагиновая кислота (D40) заменяется на аспарагин (N); серин (S18, S36 или S76) заменяется на треонин (T) или тирозин (Y), предпочтительно на тирозин, тирозин (Y34) заменяется на серин (S), треонин (T) или фенилаланин (F), предпочтительно на фенилаланин; треонин (T78) заменяется на серин (S) или тирозин (Y), предпочтительно на серин; и аспарагиновая кислота (D116) заменяется на глутаминовую кислоту (E) или аспарагин (N), предпочтительно на аспарагин.

Способ модификации аминокислот

Модифицированный ТМ2 настоящего изобретения может быть получен путем модификации аминокислоты(от) с применением любого без особого ограничения способа, вносящего мутацию в аминокислотную последовательность. Предпочтительно, модификация вводится в нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный белок настоящего изобретения. К примеру, для модификации аминокислоты в специфическом положении аминокислотной последовательности может быть применен способ, включающий ПЦР (Higuchi, et al., (1988), Nucleic Acid Res., 16: 7351-7367; Ho, et al., (1989), Gene, 77: 51-59). Более конкретно, желаемый мутант может быть получен при помощи ПЦР с использованием праймера, содержащего некомплементарный участок в кодоне, соответствующем целевой мутации, с последующим получением и экспрессией кодирующей желаемый мутант ДНК. Мутант, содержащий делецию, замену, инсерцию и/или одну или более дополнительных аминокислот может быть получен таким известным способом, как сайт-направленный мутагенез ДНК, кодирующей белок дикого типа.

Нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок ТМ2

В настоящем изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок ТМ2 настоящего изобретения. В нуклеотидной последовательности подобной нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1), кодирующая белок ТМ2 дикого типа, модифицируется в нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированные аминокислоты модифицированного белка ТМ2. Любая модифицированная нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислоту или аминокислоты после модификации, может быть использована без ограничения. Примеры модифицированной нуклеотидной последовательности включают нуклеиновые кислоты, содержащие модифицированные нуклеотидные последовательности для модификации настоящего изобретения, включающие в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 (здесь и далее называемую «ген TM2») либо нуклеотидные последовательности, гибридизующиеся с комплементарными цепями последней в жестких условиях и кодирующие белки, обладающие биотин-связывающей активностью, достаточной для связывания с биотином.

Предпочтительно, нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Более предпочтительно нуклеиновая кислота настоящего изобретения включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.

Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность настоящего изобретения

В настоящем изобретении предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный белок ТМ2, предпочтительно экспрессионный вектор для экспрессии модифицированного белка ТМ2.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированный белок ТМ2 настоящего изобретения, соответствуют описанию, приведенному в разделе «Нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированный белок ТМ2» и могут быть использованы без ограничений. Желательно, чтобы промотор, функционирующий в желательном хозяине, и терминатор были включены в состав нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный белок ТМ2, фланкируя последнюю с 5' и 3' конца, соответственно.

Вектор настоящего изобретения предпочтительно представляет собой экспрессионный вектор. Экспрессионный вектор включает в себя блок, предназначенный для репликации в желательном хозяине, к примеру, сайт начал репликации, и может включать в себя маркерные гены, кодирующие гены устойчивости к определенным субстанциям, предназначенные для селекции в клетке-хозяине, в дополнение к экспрессионному блоку (промотор, регион, кодирующий модифицированный белок ТМ2 и терминатор) согласно вышеописанному. Может быть использован без ограничения любой хозяин, предпочтительно - E.coli. Экспрессионный вектор может содержать подходящую систему регуляции экспрессии, такую как систему лактозного репрессора в E.coli.

Подложка с иммобилизованным модифицированным ТМ2

В настоящем изобретении предложена подложка, на которой иммобилизован модифицированный ТМ2 настоящего изобретения.

Любой известный материал подложки может быть использован, и примеры таких материалов включают без ограничения целлюлозу, тефлон (ТМ), нитроцеллюлозу, агарозу с высокой степенью сшивки, декстран, хитозан, полистирол, полиакриламид, сложный полиэфир, поликарбонат, полиамид, полипропилен, нейлон, поливинилиден-дифторил, латекс, оксид кремния, стекло, стекловолокно, золото, платина, серебро, медь, железо, нержавеющая сталь, феррит, кремниевая подложка, полиэтилен высокой плотности, полиэтиленимин, полимолочная кислота, каучук, полисахариды, углерод и комбинации вышеперечисленного. Предпочтительными являются материалы, обладающие определенным уровнем прочности, стабильностью состава и низким уровнем неспецифического связывания.

