Новый промотор и пути его применения - RU2692646C2

Чертежи

Описание

Область техники

[0001] ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0002] Настоящая заявка заявляет преимущество приоритета по заявке на корейский патент №10-2015-0014587, поданной 29 января 2015 г. в Корейское ведомство по интеллектуальной собственности, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0003]

[0004] Один или несколько иллюстративных вариантов осуществления относятся к новому промотору и способу продуцирования целевого продукта с его помощью.

Уровень техники

[0005] Для продуцирования целевых продуктов, например, L-аминокислот, органических кислот или материалов на основе нуклеиновых кислот, с высоким выходом посредством применения микроорганизмов существует необходимость в избирательном контроле экспрессии генов, связанных с рядом метаболических процессов у микроорганизмов. В частности, существует необходимость в повышении экспрессии целевых генов, вовлеченных в путь биосинтеза целевых продуктов, и, например, можно осуществить модификацию последовательности, регулирующей экспрессию. Такая модификация последовательности, регулирующей экспрессию, может включать, например, замену нативного промотора сильным промотором, модификацию нативного промотора или модификацию последовательности Шайна-Дальгарно (SD). Замену нативного промотора сильным промотором применяли в большинстве случаев, и в этом отношении она считается существенно необходимой для разработки применимого промотора.

[0006] Сильные промоторы, известные из уровня техники, однако, ограничены и могут экспрессироваться только у ограниченного числа микроорганизмов. В некоторых случаях сильные промоторы могут быть неспособны продемонстрировать желаемые сильные эффекты экспрессии на различных уровнях интенсивности.

[0007] Тас-промотор, полученный из Escherichia coli, широко известен из уровня техники в качестве сильного промотора. В случае рода Corynebacterium новый промотор был разработан путем модификации нативного промотора (см. Gene, 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996). Например, сообщалось, что промотор, полученный из Corynebacterium ammoniagenes, обладает на приблизительно 10% более высокой активностью, чем tac-промотор, полученный из Е. coli (см. Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003). В дополнение, в качестве сильного промотора, полученного из Corynebacterium ammoniagenesis, были разработаны промоторы Pcj1-Pcj7 с различными уровнями интенсивности, которые обладали сильной промоторной активностью, по меньшей мере в 10 раз превышающей таковую у tac-промотора (см. KR 10-0620092). В дополнение, сообщалось, что промотор, полученный из Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497), обладает более сильной активностью, чем tac-промотор, но его экспрессия у микроорганизма, отличного от микроорганизма, относящегося к роду Brevibacterium, затруднена (см. US 5593781).

[0008] В этом отношении, когда авторы идеи настоящего изобретения исследовали участок, содержащий промоторную последовательность, которая может характеризоваться различными уровнями интенсивности во множестве различных микроорганизмов, было обнаружено, что новый промотор, синтезированный в соответствии с идеей настоящего изобретения, экспрессируется во множестве различных микроорганизмов и демонстрирует намного более сильные эффекты экспрессии, чем существующие промоторы, известные из уровня техники, довершая таким образом идею настоящего изобретения.

Раскрытие настоящего изобретения

Техническая задача

[0009] Один или несколько иллюстративных вариантов осуществления включают новый промотор, последовательность, регулирующую экспрессию, содержащую новый промотор, вектор, содержащий новый промотор, клетку-хозяина, содержащую вектор, и способ продуцирования целевого продукта с помощью клетки-хозяина.

Решение задачи

[00010] В соответствии с одним или несколькими иллюстративными вариантами осуществления предусмотрен промотор, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1. В рамках идеи настоящего изобретения промотор называют "промотором о2" (далее в данном документе именуемым как "Ро2").

[00011] Термин "промотор", используемый в данном документе, относится к участку ДНК, с которым соединяется РНК-полимераза для обеспечения инициации транскрипции гена, функционально связанного с промотором, и который может располагаться на 5'-конце сайта инициации транскрипции мРНК.

[00012] Как используется в данном документе, полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, можно в некоторой степени модифицировать в соответствии с недавними исследованиями некоторых методик, таких как методика направленной эволюции или методика сайт-направленного мутагенеза. Например, промотор, обладающий гомологией, составляющей 70% или более, 80% или более, 90% или более или 95% или более, с нуклеотидной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 1, также включен в объем идеи настоящего изобретения.

[00013] Термин "гомология", используемый в данном документе, относится к степени идентичности последовательностей (представленной в виде процентного значения) между полинуклеотидными последовательностями. В настоящем описании гомология последовательности, идентичной указанной полинуклеотидной последовательности, или последовательности, обладающей сходной активностью с указанной полинуклеотидной последовательностью, представлена в виде "% гомологии". Например, гомологию полинуклеотидных последовательностей можно определить посредством применения стандартного программного обеспечения, например, BLAST 2.0, для расчета параметров, таких как вес выравнивания, идентичность и подобие. В качестве альтернативы, гомологию полинуклеотидных последовательностей можно идентифицировать путем сравнения последовательностей в соответствии со способом гибридизации, осуществляемым в определенных условиях жесткости. Определенные и соответствующие условия для способа гибридизации можно определить с учетом способов, хорошо известных специалисту в данной области (см. выше в Sambrook et al., 1989).

[00014] В соответствии с одним или несколькими иллюстративными вариантами осуществления предусмотрена последовательность, регулирующая экспрессию, которая контролирует экспрессию целевого гена, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1.

