Контроль жесткокрылых вредителей с применением молекул рнк - RU2019105354A

1. Молекула интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК), где РНК содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити, причем одна из этих нитей содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена Diabrotica spp. и (i) на по меньшей мере 85% идентична фрагменту из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (ii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; (iii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательностью, или (iv) может гибридизироваться при жестких условиях с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 и их комплементарных последовательностей, где молекула интерферирующей РНК характеризуется инсектицидной активностью в отношении жесткокрылого вредителя растений.

2. Молекула интерферирующей РНК по п. 1, где указанный жесткокрылый вредитель растений представляет собой насекомое рода Diabrotica.

3. Молекула интерферирующей РНК по п. 1, где РНК содержит по меньшей мере две dsRNA, где каждая dsRNA содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена.

4. Молекула интерферирующей РНК по п. 3, где каждая из dsRNA содержит отдельную последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна отдельной целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена.

5. Молекула интерферирующей РНК по п. 1, где молекула интерферирующей РНК содержит SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарную последовательность.

6. Молекула интерферирующей РНК по п. 1, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей в значительной степени комплементарные гибридизированные нити.

7. Молекула интерферирующей РНК по п. 1, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей полностью комплементарные гибридизированные нити.

8. Молекула интерферирующей РНК по любому из пп. 1-7, где насекомое рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из D. barberi, D. virgifera, D. undecimpunctata, D. balteata, D. undecimpunctata, D. significata и D. speciosa.

9. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая молекулу интерферирующей РНК по любому из пп. 1-8.

10. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая молекулу интерферирующей РНК по любому из пп. 1-8.

11. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует молекулу нуклеиновой кислоты по п. 10.

12. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп. 9 или 11, где конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой вектор экспрессии.

13. Рекомбинантный вектор, содержащий регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует молекулу интерферирующей РНК по любому из пп. 1-8.

14. Композиция, содержащая две или более молекул интерферирующей РНК по любому из пп. 1-8.

15. Композиция по п. 14, где две или более молекул интерферирующей РНК присутствуют в одной и той же конструкции нуклеиновой кислоты, в отдельных конструкциях нуклеиновой кислоты или в любой их комбинации.

16. Композиция по любому из пп. 14 или 15, содержащая молекулу интерферирующей РНК, которая содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити, причем одна из нитей содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая (i) на по меньшей мере 85% идентична фрагменту из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; или (ii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности.

17. Композиция, содержащая две или более конструкций нуклеиновой кислоты по любому из пп. 9, 11 или 12, где каждая из двух или более конструкций нуклеиновой кислоты содержит отдельную интерферирующую РНК.

18. Композиция, содержащая две или более молекул нуклеиновой кислоты по п. 10, где каждая из двух или более молекул нуклеиновой кислоты кодирует отдельную молекулу интерферирующей РНК.

19. Инсектицидная композиция для подавления экспрессии целевого гена у насекомого рода Diabrotica, содержащая интерферирующую РНК по любому из пп. 1-8 и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.

20. Инсектицидная композиция по п. 19, содержащая по меньшей мере второе инсектицидное средство для контроля насекомого рода Diabrotica.

21. Инсектицидная композиция по п. 20, где второе инсектицидное средство представляет собой инсектицидный белок Bacillus thuringiensis.

22. Инсектицидная композиция по п. 20, где второе инсектицидное средство не представляет собой инсектицидный белок Bacillus thuringiensis.

23. Инсектицидная композиция по п. 20, где второе инсектицидное средство представляет собой

пататин, протеазу, ингибитор протеазы, уреазу, ингибитор альфа-амилазы, порообразующий белок, лектин, сконструированные антитело или фрагмент антитела или хитиназу.

24. Инсектицидная композиция по п. 22, где второе инсектицидное средство представляет собой инсектицидный белок Bacillus cereus, инсектицидный белок Xenorhabdus spp., инсектицидный белок Photorhabdus spp., инсектицидный белок Brevibacillus laterosporous, инсектицидный белок Lysinibacillus sphearicus, инсектицидный белок Chromebacterium spp., инсектицидный белок Yersinia entomophaga, инсектицидный белок Paenibacillus popiliae или инсектицидный белок Clostridium spp. или получено из них.

25. Трансгенное растение или его часть, содержащие молекулу интерферирующей РНК, молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты и/или композицию по любому из соответствующих предыдущих пунктов, где трансгенное растение характеризуется повышенной устойчивостью к насекомому рода Diabrotica по сравнению с контрольным растением.

26. Трансгенное растение или его часть по п. 25, где трансгенное растение содержит по меньшей мере второе инсектицидное средство для контроля насекомых рода Diabrotica.

27. Трансгенное растение или его часть по п. 26, где второе инсектицидное средство представляет собой инсектицидный белок Bacillus thuringiensis.

28. Трансгенное растение или его часть по п. 26, где второе инсектицидное средство не представляет собой инсектицидный белок Bacillus thuringiensis.

29. Трансгенное растение или его часть по п. 26, где второе инсектицидное средство представляет собой пататин, протеазу, ингибитор протеазы, уреазу, ингибитор альфа-амилазы, порообразующий белок, лектин, сконструированные антитело или фрагмент антитела или хитиназу.