Примеры формы твердой подложки включают без ограничения шарики, магнитные шарики, тонкие пленки, микрокапиллярные трубочки, фильтры, планшеты, микропланшеты, углеродные нанотрубки и сенсорные чипы. Твердые плоскостные подложки, такие как тонкая пленка или планшет, могут быть снабжены лунками, бороздками, фильтрующим дном, в соответствии с известным в данной области техники.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, шарики могут иметь диаметр сферы от приблизительно 25 нм до приблизительно 1 мм. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, диаметр шариков находится в диапазоне от приблизительно 10 нм до приблизительно 10 мкм. Размер шариков может быть выбран в зависимости от конкретного применения.

Иммобилизация белка на подложки особым образом не ограничивается и может быть выполнена любым известным способом иммобилизации белка на подложке. Конкретные способы иммобилизации могут быть соответствующим образом выбраны специалистами в данной области техники в зависимости от типа подложки.

Способ тепловой очистки модифицированного ТМ2

Кроме этого, в настоящем изобретении предложен способ термической очистки модифицированного ТМ2 настоящего изобретения. Модифицированный белок ТМ2 настоящего изобретения обладает выраженной устойчивостью к нагреванию, за счет которой изначальная структура белка сохраняется без денатурации даже при нагревании в жестких условиях, приводящих к денатурации большинства белков. Так, образец, содержащий модифицированный белок ТМ2 настоящего изобретения подвергают тепловой обработке при по меньшей мере 90°C на протяжении не менее 10 мин с последующим отбором интактного неденатурированного белка, таким образом, данный белок может быть очищен. Данный способ, включающий тепловую обработку, применяется не только для очистки модифицированного белка ТМ2, но также для отделения, концентрации, фиксирования и детекции данного белка.

Условия тепловой обработки в данном контексте составляют по меньшей мере 90°C на протяжении не менее 10 мин, предпочтительно 20 мин, более предпочтительно 30 мин; предпочтительно, 95°C в течение 30 мин, 98°C в течение 30 мин, 99°C в течение 30 мин; особенно предпочтительно - 99,9°C в течение 30 мин. Конкретные примеры способов отбора неденатурированного белка включают в себя без ограничения осаждение денатурированного белка центрифугированием и отбор супернатанта, фильтрация и молекулярно-ситовая хроматография.

Способ детекции модифицированного TM2 с применением органического растворителя

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ очистки связанной с биотином субстанции в системе, содержащей органический растворитель, с применением модифицированного ТМ2 настоящего изобретения, обладающего устойчивостью к органическим растворителям. Данный способ настоящего изобретения включает в себя следующие этапы:

1) приведение подложки, связывающей модифицированный ТМ2, в контакт со связанной с биотином субстанцией, в результате которого связанная с биотином субстанция связывается с подложкой;

2) отмывка загрязнений, не связавшихся с подложкой, раствором, содержащим от 60% до 80% апротонного полярного растворителя; и

3) отбор связанной с биотином субстанции, связавшейся с подложкой. Данный способ, включающий в себя процесс промывки апротонным полярным растворителем, может быть применен не только для очистки модифицированного белка ТМ2, но также для отделения, концентрации, фиксирования и детекции связанной с биотином субстанции.

Термин «связанная с биотином субстанция», используемый в настоящем описании, относится к субстанции, связанной с биотином прямым или непрямым способом. Прямое связывание субстанции с биотином может быть достигнуто ковалентным связыванием. Непрямое связывание биотина и субстанции может быть достигнуто с использованием дополнительного линкера между субстанцией и лигандом, ковалентно связанным с биотином, за счет ковалентного или ионного связывания, водородных связей или гидрофобных взаимодействий. Конкретные примеры непрямого связывания включают связывание молекулы антигена с биотинилированным антителом посредством антиген-антительной реакции.

К примеру, в случае очистки желаемого белкового антигена, аналит, содержащий данный белковый антиген, сначала инкубируется в подходящем буферном растворе с биотинилированным антителом, специфически связывающимся с белковым антигеном. Биотинилирование антител может быть выполнено, к примеру, с использованием коммерчески доступного набора Pierce или других производителей. Далее, добавляется твердая подложка (к примеру, магнитные шарики) с прикрепленным к ней модифицированным ТМ2, и смесь перемешивается. Комплексы (белковый антиген)-(биотин-модифицированный ТМ2 настоящего изобретения)-(магнитный шарик) далее отделяются при помощи магнита, супернатант отбрасывается, после чего следует промывка подходящим буферным раствором, содержащим апротонный полярный растворитель. Далее магнит убирают, и комплексы суспендируют в желаемом буферном растворе для завершения очистки белкового антигена. Таким образом, способ настоящего изобретения позволяет осуществлять промывку буферным раствором, содержащем апротонный полярный растворитель, для эффективной очистки белкового антигена с пониженным количеством загрязнений.