[00015] Термин "последовательность, регулирующая экспрессию", используемый в данном документе, относится к последовательности ДНК, применяемой для экспрессии кодирующей последовательности, которая функционально связана с данной последовательностью ДНК в организме-хозяине. Такая последовательность, регулирующая экспрессию, может содержать промотор, требуемый для инициации транскрипции, операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы в мРНК, и последовательность для регуляции терминации транскрипции и трансляции. Например, последовательность, регулирующая экспрессию, подходящая для прокариот, может содержать промотор, операторную последовательность и сайт связывания рибосомы, но не ограничена ими. Последовательность, регулирующая экспрессию, содержит Ро2 согласно идее настоящего изобретения и при необходимости может быть определена специалистом в данной области как последовательность, регулирующая экспрессию, описанная выше.

[00016] В соответствии с одним или несколькими иллюстративными вариантами осуществления предусмотрен вектор, содержащий последовательность, регулирующую экспрессию, и целевой ген, функционально связанный с последовательностью, регулирующей экспрессию.

[00017] Термин "функционально связанный", используемый в данном документе, относится к связи между последовательностью, регулирующей экспрессию, которая контролирует целевой ген (например, промотором), и другими нуклеотидными последовательностями. В этом отношении последовательность, регулирующая экспрессию, может быть способна контролировать транскрипцию и/или трансляцию других нуклеотидных последовательностей.

[00018] Термин "вектор", используемый в данном документе, относится к ДНК-продукту, содержащему последовательности оснований полинуклеотида, кодирующего целевой белок, который функционально связан с соответствующей последовательностью, регулирующей экспрессию, для экспрессии целевого белка. В дополнение, множество нуклеотидных последовательностей может быть связано или рекомбинировано с вектором таким образом, что последовательность ДНК выбранного гена с соответствующей 3'-концевой нетранслируемой последовательностью и промотор можно ввести в клетку. Вектор может применяться для трансформации соответствующей клетки-хозяина и затем может реплицироваться независимо от генома клетки-хозяина. В качестве альтернативы, вектор может интегрироваться в геном клетки-хозяина. В дополнение, вектор может содержать промотор или его вариант и целевой ген и дополнительно может содержать точку начала репликации, промоторный регуляторный сайт, сайт связывания рибосом, сайт терминации транскрипции, селективный маркер или их комбинацию.

[00019] Вектор, применяемый в рамках идеи настоящего изобретения, конкретно не ограничен, при условии, что он может реплицироваться в клетке-хозяине, и можно применять любой вектор, доступный в данной области техники. Примеры вектора, обычно применяемого в данной области техники, включают природный или рекомбинантный плазмидный вектор, космидный вектор, вирусный вектор и бактериофаговый вектор. Примеры бактериофаговых и космидных векторов включают pWE15, М13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Харон 4А и Харон 21А, и примеры плазмидных векторов включают векторы на основе pBR, на основе pUC, на основе pBluescript II, на основе pGEM, на основе pTZ, на основе pCL и на основе рЕТ, но векторы ими не ограничены.

[00020] Целевой ген относится к гену, кодирующему продукт, для которого необходима экспрессия в избыточном количестве. Например, целевой ген может представлять собой ген, вовлеченный в продуцирование продукта, выбранного из группы, состоящей из аминокислот (например, L-аминокислоты), органических кислот и их комбинации. Более подробно, целевой ген может представлять собой ген, кодирующий фермент, вовлеченный в биосинтез аминокислот, ген, кодирующий фермент, вовлеченный в биосинтез органических кислот, или ген, кодирующий белок, вовлеченный в экспорт целевого продукта, но не ограничен ими.

[00021] В соответствии с одним или несколькими иллюстративными вариантами осуществления предусмотрена клетка-хозяин, содержащая вектор, где вектор содержит последовательность, регулирующую экспрессию, которая контролирует целевой ген и содержит промотор, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1, и целевой ген, функционально связанный с последовательностью, регулирующей экспрессию.

[00022] Клетка-хозяин конкретно не ограничена, при условии, что в микроорганизм, применяемый в качестве клетки-хозяина, можно ввести вектор, содержащий последовательность, регулирующую экспрессию, которая контролирует целевой ген и содержит промотор, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1, и целевой ген, функционально связанный с последовательностью, регулирующей экспрессию. Клетка-хозяин может являться как прокариотической клеткой, так и эукариотической клеткой, но в иллюстративном варианте осуществления может являться прокариотической клеткой. Например, клетка-хозяин может включать в себя штамм микроорганизма, относящегося к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacterium и роду Brevibacterium. Например, клетка-хозяин может представлять собой штамм микроорганизма, относящегося к роду Corynebacterium или роду Escherichia. Например, клетка-хозяин может представлять собой штамм микроорганизма, относящегося к Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum или Brevibacterium lactofermentum.

[00023] Введение вектора можно осуществлять, как описано в уровне техники, путем выбора подходящей методики в зависимости от клетки-хозяина. Введение вектора можно осуществлять, например, с помощью электропорации, теплового шока, осаждения фосфатом кальция (СаРО₄), осаждения хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекции, полиэтиленгликоля (PEG), способа с использованием DEAE-декстрана, способа с использованием катионных липосом, способа с использованием ацетата лития и DMSO или их комбинации, но без ограничения ими.

