Полинуклеотидная молекула, кодирующая белок-регулятор выработки авермектина в streptomyces avermitilis (варианты), содержащие ее вектор клонирования и штамм; способы скрининга мутации в регуляторном гене, получения генетически модифицированных клеток и по - RU2221042C2
Код документа: RU2221042C2
Чертежи
Показать все 104 чертежа(ей)
Описание
Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)ф
Реферат
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медико-биологической промышленности при получении авермектинов. Идентифицированы и охарактеризованы два новых гена (обозначены aveR1 и aveR2) Streptomyces avermitilis, кодирующих полипептиды, участвующие в регуляции экспрессии фермента авермектинполикетидсинтазы (РКS) и соответственно биосинтеза авермектинов. С помощью мутаций, приводящих к инактивации одного или обоих названных генов, получены культуры клеток Streptomyces avermitilis, характеризующиеся повышенным по сравнению со штаммами дикого типа уровнем выработки авермектинов. Использование изобретения позволяет повысить продуктивность штаммов стрептомицетов, применяемых в производстве антибиотиков. 8 с. и 13 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.
Формула
1. Выделенная полинуклеотидная молекула, кодирующая генный продукт, который регулирует
выработку авермектина в Streptomyces avermitilis, включающая нуклеотидную последовательность, в соответствии с генетическим кодом определяющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, или
нуклеотидную последовательность, которая более чем на 80% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 от 1112-го нуклеотида до 2317-го нуклеотида, и гибридизуется в условиях высокой степени
жесткости с комплементом полинуклеотидной молекулы, включающей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 от 1112-го нуклеотида до 2317-го нуклеотида.
2. Выделенная полинуклеотидная молекула по п.1, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 от 1112-го нуклеотида до 2317-го нуклеотида.
3.
Выделенная полинуклеотидная молекула по п.2, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1.
4. Выделенная полинуклеотидная молекула, кодирующая
генный продукт, который регулирует выработку авермектина в Streptomyces avermitilis, включающая нуклеотидную последовательность, в соответствии с генетическим кодом определяющую аминокислотную
последовательность SEQ ID NO:4 или нуклеотидную последовательность, которая более чем на 80% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:3 от 2314-го нуклеотида до 3021-го нуклеотида, и
гибридизуется в условиях высокой степени жесткости с комплементом полинуклеотидной молекулы, включающей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 от 2314-го нуклеотида до 3021-го
нуклеотида.
5. Выделенная полинуклеотидная молекула по п.4, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 от 2314-го нуклеотида до 3021-го
нуклеотида.
6. Выделенная полинуклеотидная молекула по п.4, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3.
7. Выделенная полинуклеотидная молекула, кодирующая генный продукт или продукты, которые регулируют выработку авермектина в Streptomyces avermitilis, включающая нуклеотидную
последовательность, в соответствии с генетическим кодом определяющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или нуклеотидную последовательность,
которая более чем на 80% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 от 1112-го нуклеотида до 3021-го нуклеотида, и гибридизуется в условиях высокой степени жесткости с комплементом
полинуклеотидной молекулы, включающей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 от 1112-го нуклеотида до 3021-го нуклеотида.
8. Выделенная
полинуклеотидная молекула по п.7, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 от 1112-го нуклеотида до 2317-го нуклеотида и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 от 2314-го
нуклеотида
до 3021-го нуклеотида.
9. Выделенная полинуклеотидная молекула по п.8, включающая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 от 1112-го
нуклеотида до
3021-го нуклеотида.
10. Выделенная полинуклеотидная молекула по п.9, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1.
11. Рекомбинантный вектор для клонирования в клетках-хозяевах, включающий полинуклеотидную молекулу, кодирующую генный продукт, который регулирует выработку
авермектина в
Streptomyces avermitilis, включающую нуклеотидную последовательность, в соответствии с генетическим кодом определяющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или
в соответствии
с генетическим кодом определяющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 и аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, при том, что полинуклеотидная молекула функционально
соединена с одним
или большим числом регуляторных элементов.