Концентрация апротонного полярного растворителя в растворе, используемом для такой промывки, варьирует от приблизительно 60% до 80%, предпочтительно от 65% до 75%, более предпочтительно 70%. Предпочтительным апротонным полярным растворителем является диметилсульфоксид.

TM2 N115C настоящего изобретения, обладающий высокой устойчивостью к диметилсульфоксиду, может быть использован для реакции с такой биотинилированной субстанцией, как липид-содержащая субстанция, плохо растворимая в воде и растворимая только в растворах диметилсульфоксида высокой (от 60% до 80%) диметилсульфоксида.

ПРИМЕРЫ

1. Дизайн модифицированного тамавидина 2 для улучшения устойчивости к нагреванию

Был выполнен дизайн мутанта TM2 N115C путем замены тамавидина 2 на цистеин (Cys).

2. Конструкция гена модифицированного тамавидина 2 и его экспрессия в E.coli

2-1. Конструкция гена

Была проведена ПЦР с использованием плазмиды (TM2/pTrc99A) (WO02/072817), т.е. гена тамавидина 2, вставленного в экспрессионный вектор для E. coli (pTrc99A), в качестве матрицы. Последовательности использованных праймеров (SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO: 8) приведены в таблице 1.

Подчеркнутые сегменты представляют собой сайты рестрикционных ферментов, сегменты, набранные жирным курсивом, соответствуют стартовому и стоп-кодонам. Заменяемые кодоны набраны в нижнем регистре.

TM2 N115C

Были проведены раздельные реакции ПЦР с использованием содержащей ТМ2 плазмиды TM2/pTrc99A в качестве матрицы и комбинаций праймеров Tm2NtermPci и TM2 N115C RV либо Tm2CtermBam и TM2 N115C FW. Полученный продукт подвергали агарозному гель-электрофорезу с использованием низкоплавкой агарозы, и продукт выделяли из геля. Второй раунд ПЦР (ПЦР с перекрыванием) проводили с использованием комбинации праймеров Tm2NtermPci и Tm2CtermBam и двух очищенных ПЦР-продуктов в качестве матриц. ПЦР проводили в 50 мкл реакционного раствора, содержащего плазмиду, буфер 10×PyroBest (TaKaRa) (5 мкл), 2,5 mM дНТФ (4 мкл), праймеры (25 пмоль каждого), ДНК-полимеразу PyroBest (TaKaRa) (0,5 мкл) со следующими параметрами реакции: 1 цикл - 96°C - 3 мин; 15 циклов - 96°C - 1 мин, 55°C - 1 мин, и 72°C - 1 мин; и 1 цикл - 72°C - 6 мин.

Полученный ПЦР-продукт клонировали в вектор pCR4 Blunt TOPO (Invitrogen). Плазмиду вводили в клетки TB1 E. coli электропорацией, и плазмидную ДНК экстрагировали обычным (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition) для определения нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта с обоих концов.

Клон с подтвержденным наличием желаемой мутации подвергали расщеплению PciI и BamHI, и далее - электрофорезу в низкоплавкой агарозе для очистки. Экспрессионный вектор для E. coli получали расщеплением pTrc99A рестрикционными ферментами NcoI и BamHI. Фрагменты ДНК и вектора, обработанные рестрикционными ферментами, лигировали при помощи набора для лигирования (Takara). Продукт лигирования трансформировали в клетки BL21 E.coli, после чего для дальнейших экспрессионных экспериментов выявляли клоны, включившие в свой состав гены вставки, при помощи ПЦР с использованием колоний в качестве матрицы.

2-2. Экспрессия в E.coli

Отдельную колонию E. coli, включивших тамавидин 2 и мутант тамавидина 2, полученных согласно вышеописанному, инокулировали в среду LB, содержащую антибиотик ампициллин (конечная концентрация 100 мкг/мл), культивировали при встряхивании в течение ночи при 37°. Продукт далее инокулировали в среду LB, содержащую ампициллин, культивировали 2 часа при 37°C, после чего для индукции экспрессии добавляли изопропил-β-D(-)-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ, и дополнительно культивировали от 5 до 6 часов.