[00024] В соответствии с одним или несколькими иллюстративными вариантами осуществления предусмотрен способ продуцирования целевого продукта, при этом способ включает культивирование клетки-хозяина в среде, где клетка-хозяин содержит вектор, содержащий последовательность, регулирующую экспрессию, содержащую промотор, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1, и целевой ген, функционально связанный с последовательностью, регулирующей экспрессию; и извлечение целевого продукта из клетки-хозяина или среды, содержащей культивируемую клетку-хозяина.

[00025] Целевой продукт может быть выбран из группы, состоящей из аминокислот (например, L-аминокислоты), органических кислот и их комбинации. Термин "аминокислота" или "L-аминокислота", используемый в данном документе, как правило, относится к основной структурной единице белка, образующего живой организм, в которой аминогруппа и карбоксильная группа связаны с одним и тем же атомом углерода. Аминокислота может быть выбрана из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, треонина, серина, цистеина, цистина, метионина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутаминовой кислоты, дийодтирозина, лизина, аргинина, гистидина, фенилаланина, тирозина, триптофана, пролина, оксипролина и их комбинации, но не ограничена ими. Термин "органическая кислота", используемый в данном документе, относится к органическому соединению, обладающему кислотностью, и, например, может включать органическое соединение, имеющее карбоксильную группу и сульфоновую группу. Органическая кислота может включать, например, молочную кислоту, уксусную кислоту, янтарную кислоту, масляную кислоту, пальмитиновую кислоту, щавелевую кислоту, винную кислоту, пропионовую кислоту, гексеновую кислоту, каприновую кислоту, каприловую кислоту, валериановую кислоту или лимонную кислоту, но не ограничена ими.

[00026] Культивирование клетки-хозяина можно осуществлять в соответствии с типичными способами, известными из уровня техники. Среда, применяемая для культивирования клетки-хозяина, может содержать в качестве источника сахара сахар и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота, в отдельности или в виде смеси, но без ограничения ими. Среда, применяемая для культивирования клетки-хозяина, может содержать в качестве источника азота пептоны, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, маисовый экстракт, соевую муку и мочевину или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония или нитрат аммония, в отдельности или в виде смеси, но без ограничения ими. Среда, применяемая для культивирования клетки-хозяина, может содержать в качестве источника фосфора дигидроортофосфат калия или гидроортофосфат калия или его соответствующие натрийсодержащие соли, но без ограничения ими. Среда, применяемая для культивирования клетки-хозяина, может содержать соли металлов, необходимые для роста, такие как сульфат магния или сульфат железа, но при этом соли металлов не ограничены ими. В дополнение, в ходе культивирования клетки-хозяина в культуральную среду можно добавлять необходимые ростовые вещества, такие как аминокислоты и витамины или их подходящие предшественники. Такие материалы можно добавлять в культуральную среду в ходе культивирования клетки-хозяина соответствующим образом и, например, можно добавлять периодически или непрерывно.

[00027] Дополнительно, в ходе культивирования клетки-хозяина в культуральную среду можно подходящим образом добавлять соединения, такие как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота, для регулирования рН культуральной среды. В дополнение, в ходе культивирования клетки-хозяина можно применять противовспениватель, такой как сложный эфир полигликоля и жирной кислоты, для предотвращения образования пены. Для поддержания аэробных условий в культуральной среде в культуральную среду можно вводить кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух). В данном случае температура культуральной среды может находиться в диапазоне от приблизительно 20°C до приблизительно 45°C, например, от приблизительно 25°С до приблизительно 40°С. В дополнение, культивирование клетки-хозяина можно продолжать до тех пор, пока не будет получено желаемое количество целевого продукта, и в этом отношении культивирование клетки-хозяина может продолжаться от приблизительно 10 часов до приблизительно 160 часов.

[00028] Извлечение целевого продукта из клетки-хозяина или культуральной среды, содержащей культивируемую клетку-хозяина, можно осуществлять (т.е. отделять или извлекать) посредством соответствующей реакции, известной из уровня техники. Например, соответствующую реакцию можно проводить согласно обработке с помощью осаждения белков (т.е. способа высаливания), центрифугирования, экстрагирования, ультразвуковой обработки, ультрафильтрации, диализа, различных методик хроматографии, таких как хроматография на молекулярных ситах (т.е. гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография, и их комбинации, но без ограничения ими. В этом отношении продуцируемый целевой продукт можно собирать, извлекать или отделять от клетки-хозяина или среды, содержащей культивируемую клетку-хозяина.

Принцип изобретения

[00029] Далее в данном документе идея настоящего изобретения будет описана более подробно со ссылками на следующие примеры. Однако, эти примеры служат только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения объема идеи настоящего изобретения.

[00030]

[00031] Пример 1. Получение рекомбинантного вектора, содержащего новый промотор, и трансформированного штамма с его помощью

[00032] (1) Получение рекомбинантного вектора, содержащего Ро2, и трансформированного штамма с его помощью

[00033] Применительно к синтезу промотора, индуцирующего экспрессию целевого гена, анализировали последовательности различных промоторов, полученных из микроорганизма, относящегося к роду Corynebacterium, и микроорганизма, относящегося к роду Escherichia, синтезируя благодаря этому промотор, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. Синтезированный промотор именовали промотором о2 (далее в данном документе называемым "Ро2"). Для измерения активности Ро2 в отношении индуцирования экспрессии целевого гена Ро2 функционально связывали с открытой рамкой считывания (ORF) гена GFP таким образом, что получали рекомбинантный вектор. Затем каждый из штаммов Corynebacterium и Е. coli трансформировали рекомбинантным вектором, получая таким образом каждый из трансформированных штаммов Corynebacterium и Е. coli.