12. Рекомбинантный вектор по п.11, дополнительно включающий нуклеотидную
последовательность, кодирующую
селективный маркер или продукт репортерного гена.
13. Рекомбинантный вектор по п.12, отличающийся тем, что
аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2
кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 от 1112-го нуклеотида до 2317-го нуклеотида и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:4
кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID
NO:3 от 2314-го нуклеотида до 3021-го нуклеотида.
14. Рекомбинантный вектор по п.12, предназначенный
для встраивания в клетку-хозяин.
15. Способ скрининга мутации в гене aveR1, имеющем нуклеотидную последовательность по п.1, или в гене aveR2, имеющем
нуклеотидную последовательность по п.4, или в
обоих указанных генах aveRI и aveR2 Streptomyces avermitilis, которая способна обусловливать достоверное повышение содержания авермектинов,
вырабатываемых клетками штамма Streptomyces avermitilis,
несущими генную мутацию, по сравнению с клетками того же штамма Streptomyces avermitilis, которые не несут генную мутацию, включающий (а)
получение клеток штамма Streptomyces avermitilis и измерение
содержания авермектинов, вырабатываемых клетками данного штамма; (b) направленное внесение определенной мутации в последовательность гена
aveRI, или гена aveR2, или обоих генов aveRI и aveR2 клеток
штамма Streptomyces avermitilis согласно стадии (а); (с) сравнение содержания авермектинов, вырабатываемых клетками, несущими генную
мутацию, полученную согласно стадии (b), с содержанием авермектинов,
вырабатываемых клетками согласно стадии (а), которые не несут указанную мутацию; (d) признание мутации, отвечающей указанному
назначению, если содержание авермектинов, вырабатываемых клетками,
несущими генную мутацию, полученную согласно стадии (b), достоверно больше, чем содержание авермектинов, вырабатываемых клетками
согласно стадии (а), которые не несут данной мутации.
16. Способ получения генетически модифицированных клеток штамма Streptomyces avermitilis,
вырабатывающих отчетливо увеличенное количество авермектинов по сравнению
с немодифицированными клетками штамма Streptomyces avermitilis, включающий (а) получение клеток штамма Streptomyces
avermitilis и определение содержания вырабатываемых авермектинов; (b) направленное
мутирование гена aveRI, имеющего нуклеотидную последовательность по п.1, и/или гена aveR2, имеющего нуклеотидную
последовательность по п.4, в клетках штамма согласно стадии (а); (с) отбор мутированных
клеток, которые вырабатывают достоверно повышенное количество авермектинов, по сравнению с клетками того же
штамма Streptomyces avermitilis, которые не несут генную мутацию.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что мутацию осуществляют путем делетирования
части гена aveRI или гена aveR2 или путем замещения части гена aveRI или гена aveR2 другой или
гетерологичной нуклеотидной последовательностью.
18.
Способ по п.16, отличающийся тем, что мутацию осуществляют путем делетирования части обоих генов
aveRI и aveR2 или путем замещения части обоих генов aveRI и aveR2 другой или гетерологичной
нуклеотидной последовательностью.
19. Способ по п.16,
отличающийся тем, что мутацию осуществляют путем вставки другой или гетерологичной нуклеотидной
последовательности в ген aveRI или в ген aveR2.
20.
Штамм Streptomyces avermitilis DML (BRL), трансформированный плазмидой pSE201 (депозитарный номер
АТСС 203182), - продуцент авермектинов.
21. Способ
получения повышенного содержания авермектинов в культуре Streptomyces avermitilis, включающий стадии
(а), (b), (с) из п.16, (d) культивирование клеток штамма Streptomyces avermitilis, отобранных на
стадии (с) в культуральной среде в условиях, обеспечивающих или индуцирующих выработку авермектинов
этими клетками, и (е) выделение авермектинов из культуры.