Далее клетки собирали центрифугированием, суспендировали в 50 мМ CAPS (pH 12), содержащем 50 мМ NaCl. Полученную суспензию обрабатывали ультразвуком, после чего центрифугировали, и к супернатанту добавляли 2-иминобиотиновую агарозу (SIGMA). pH смеси доводили до 12 при помощи NaOH и инкубировали при комнатной температуре. Далее смесью набивали открытую колонку, после чего колонку промывали 10 колоночными объемами 50 мМ CAPS (pH 12), содержащего 500 мМ NaCl. Белок далее элюировали 5 колоночными объемами 50 мМ NH₄OAc (pH 4). Для дальнейшего анализа элюированные фракции диализовали против 0,1 M HEPES (pH 7,4), содержащего 50 мМ NaCl. Из 300 мл культуральной среды получали около 14 мг очищенного белка TM2 N115C. Степень чистоты полученного TM2 N115C составляла 95% или более.

3. Тест на устойчивость модифицированного тамавидина 2 к нагреванию

3-1. Анализ с флуоресцентным биотином

Устойчивость очищенных TM2 и TM2 N115C к нагреванию анализировали исходя из их способности связывать флуоресцентный биотин. Более конкретно, биотин-связывающую способность TM2 N115C при высокой температуре сопоставляли с таковой TM2 на основании способности флуоресцентного биотина к снижению интенсивности флуоресценции при связывании с биотин-связывающим сайтом биотин-связывающего белка.

Каждый очищенный белок разводили в 20 mM KPi (pH 7) до концентрации около 0,1 мкг/мл, и полученные растворы инкубировали при комнатной температуре либо нагревали при 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, 90°C и 99°C в течение 20 мин, соответственно. Каждый раствор после тепловой обработки поэтапно добавляли в различном количестве в 150 мкл буфера для анализа (50 мМ Na₂PO₄, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA (pH 7,5)). Каждый из полученных растворов смешивали с раствором 50 пмоль флуоресцентного биотина (биотин-4-флуоресцеина, Molecular probe) и оставляли для протекания реакции при комнатной температуре на 20 мин, после чего интенсивность флуоресценции на Ex=460 нм при Em=525 нм измеряли на приборе Infinite M200 (TECAN). Кроме того, для выявления эффекта связывания через дисульфидную связь (S-S), к разведенному раствору белка добавляли 100 мМ DTT, после чего оставляли при комнатной температуре на 30 мин. Полученную смесь далее подвергали тепловой обработке согласно вышеописанным этапам для определения флуоресцентного биотина.

В результате, биотин-связывающая активность ТМ2 в отношении флуоресцентного биотина при 90% снижалась, в то время как активность TM2 N115C сохранялась при 99.9°C. Температура, при которой интенсивность флуоресценции снижалась на 50% от таковой, демонстрируемой ненагретым образом, составляла по меньшей мере 99,9°C для TM2 N115C против 85°C для TM2. Связывающая активность TM2 N115C сохранялась, хотя и с небольшим ослаблением, после пролонгированной тепловой обработки при 99,9°C на протяжении 60 мин, в то время как связывающая активность ТМ2, авидина и стрептавидина почти полностью исчезала после тепловой обработки при 99,9°C на протяжении 60 мин.

Было выявлено, что активность TM2 N115C снижается после обработки DTT при 90°C на протяжении 20 мин. Это указывает на то, что дисульфидная связь (S-S) в TM2 N115C, образованная введенным цистеиновым остатком, возможно, влияет на улучшение устойчивости к нагреванию.

3-2. Анализ связывания с использованием биотинилированной HRP

TM2 N115C, TM2, авидин, нейтравидин и стрептавидин нагревали при 99,9°C на протяжении 1, 2, 4, 10, 20 или 32 мин, далее иммобилизовывали на микропланшете для гидрофобного связывания (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., тип H), после чего вводили в реакцию с биотинилированной пероксидазой хрена (HRP) (VECTOR) для определения активности HRP. На Фигуре 1 приведены результаты измерения активности проб, нагретых при 99,9°C в течение 1, 2, 4, 10 и 20 мин. На Фигуре 2 и в Таблице 2 приведены результаты измерения активность проб, процессированных при 99,9°C в течение 32 мин. На Фигуре 2, белые столбики относятся к результатам для ненагретых проб, а черные столбики относятся к пробам, подвергшимся тепловой обработке.