[00034] В дополнение, для получения штамма, обладающего повышенной способностью к продуцированию L-аминокислот, например, L-аргинина, или аминокислот с разветвленной цепью, таких как L-валин, в качестве примера целевого продукта, применяли Ро2 для повышения экспрессии гена, отвечающего за биосинтез аргинина или валина.

[00035]

[00036] (1.1) Получение вектора pECCG117-Po2-gfp и трансформированного штамма с его помощью

[00037] (1.1.1) Получение вектора

[00038] ПЦР осуществляли посредством применения синтезированного Ро2 в качестве матрицы и набора праймеров с SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, содержащих сайты рестрикции для Kpnl/EcoRV. ПЦР осуществляли согласно циклам денатурации при температуре 94°C в течение 5 минут, денатурации при температуре 94°C в течение 30 секунд, отжига при температуре 60°C в течение 30 секунд и полимеризации при температуре 72°С в течение 30 секунд, при этом циклы осуществляли 30 раз. После этого вновь осуществляли полимеризацию со штаммами при температуре 72°С в течение 7 минут, получая таким образом в результате этого Ро2, имеющий длину приблизительно 100 п.о.

[00039] ПЦР осуществляли посредством применения вектора pGFPuv (производимого Clontech, США) в качестве матрицы и набора праймеров с SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, содержащих сайты рестрикции для Pstl/EcoRV. ПЦР осуществляли согласно циклам денатурации при температуре 94°C в течение 5 минут, денатурации при температуре 94°C в течение 30 секунд, отжига при температуре 55°C в течение 30 секунд и полимеризации при температуре 72°C в течение 1 минуты, при этом циклы осуществляли 30 раз. После этого вновь осуществляли полимеризацию при температуре 72°C в течение 7 минут, получая таким образом в результате этого SEQ ID NO: 6, содержащую ORF гена GFP.

[00040] Ро2 обрабатывали ферментами рестрикции Pstl и EcoRV, а ORF гена GFP обрабатывали ферментами рестрикции Kpnl и EcoRV в сайтах для Pstl и Kpnl челночного вектора pECCG117 (см. Biotechnology letters vol 13, No. 10, p. 721-726 (1991)), который может экспрессироваться у Е. coli и Corynebacterium. Затем обработанные Ро2 и ORF гена GFP функционально связывали друг с другом посредством применения фермента для конъюгирования ДНК, получая таким образом рекомбинантный вектор, в котором Ро2 и ген GFP были связаны друг с другом. В данном случае рекомбинантному вектору давали название pECCG117-Po2-gfp.

[00041]

[00042] (1.1.2) Получение трансформированного штамма с помощью вектора

[00043] Corynebacterium glutamicum АТСС13032 трансформировали каждым из вектора pECCG117 и рекомбинантного вектора pECCG117-Po2-gfp с помощью способа с использованием электрических импульсов, и затем трансформированные штаммы получали из селективной среды, содержащей 25 мг/л канамицина. Каждому из полученных штаммов, трансформированных вектором pECCG117 и рекомбинантным вектором pECCG117-Po2-gfp, давали название ATCC13032/pECCG117 или ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp.

[00044] В дополнение, DH5α Е. coli трансформировали рекомбинантным вектором pECCG117-Po2-gfp с помощью способа с использованием теплового шока, и затем трансформированные штаммы получали из агаровой среды Лурия-Бертани (LB), содержащей 25 мг/л канамицина. Полученным штаммам давали название DH5α/pECCG117-Po2-gfp и присваивали обозначение депонирования "СА01-2290". СА01-2290 депонировали в Корейском центре культур микроорганизмов (KCCM) 23 октября 2014 г. под номером доступа KCCM11591P в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

[00045]

[00046] (1.2) Получение вектора pECCG117-Po2-argJ и трансформированного штамма с его помощью

[00047] (1.2.1) Получение вектора

[00048] Применительно к синтезу вектора, в котором основной ген, отвечающий за биосинтез, например, ген argJ (Ncgl1341, SEQ ID NO: 7), кодирующий бифункциональную орнитинацетилтрансферазу/N-ацетилглутаматсинтазу, для повышенного продуцирования аргинина, экспрессируется под управлением Ро2, применяли рекомбинантный вектор pECCG117-Po2-gfp для получения вектора pECCG117-Po2-argJ.

[00049] Более подробно, ПЦР осуществляли со штаммом посредством применения хромосом Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы и набора праймеров с SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, обеспечивая таким образом получение фрагментов ДНК, содержащих гены argJ. ПЦР осуществляли согласно циклам денатурации при температуре 94°C в течение 1 минуты, отжига при температуре 58°C в течение 30 секунд и полимеризации при температуре 72°C в течение 2 минут посредством применения полимеразы Pfu, при этом циклы осуществляли 30 раз. В результате этого амплифицировали фрагмент, имеющий длину приблизительно 1201 п.о. и содержащий сайты для ферментов рестрикции EcoRV и 3'-Pstl на 5'-конце. Амплифицированные фрагменты, полученные с помощью ПЦР, очищали, смешивали с вектором pECCG117-Po2-gfp, который обрабатывали ферментами рестрикции EcoRV и Pstl, и затем соединяли друг с другом с помощью набора для клонирования In-Fusion, получая таким образом рекомбинантный вектор, которому давали название pECCG117-Po2-argJ.

