Способы и композиции для направляемого рнк лечения вич-инфекции - RU2018130640A

1. Способ инактивации провирусной ДНК, интегрированной в геном клетки-хозяина, латентно инфицированной ретровирусом, включающий этапы:

обработки клетки-хозяина композицией, содержащей эндонуклеазу, ассоциированную с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR) варианта Cas9 усиленной специфичности, и две или более различных направляющих РНК (РНК гид - гРНК), причем каждая из по меньшей мере двух гРНК является комплементарной отличающейся целевой последовательности нуклеиновой кислоты в длинном концевом повторе (LTR) провирусной ДНК; и

инактивации провирусной ДНК.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный этап обработки клетки-хозяина включает этапы:

воздействия на клетку-хозяина композиции, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR; выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первую гРНК, имеющую первую спейсерную последовательность, которая является комплементарной первой целевой протоспейсерной последовательности в провирусной ДНК; и выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую гРНК, имеющую вторую спейсерную последовательность, которая является комплементарной второй целевой протоспейсерной последовательности в провирусной ДНК;

экспрессии в клетке-хозяине указанной эндонуклеазы, ассоциированной с CRISPR, указанной первой гРНК и указанной второй гРНК;

сборки в клетке-хозяине, первого комплекса для редактирования генома, содержащего указанную эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR и первую гРНК; и второго комплекса для редактирования генома, содержащего указанную эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR и вторую гРНК;

направления первого комплекса для редактирования генома к первой целевой протоспейсерной последовательности путем комплементарного спаривания оснований между первой спейсерной последовательностью и первой целевой протоспейсерной последовательностью;

направления второго комплекса для редактирования генома ко второй целевой протоспейсерной последовательности путем комплементарного спаривания оснований между второй спейсерной последовательностью и второй целевой протоспейсерной последовательностью;

расщепления провирусной ДНК в первой целевой протоспейсерной последовательности указанной эндонуклеазой, ассоциированной с CRISPR;

расщепления провирусной ДНК во второй целевой протоспейсерной последовательности указанной эндонуклеазой, ассоциированной с CRISPR; и

индуцирования по меньшей мере одной мутации в провирусной ДНК.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из первой целевой протоспейсерной последовательности и второй целевой протоспейсерной последовательности расположена в области U3 LTR.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что ретровирус выбирают из группы, состоящей из ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что ретровирус представляет собой ВИЧ-1, и первая спейсерная последовательность и вторая спейсерная последовательность содержат последовательность, комплементарную целевой протоспейсерной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 110.

6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что ретровирус представляет собой ВИЧ-1, и первая спейсерная последовательность и вторая спейсерная последовательность содержат, соответственно, последовательность, комплементарную целевым протоспейсерным последовательностям SEQ ID NO: 96 и SEQ ID NO: 121.

7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что ретровирус представляет собой ВИЧ-1, и первая спейсерная последовательность и вторая спейсерная последовательность содержат, соответственно, последовательность, комплементарную целевым протоспейсерным последовательностям SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 110.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что CRISPR-ассоциированную эндонуклеазу выбирают из оптимизированной для человека Cas9; мутантной никазы Cas9, SpCas9(K855A); SpCas9(K810A/K1003A/R1060A); SpCas9(K848A/K1003A/R1060A); SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A L169A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A Y450A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A M495A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A M694A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A H698A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, L169A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, Y450A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, M495A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, M694A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, M698A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A, D1135E; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A, L169A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A Y450A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A M495A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A M694A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A H698A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A D1135E L169A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A D1135E Y450A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A D1135E M495A; или SpCas9 R661A, Q695A, Q926A, D1135E, M694A.

9. Способ по п. 2, отличающийся тем, что выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие указанную эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR, первую гРНК и вторую гРНК, кодируются по меньшей мере одним вектором экспрессии.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что по меньшей мере один вектор экспрессии выбирают из группы, состоящей из плазмидного вектора, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора и вектора на основе аденоассоциированного вируса.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из гРНК содержит CRISPR РНК (crРНК) и трансактивирующую малую РНК (tracrРНК), которые экспрессируются в виде отдельных нуклеиновых кислот.

12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из гРНК сконструирована в виде искусственной гибридной малой направляющей РНК (sgРНК), состоящей из crРНК и tracrРНК.

13. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанный этап индуцирования по меньшей мере одной мутации в провирусной РНК также определяют как индуцирующий по меньшей мере одну инсерцию, по меньшей мере одну делецию, по меньшей мере одну точечную мутацию или их комбинацию.

14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный этап индуцирования по меньшей мере одной мутации в провирусной РНК также определяется как индуцирование вырезания последовательности провирусной ДНК, которая простирается между первой целевой протоспейсерной последовательностью и второй целевой протоспейсерной последовательностью.

15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный этап экспрессии в клетке-хозяине указанной эндонуклеазы, ассоциированной с CRISPR, первой гРНК и второй гРНК также определяют как стабильно экспрессирующиеся в клетке-хозяине укаазнная эндонуклеаза, ассоциированная с CRISPR, первая гРНК, и вторая гРНК, причем способ дополнительно включает стадию иммунизации клетки-хозяина против новой ретровирусной инфекции.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетка-хозяин, латентно инфицированная ретровирусом, представляет собой CD4+ Т-клетку, макрофаг, моноцит, кишечник-ассоциированную лимфоидную клетку, микроглиальную клетку или астроцит.

17. Композиция для инактивации провирусной ДНК, интегрированной в геном клетки-хозяина, латентно инфицированной ретровирусом, содержащая:

выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую эндонуклеазу, ассоциированную с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR) вариант Cas9 усиленной специфичности;

выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первую направляющую РНК (гРНК), имеющую первую спейсерную последовательность, которая является комплементарной первой целевой протоспейсерной последовательности в провирусной ДНК; и

выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вторую гРНК, имеющую вторую спейсерную последовательность, которая является комплементарной второй целевой протоспейсерной последовательности в провирусной ДНК, причем указанная первая целевая протоспейсерная последовательность и указанная вторая целевая протоспейсерная последовательность расположены в длинном концевом повторе (LTR) провирусной ДНК.

18. Композиция по п. 17, отличающаяся тем, что указанная первая спейсерная последовательность и указанная вторая спейсерная последовательность содержат последовательность, комплементарную целевой протоспейсерной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 110.

19. Композиция по п. 17, отличающаяся тем, что указанная первая спейсерная последовательность и указанная вторая спейсерная последовательность содержат, соответственно, последовательность, комплементарную целевым протоспейсерным последовательностям SEQ ID NO: 96 и SEQ ID NO: 121.

20. Композиция по п. 17, отличающаяся тем, что указанная первая спейсерная последовательность и указанная вторая спейсерная последовательность содержат, соответственно, последовательность, комплементарную целевым протоспейсерным последовательностям SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 110.

21. Композиция по п. 17, отличающаяся тем, что указанную эндонуклеазу, ассоциированную с CRISPR выбирают из оптимизированной для человека Cas9; мутантной никазы Cas9, SpCas9(K855A); SpCas9(K810A/K1003A/R1060A); SpCas9(K848A/K1003A/R1060A); SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A L169A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A Y450A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A M495A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A M694A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A H698A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, L169A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, Y450A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, M495A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, M694A; SpCas9 N497A, R661A, Q695A, Q926A, D1135E, M698A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A, D1135E; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A, L169A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A Y450A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A M495A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A M694A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A H698A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A D1135E L169A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A D1135E Y450A; SpCas9 R661A, Q695A, Q926A D1135E M495A; и SpCas9 R661A, Q695A, Q926A, D1135E, M694A.