Результаты демонстрируют, что авидин, нейтравидин и стрептавидин не демонстрируют почти никакой активности после тепловой обработки при 99,9°C в течение 32 мин, в то время как TM2 после такой обработки сохраняет от 10 до 12% изначальной активности (40% изначальной активности после нагревания при 99,9°C в течение 20 мин). Кроме того, TM2 N115C практически полностью (от 92% до 100%) сохраняет биотин-связывающую активность даже после нагревания при 99,9°C в течение 30 или 32 мин (Таблица 2). Устойчивость TM2 N115C к нагреванию значительно выше, нежели в ранее опубликованных технологиях; почти полная потеря активности мутанта авидина I117C после нагревания при 99,9°C в течение 5 мин (Nordlund et al., (2003), J. Biol. Chem., 278: 2479-2483), и снижение активность мутанта стрептавидина H127C до 20% при 95°C в течение 10 мин. (Reznik et al. (1996), Nat. Biotechnol., 14: 1007-1011).

4. Тест на устойчивость модифицированного тамавидина 2 к органическому растворителю.

4-1. Тест на устойчивость к DMSO

Биотинилированные магнитные шарики получали реакцией NHS-PEG₁₂-биотина (PIERCE) с шариками Dynabeads M270-Amine (Dynal). Растворы каждого из авидин-подобных белков в конечной концентрации 25 мкг/мл (TM2 N115C, TM2, авидин, нейтравидин и стрептавидин) и биотинилированные магнитные шарики смешивали путем многократного переворачивания на протяжении 30 мин при комнатной температуре (25°C) в присутствие диметидсульфоксида (DMSO) в конечной концентрации 0%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% и 90%. В ходе данной операции авидин-подобные белки иммобилизировались на поверхности магнитных шариков. Магнитные шарики, на которых иммобилизировались авидин-подобные белки, промывали 0,2% Tween 20/TBS и распределяли в 96-луночном планшете аликвотами по 5 мкл. Биотинилированную HRP (VECTOR), разведенную в 5000 раз в PBS, содержащем 2% BSA, добавляли в каждую лунку аликвотами по 200 мкл, после чего перемешивали со встряхиванием при комнатной температуре на протяжении 1 часа. Магнитные шарики далее промывали, и активность HRP иммобилизованной на магнитных шариках определяли при помощи набора 1-step Ultra TMB-ELISA (PIERCE). На Фигуре 3 приведены полученные результаты. Фигуры 3A, 3B, 3C и 3D демонстрируют результаты, соответствующие TM2, TM2 N115C, стрептавидину и авидину, соответственно.

Фигура 3 демонстрирует, что TM2 N115C полностью сохраняет биотин-связывающую активность даже в присутствие 70% DMSO, и все еще сохраняет 50% изначальной биотин-связывающей активности даже в присутствие 80% DMSO, в то время как тамавидин дикого типа (TM2) и авидин теряют большую часть биотин-связывающей способности в присутствие 60% DMSO, а стрептавидин теряет большую часть биотин-связывающей способности в присутствие 40% DMSO.

5. Взаимодействие между TM2 N115C и биотином

Анализ аффинности к Биотин-Lc-BSA

Взаимодействие TM2 N115C с биотином анализировали при помощи BIAcore 3000. Таблица 3 демонстрирует результаты анализа взаимодействия с Биотин-Lc-BSA. Было найдено, что TM2 N115C обладает почти таким же уровнем биотин-связывающей активности, как и TM2, поскольку константа скорости ассоциации для TM2 ka составляет (1,0±0,3)×10⁶ (М^-1·с^-1), а константа скорости диссоциации <5×10^-6с^-1 (ниже предела детекции BIAcore 3000) (Takakura et al. (2009), FEBS J., 276: 1383-1397).

Анализ аффинности белка к Биотин-Lc-BSA после тепловой обработки

Тест с использованием флуоресцентного биотина указывает на то, что активность TM2 N115C в связывании флуоресцентного биотина не снижается после тепловой обработки при 90°C в течение 20 мин, в то время как таковая ТМ2 снижается. Далее была определена аффинность белка к Биотин-Lc-BSA после тепловой обработки. Каждый из растворов TM2 и TM N115C разбавляли до приблизительно 0,6 мг/мл (20 мМ KPi (pH 7)). Каждый из растворов нагревали при 90°C на протяжении 20 мин, после чего центрифугировали при 15000 и 4°C на протяжении 10 мин. Супернатант собирали, концентрацию определяли по A₂₈₀, после чего определяли аффинность к Биотин-Lc-BSA при помощи BIAcore таким же образом, как описано выше.