[00050]

[00051] (1.2.2) Получение трансформированного штамма с помощью вектора

[00052] Corynebacterium glutamicum KCCM10741P, который представляет собой штамм, продуцирующий аргинин, трансформировали рекомбинантным вектором pECCG117-Po2-argJ с помощью способа с использованием электрических импульсов (см. KR 10-0791659), и затем трансформированные штаммы получали из селективной среды, содержащей 25 мг/л канамицина. Полученному штамму давали название KCCM10741P/pECCG117-Po2-argJ.

[00053]

[00054] (1.3) Получение вектора pECCG117-Po2-ilvE и трансформированного штамма с его помощью

[00055] (1.3.1) Получение вектора

[00056] Применительно к синтезу вектора, в котором основной ген, отвечающий за биосинтез, например, ген ilvE (Ncgl2123, SEQ ID NO: 10), кодирующий аминотрансферазу аминокислот с разветвленной цепью, для повышенного продуцирования валина, экспрессируется под управлением Ро2, применяли рекомбинантный вектор pECCG117-Po2-gfp для получения вектора pECCG117-Po2-ilvE.

[00057] Более подробно, ПЦР осуществляли со штаммом посредством применения хромосом Corynebacterium glutamicum АТСС14067 в качестве матрицы и набора праймеров с SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, обеспечивая таким образом получение фрагментов ДНК, содержащих гены ilvE. ПЦР осуществляли согласно циклам денатурации при температуре 94°C в течение 1 минуты, отжига при температуре 58°C в течение 30 секунд и полимеризации при температуре 72°C в течение 2 минут посредством применения полимеразы Pfu, при этом циклы осуществляли 30 раз. В результате этого амплифицировали фрагмент, имеющий длину приблизительно 1201 п.о. и содержащий сайты для ферментов рестрикции EcoRV и 3'-Pstl на 5'-конце. Амплифицированные фрагменты, полученные с помощью ПЦР, очищали, смешивали с вектором pECCG117-Po2-gfp, который обрабатывали ферментами рестрикции EcoRV и Pstl, и затем соединяли друг с другом с помощью набора для клонирования In-Fusion, получая таким образом рекомбинантный вектор, которому давали название pECCG117-Po2-ilvE.

[00058]

[00059] (1.3.2) Получение трансформированного штамма с помощью вектора

[00060] Corynebacterium glutamicum KCCM111201P, который представляет собой штамм, продуцирующий валин, трансформировали рекомбинантным вектором pECCG117-Po2-ilvE с помощью способа с использованием электрических импульсов (см. KR 10-1117022), и затем трансформированные штаммы получали из селективной среды, содержащей 25 мг/л канамицина. Полученным штаммам давали название KCCM11201P/pECCG117-Po2-ilvE.

[00061]

[00062] Сравнительный пример 1. Получение рекомбинантного вектора, содержащего контрольный промотор, и трансформированного штамма с помощью вектора

[00063] Для измерения активности Ро2 в отношении индуцирования экспрессии целевого гена ген GFP применяли для образования функциональной связи между известным сильным промотором (например, Ptrc, Pcj1, Pcj4 или Pcj7 (см. KR 10-0620092)) или промотором дикого типа (например, асеЕР (WT)) и ORF гена GFP с получением рекомбинантного вектора. Затем каждый из штаммов Corynebacterium и Е. coli трансформировали рекомбинантным вектором, получая таким образом каждый из трансформированных штаммов Corynebacterium и Е. coli.

[00064] В дополнение, для оценивания трансформированных штаммов, содержащих основной ген, отвечающий за биосинтез, в которых применяется Ро2 для повышенного продуцирования продукта целевого гена, получали каждый из трансформированного штамма, содержащего основной ген, отвечающий за биосинтез, для повышенного продуцирования аргинина или трансформированного штамма, содержащего основной ген, отвечающий за биосинтез, для повышенного продуцирования валина.

[00065]

[00066] (1) Получение вектора экспрессии gfp, имеющего промотор, отличающийся от Ро2 на основании сравнения активности с Ро2, и трансформированного штамма Corynebacterium glutamicum

[00067] Обеспечивали получение последовательностей оснований aceEP(WT) от Национального института здравоохранения США (NIH, Genbank), и с ними осуществляли ПЦР посредством применения хромосом Corynebacterium glutamicum АТСС13032 дикого типа в качестве матрицы и набора праймеров с SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, содержащих сайты рестрикции для Kpnl/EcoRV. ПЦР осуществляли так же, как в (1.1) примера 1, получая таким образом рекомбинантный вектор под названием pECCG117-aceEP(WT)-gfp.

[00068] Штаммы Corynebacterium glutamicum трансформировали каждым из полученного вектора pECCG117-aceEP(WT)-gfp и векторов pECCG117-Pcj1-gfp, pECCG117-Pcj4-gfp и pECCG117-Pcj7-gfp (см. KR 10-0620092) так же, как в (1.1) примера 1, получая таким образом трансформированные штаммы, каждому из которых давали название ATCC13032/pECCG117-aceEP(WT)-gfp, ATCC13032/pECCG117-Pcj1-gfp, ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp или ATCC13032/pECCG117-Pcj7-gfp.

[00069]

[00070] (2) Получение вектора экспрессии gfp, имеющего промотор, отличающийся от Ро2 на основании сравнения активности с Ро2, и трансформированного штамма Е. coli

[00071] Обеспечивали получение последовательностей оснований Ptrc от Национального института здравоохранения США (NIH, Genbank), и с ними осуществляли ПЦР посредством применения pTrc99A (NCBI, GenBank, М22744) в качестве матрицы и набора праймеров с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, содержащих сайты рестрикции для Kpn/EcoR. ПЦР осуществляли так же, как в (1.1) примера 1, получая таким образом рекомбинантный вектор под названием pECCG117-Ptrc-gfp.

[00072] Штаммы Е. coli трансформировали каждым из полученного вектора pECCG117-Ptrc-gfp и векторов pECCG117-Pcj1-gfp и pECCG117-Pcj4-gfp так же, как в (1.1) примера 1, получая таким образом трансформированные штаммы, каждому из которых давали название DH5α/pECCG117-Ptrc-gfp, DH5α/pECCG117-Pcj1-gfp или DH5α/pECCG117-Pcj4-gfp.

[00073]

[00074] (3) Получение трансформированного штамма, имеющего промотор, отличающийся от Ро2 на основании сравнения способности к продуцированию целевого продукта с Ро2

[00075] (3.1) Получение трансформированного штамма Corynebacterium glutamicum, при этом трансформированный штамм обладает способностью к продуцированию аргинина

[00076] Вектор pECCG117-Pcj7-gfp применяли для получения вектора под названием pECCG117-Pcj7-argJ так же, как в (1.2.1) примера 1, за исключением того, что ПЦР осуществляли посредством применения набора праймеров с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 17.

[00077] Затем получали трансформированный штамм посредством применения вектора pECCG117-Pcj7-argJ так же, как в (1.2.2) примера 1, и ему давали название KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-argJ.

[00078]

[00079] (3.2) Получение трансформированного штамма Corynebacterium glutamicum, при этом трансформированный штамм обладает способностью к продуцированию валина

[00080] Вектор pECCG117-Pcj7-gfp применяли для получения вектора под названием pECCG117-Pcj7-ilvE так же, как в (1.3.1) примера 1, за исключением того, что ПЦР осуществляли посредством применения набора праймеров с SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 18.

[00081] Затем получали трансформированный штамм посредством применения вектора pECCG117-Pcj7-ilvE также, как в (1.3.2) примера 1, и ему давали название KCCM11201P/pECCG117-Pcj7-ilvE.

[00082]

[00083] Пример 2. Подтверждение активности Ро2 в отношении индуцирования экспрессии целевого гена

[00084] (1) Подтверждение активности Ро2 в отношении индуцирования экспрессии целевого гена у Corynebacterium glutamicum

[00085] Для измерения активности Ро2 в отношении индуцирования экспрессии целевого гена у трансформированных штаммов Corynebacterium glutamicum измеренную активность зеленого флуоресцентного белка (GFP) у трансформированного штамма под названием ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp из (1.1.2) примера 1 сравнивали с измеренной активностью GFP у трансформированных штаммов, каждый из которых имел название ATCC13032/pECCG117 из (1.1.2) примера 1 или ATCC13032/pECCG117-aceEP(WT)-gfp, ATCC13032/pECCG117-Pcj1-gfp, ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp или ATCC13032/pECCG117-Pcj7-gfp из (1) сравнительного примера 1.

[00086] Каждый из вышеуказанных трансформированных штаммов Corynebacterium glutamicum инокулировали в угольчатую бутылку на 250 мл, содержащую 25 мл среды для посева, в объемном соотношении 1:20 и затем культивировали со встряхиванием (при скорости приблизительно 200 об./мин.) при температуре 30°C, пока штаммы выращивали в культуре в фазе метафазы (OD600=10,0). После завершения культивирования клетки собирали путем центрифугирования (при скорости приблизительно 5000 об./мин. в течение приблизительно 15 минут). Собранные клетки дважды промывали 0,1% буферным раствором Tris-HCl (рН 8,0) и затем суспендировали в том же буферном растворе до мутности при 610 нм, составляющей приблизительно 160. Клетки разрушали в течение 6 минут посредством применения колотушки для дробления гранул после добавления стеклянных гранул при 1,25 г / 1,5 мл суспензии. Надосадочную жидкость, содержащую клеточный экстракт, собирали путем центрифугирования (при скорости приблизительно 15000 об./мин. в течение приблизительно 20 минут), а затем подвергали количественному измерению в отношении концентрации белка в ней в соответствии со способом Бредфорда (см. Bradford, М.М 1976. Anal. Biochem. 72: 248-254). Затем такое же количество клеточного экстракта облучали светом при длине волны возбуждения 488 нм с помощью способа по Laure Gory или подобного, и свет при длине волны испускания 511 нм измеряли посредством применения спектрофотометра LS-50B (Perkin-Elmer), определяя таким образом экспрессию гена GFP. Результаты измерения активности GFP у каждого из штаммов показаны в таблице 1.