Таблица 3 демонстрирует аналитические результаты взаимодействия с Биотин-Lc-BSA после нагревания при 90°C, полученные при помощи BIAcore. TM2 N115C демонстрирует отсутствие снижения аффинности к биотину даже после нагревания при 90°C, в то время как TM2 демонстрирует снижение аффинности к биотину после нагревания при 90°C.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> JAPAN TOBACCO INC.

<120> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ТАМАВИДИН

<130> FA0392-11161

<150> JP 2010-293776

<151> 2010-12-28

<160> 8

<210> 1

<220> 426

<212> ДНК

<213> Pleurotus cornucopiae

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(426)

<223>

<400> 1

atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48

Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu

1 5 10 15

aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96

Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly

20 25 30

aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144

Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser

35 40 45

ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192

Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly

50 55 60

tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg 240

Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288

Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp

85 90 95

ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336

Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu

100 105 110

gtg ggg aat gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384

Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile

115 120 125

gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426

Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys

130 135 140

<210> 2

<211> 141

<212> PRT

<213> Pleurotus cornucopiae

<400> 2

Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu

1 5 10 15

Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly

20 25 30

Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser

35 40 45

Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly

50 55 60

Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly Asn Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile

115 120 125

Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys

130 135 140

<210> 3

<211> 426

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TM2 N115C

<400> 3

atg tca gac gtt caa tct tca ctc acc gga acc tgg tac aat gaa ctc 48

Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu

1 5 10 15

aac tcc aag atg gaa ttg act gca aac aaa gac ggt act ctc act gga 96

Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly

20 25 30

aag tac ctc tcc aaa gtt ggg gat gtc tac gtg ccc tac cca ctc tct 144

Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser

35 40 45

ggt cgc tat aac ctc caa ccc ccc gcg gga caa ggc gtc gct ctt ggg 192

Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly

50 55 60

tgg gcg gta tcc tgg gag aac agt aaa att cat tcc gct acg aca tgg 240

Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

agc gga cag ttc ttc tct gag tcg tct cca gtg att ctt act cag tgg 288

Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp

85 90 95

ttg ttg tca tcg agc act gcg cgt ggg gac gta tgg gaa tcc aca ctt 336

Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu

100 105 110

gtg ggg tgt gat tcg ttt aca aag acg gcg ccg act gag cag cag atc 384

Val Gly Cys Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile

115 120 125

gct cat gct caa ctc cat tgt cgc gca ccg agg ttg aag taa 426

Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys

130 135 140

<210> 4

<211> 141

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> TM2 N115C

<400> 4

Met Ser Asp Val Gln Ser Ser Leu Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Glu Leu

1 5 10 15

Asn Ser Lys Met Glu Leu Thr Ala Asn Lys Asp Gly Thr Leu Thr Gly

20 25 30

Lys Tyr Leu Ser Lys Val Gly Asp Val Tyr Val Pro Tyr Pro Leu Ser

35 40 45

Gly Arg Tyr Asn Leu Gln Pro Pro Ala Gly Gln Gly Val Ala Leu Gly

50 55 60

Trp Ala Val Ser Trp Glu Asn Ser Lys Ile His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Phe Phe Ser Glu Ser Ser Pro Val Ile Leu Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Ser Ser Ser Thr Ala Arg Gly Asp Val Trp Glu Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly Cys Asp Ser Phe Thr Lys Thr Ala Pro Thr Glu Gln Gln Ile

115 120 125

Ala His Ala Gln Leu His Cys Arg Ala Pro Arg Leu Lys

130 135 140

<210> 5

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер Tm2NtermPci

<400> 5

aaaacatgtc agacgttcaa tcttc 25

<210> 6

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер Tm2CtermBam

<400> 6

tttggatcct tacttcaacc tcggtgcg 28

<210> 7

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для PCR Tm2 N115C

<400> 7

cttgtggggt gtgattcgtt t 21

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для PCR Tm2 N115C

<400> 8

aaacgaatca caccccacaa g 21

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модифицированному тамавидину, и может быть использовано для детекции связанной с биотином субстанции. Получают модифицированный биотин-связывающий белок на основе тамавидина с последовательностью SEQ ID NO: 2, который содержит до 7 мутаций и при этом остаток аспарагина в 115 положении заменен на цистеин. Изобретение позволяет повысить устойчивость биотин-связывающего белка к нагреванию и обработке диметилсульфоксидом. 7 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 5 пр.

Формула