[00087] [Среда для посева]

[00088] 20 г глюкозы, 5 г сульфата аммония, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH2PO4, 8 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4⋅7H2O, 150 мкг биотина, 1,5 мг гидрохлорида тиамина, 3 мг кальциевой соли пантотеновой кислоты, 3 мг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды) и рН 7,2.

[00089] [Таблица 1]

Интенсивность флуоресценции у Corynebacterium glutamicum

[00090]

[00091] Как показывают результаты в таблице 1, было подтверждено, что Ро2 обладал промоторной активностью у Corynebacterium glutamicum, и что штамм под названием ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp демонстрировал интенсивность флуоресценции, по меньшей мере в 13 раз превышающую таковую для штамма ATCC13032/pECCG117-aceEP(WT)-gfp дикого типа. В дополнение, было подтверждено, что штамм под названием ATCC13032/pECCG117-Po2-gfp демонстрировал интенсивность флуоресценции на намного более высоком уровне, чем каждый из штаммов под названиями ATCC13032/pECCG117-Pcj1-gfp, ATCC13032/pECCG117-Pcj4-gfp и ATCC13032/pECCG117-Pcj7-gfp, в которых применяются известные сильные промоторы (например, Pcj1, Pcj4 и Pcj7). Следовательно, было подтверждено, что Ро2 служил в качестве сильного промотора для экспрессии целевого гена.

[00092]

[00093] (2) Подтверждение активности Ро2 в отношении индуцирования экспрессии целевого гена у Е. coli

[00094] Для измерения активности Ро2 в отношении индуцирования экспрессии целевого гена у трансформированных штаммов Е. coli измеренную активность GFP у трансформированного штамма под названием DH5α/pECCG117-Po2-gfp из (1.1.2) примера 1 сравнивали с измеренной активностью GFP у трансформированных штаммов, каждый из которых имел название DH5α/pECCG117-Ptrc-gfp, DH5α/pECCG117-Pcj1-gfp или DH5α/pECCG117-Pcj4-gfp из (2) сравнительного примера 2.

[00095] Каждый из вышеуказанных трансформированных штаммов Е. coli инокулировали в угольчатую бутылку на 250 мл, содержащую 25 мл среды LB, содержащей канамицин, в объемном соотношении 1:20 и затем культивировали со встряхиванием (при скорости приблизительно 200 об./мин.) при определенной температуре, пока штаммы выращивали в культуре в фазе метафазы (OD600=3,0). После завершения культивирования клетки собирали путем центрифугирования (при скорости приблизительно 5000 об./мин. в течение приблизительно 15 минут), дважды промывали 0,1% буферным раствором Tris-HCl (рН 8,0), суспендировали в том же буферном растворе, разрушали путем ультразвуковой обработки, а затем подвергали центрифугированию (при скорости приблизительно 15000 об./мин. в течение приблизительно 20 минут) с получением надосадочной жидкости, содержащей клеточный экстракт. Надосадочную жидкость подвергали количественному измерению в отношении концентрации белка в ней в соответствии со способом Бредфорда. Затем такое же количество клеточного экстракта облучали светом при длине волны возбуждения 488 нм с помощью способа по Laure Gory или подобного, и свет при длине волны испускания 511 нм измеряли посредством применения спектрофотометра LS-50B (Perkin-Elmer), определяя таким образом экспрессию гена GFP. Результаты измерения активности GFP у каждого из штаммов показаны в таблице 2.

[00096] [Таблица 2]

Интенсивность флуоресценции y Е. coli

[00097]

[00098] Как показывают результаты в таблице 2, было подтверждено, что Ро2 обладал промоторной активностью у Е. coli, и что штамм под названием DH5α/pECCG117-Po2-gfp демонстрировал интенсивность флуоресценции на уровне, сходном с таковым у штамма под названием DH5α/pECCG117-Ptrc-gfp, который, как известно, содержит сильный промотор, и более высоком, чем у штамма DH5α/pECCG117-Pcj4-gfp. Следовательно, было подтверждено, что Ро2 служил в качестве сильного промотора для экспрессии целевого гена у Е. coli.

[00099]

[000100] Пример 3. Оценивание штаммов в отношении повышенной способности к продуцированию целевого продукта

[000101] (1) Оценивание штаммов в отношении повышенного продуцирования аргинина

[000102] Применительно к оцениванию факторов, влияющих на продуцирование аргинина, в случае, когда основной ген, отвечающий за биосинтез аргинина, т.е. ген argJ, экспрессировался посредством применения Ро2, штамм под названием KCCM10741P/pECCG117-Po2-argJ из (1.2.2) примера 1, который применяли в качестве штамма для повышенного продуцирования гена argJ, сравнивали с нетрансформированным штаммом под названием KCCM10741P (не обладающим трансформированной способностью к продуцированию аргинина) и штаммом под названием KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-argJ из (3.1) сравнительного примера 1 в отношении способности к продуцированию аргинина.

[000103] 1 петлю каждого из вышеуказанных трансформированных штаммов инокулировали в угольчатую бутылку на 250 мл, содержащую 25 мл среды для продуцирования, и затем культивировали со встряхиванием при скорости приблизительно 200 об./мин. при температуре 30°С в течение 48 часов. После завершения культивирования измеряли продуцирование L-аргинина с помощью HPLC. Результаты измерения продуцирования L-аргинина показаны в таблице 3.

[000104] [Среда для продуцирования]

[000105] Глюкоза 6%, сульфат аммония 3%, монофосфат калия 0,1%, гептагидрат сульфата магния 0,2%, кукурузный экстракт (CSL) 1,5%, NaCl 1%, дрожжевой экстракт 0,5%, биотин 100 мкг/л и рН 7,2.

[000106]

[000107] [Таблица 3]

Продуцирование аргинина у KCCM10741P

[000108]

[000109] Как показывают результаты в таблице 3, было подтверждено, что Ро2 обуславливал улучшение продуцирования аргинина у Corynebacterium glutamicum, у которого была повышена экспрессия гена argJ. В частности, продуцирование аргинина у Corynebacterium glutamicum увеличивалось на приблизительно 84% по сравнению с контрольным штаммом и увеличивалось на приблизительно 23% по сравнению со штаммом под названием KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-argJ. Следовательно, было подтверждено, что Ро2 влиял на повышение экспрессии гена argJ.

[000110] (2) Оценивание штаммов в отношении повышенного продуцирования L-валина

[000111] Применительно к оцениванию факторов, влияющих на продуцирование валина, в случае, когда основной ген, отвечающий за биосинтез валина, т.е. ген ilvE, экспрессировался посредством применения Ро2, штамм под названием KCCM11201P/pECCG117-Po2-ilvE из (1.3.2) примера 1, который применяли в качестве штамма для повышенного продуцирования гена ilvE, сравнивали с нетрансформированным штаммом под названием KCCM11201P (не обладающим трансформированной способностью к продуцированию L-валина) и штаммом под названием KCCM11201P/pECCG117-Pcj7-ilvE из (3.2) сравнительного примера 1 в отношении способности к продуцированию L-валина.

[000112] 1 петлю каждого из вышеуказанных трансформированных штаммов инокулировали в угольчатую бутылку на 250 мл, содержащую 25 мл среды для продуцирования, и затем культивировали со встряхиванием при скорости приблизительно 200 об./мин. при температуре 30°С в течение 72 часов. После завершения культивирования измеряли продуцирование L-валина с помощью HPLC. Результаты измерения продуцирования L-валина показаны в таблице 4.

[000113] [Среда для продуцирования]

[000114] Глюкоза 5%, сульфат аммония 2%, монофосфат калия 0,1%, гептагидрат сульфата магния 0,05%, CSL 2,0%, биотин 200 мкг/л и рН 7,2.

[000115]

[000116] [Таблица 4]

Продуцирование валина у KCCM11201P

[000117]

[000118] Как показывают результаты в таблице 4, было подтверждено, что Ро2 обуславливал улучшение продуцирования валина у Corynebacterium glutamicum, у которого была повышена экспрессия гена ilvE. В частности, продуцирование валина у штамма под названием KCCM11201P/pECCG117-Po2-ilvE значительно увеличивалось на приблизительно 32% по сравнению с контрольным штаммом и увеличивалось на приблизительно 17% по сравнению со штаммом под названием KCCM10741P/pECCG117-Pcj7-ilvE. Следовательно, было подтверждено, что Ро2 влиял на повышение экспрессии гена ilvE.

[000119]

[000120] [Номер доступа]

[000121] Принимающая организация: Корейский центр культур микроорганизмов (международный)

[000122] Номер доступа: KCCM11591P

[000123] Дата приема: 23 октября 2014 г.

[000124]

[000125] В соответствии с одним или несколькими иллюстративными вариантами осуществления, приведенными выше, новый промотор может обладать различными видами активности в зависимости от микроорганизма, применяемого для индуцирования экспрессии целевого гена. В этом отношении новый промотор можно применять в случае, когда необходимо контролировать активность целевого гена в ходе продуцирования целевого продукта, что в результате приводит к эффективному продуцированию целевого продукта.

[000126] Следует понимать, что иллюстративные варианты осуществления, описанные в данном документе, следует рассматривать только в описательном смысле, а не для целей ограничения. Описание признаков или аспектов в рамках каждого иллюстративного варианта осуществления обычно следует рассматривать в качестве подходящего для других аналогичных признаков или аспектов в других иллюстративных вариантах осуществления.

[000127] При том, что были описаны один или несколько иллюстративных вариантов осуществления, средним специалистам в данной области будет понятно, что в них можно осуществить различные изменения формы и деталей без отступления от сущности и объема идеи настоящего изобретения, определенных в следующей формуле изобретения.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Описан промотор, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1. Описана нуклеиновая кислота, регулирующая экспрессию, содержащая указанный промотор. Представлен вектор экспрессии, содержащий последовательность, регулирующую экспрессию, и целевой ген, функционально связанный с последовательностью, регулирующей экспрессию. Также представлен челночный вектор экспрессии, содержащий последовательность, регулирующую экспрессию, и целевой ген, функционально связанный с последовательностью, регулирующей экспрессию. Описана прокариотическая клетка-хозяин для продуцирования целевого продукта, содержащая указанный вектор. При этом клетка-хозяин может представлять собой клетку бактерии, относящейся к родуили роду. Представлен способ продуцирования целевого продукта, при этом способ включает: культивирование клетки-хозяина и извлечение целевого продукта из клетки-хозяина или культуральной среды, содержащей культивируемую клетку-хозяина. Изобретение расширяет арсенал технических средств. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 пр.

Формула