30. Трансгенное растение или его часть по п. 28, где второе инсектицидное средство представляет собой инсектицидный белок Bacillus cereus, инсектицидный белок Xenorhabdus spp., инсектицидный белок Photorhabdus spp., инсектицидный белок Brevibacillus laterosporous, инсектицидный белок Lysini bacillus sphearicus, инсектицидный белок Chromobacterium spp., инсектицидный белок Yersinia entomophaga, инсектицидный белок Paenibacillus popiliae, инсектицидный белок или инсектицидный белок Clostridium spp.или получено из них.

31. Трансгенное растение или его часть по любому из пп. 25-30, где трансгенное растение или его часть представляют собой растение маиса или его часть.

32. Трансгенное семя трансгенного растения по любому из пп. 25-31.

33. Биологический образец из трансгенного растения или его части по любому из пп. 25-31.

34. Товарный продукт, полученный из трансгенного растения или его части по любому из пп. 25-31.

35. Товарный продукт по п. 34, где товарный продукт выбран из группы, состоящей из цельных или переработанных семян, бобов, зерен, косточек, оболочек, разновидностей муки грубого помола, круп, разновидностей муки, сахаров, сахаров, разновидностей крахмала, белковых концентратов, белковых изолятов, восков, масел, экстрактов, соков, концентратов, жидкостей, сиропов, корма, силоса, волокна, бумаги или других пищевых продуктов или продуктов, получаемых из растений.

36. Способ контроля насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, которая представляет собой молекулу интерферирующей РНК по пп. 1-8 или которая способна обеспечить ее образование, для подавления экспрессии целевого гена у насекомого рода Diabrotica, вследствие чего осуществляется контроль насекомого рода Diabrotica.

37. Способ по п. 36, где целевой ген содержит кодирующую последовательность, которая:

a) на по меньшей мере 85% идентична непрерывному фрагменту из по меньшей мере 19 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1-30, SEQ ID NO: 91-120, SEQ ID NO: 271-273, SEQ ID NO: 277-279, SEQ ID NO: 283-297, SEQ ID NO: 313-317, SEQ ID NO: 372, 377, 379, SEQ ID NO: 381-388, SEQ ID NO: 399 или SEQ ID NO: 400;

b) содержит непрерывный фрагмент из по меньшей мере 19 нуклеотидов из SEQ ID NO: 1-30, SEQ ID NO: 91-120, SEQ ID NO: 271-273, SEQ ID NO: 277-279, SEQ ID NO: 283-297, SEQ ID NO: 313-317, SEQ ID NO: 372, 377, 379, SEQ ID NO: 381-388, SEQ ID NO: 399 или SEQ ID NO: 400 или

c) содержит непрерывный фрагмент из по меньшей мере 19 нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 1-30, SEQ ID NO: 91-120, SEQ ID NO: 271-273, SEQ ID NO: 277-279, SEQ ID NO: 283-297, SEQ ID NO: 313-317, SEQ ID NO: 372, 377, 379, SEQ ID NO: 381-388, SEQ ID NO: 399 или SEQ ID NO: 400.

38. Способ по n. 36, где молекула интерферирующей РНК содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити, причем одна из нитей содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая (i) на по меньшей мере 85% идентична фрагменту из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; или (ii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательности; или (iii) содержит фрагмент из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 121-210, SEQ ID NO: 274-276, SEQ ID NO: 280-282, SEQ ID NO: 298-312, SEQ ID NO: 345-371, SEQ ID NO: 373, 374, 378, 380, 389-396, 399, 400 или их комплементарной последовательностью.

39. Способ по любому из пп. 36-38, где насекомое рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из D. barberi, D. virgifera, D. undecimpunctata, D. balteata, D. undecimpunctata, D. significata и D. speciosa.

40. Способ по п. 39, где приведение в контакт предусматривает

a) посев трансгенного семени, из которого можно получить трансгенное растение, экспрессирующее молекулу нуклеиновой кислоты, где насекомое рода Diabrotica питается трансгенным растением или его частью; или

b) применение композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, в отношении семени или растения или их части, где насекомое рода Diabrotica питается семенем, растением или их частью.

41. Способ по п. 39, где трансгенное семя и трансгенное растение представляют собой семя кукурузы и растение кукурузы.

42. Способ по п. 39, где семя или растение представляют собой семя кукурузы или растение кукурузы.

43. Способ контроля насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, которая представляет собой молекулу интерферирующей РНК по пп. 1-8 или которая способна обеспечить ее образование, для подавления экспрессии целевого гена у насекомого рода Diabrotica и приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с по меньшей мере вторым инсектицидным средством для контроля Diabrotica.

44. Способ контроля насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, которая представляет собой молекулу интерферирующей РНК по пп. 1-8 или которая способна обеспечить ее образование, для подавления экспрессии целевого гена у насекомого рода Diabrotica и приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с по меньшей мере вторым инсектицидным средством для контроля Diabrotica, вследствие чего осуществляется контроль насекомого рода Diabrotica, где указанное второе инсектицидное средство предусматривает инсектицидный белок В. thuringiensis.

45. Способ контроля насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, которая представляет собой молекулу интерферирующей РНК по пп. 1-8 или которая способна обеспечить ее образование, для подавления экспрессии целевого гена у насекомого рода Diabrotica и приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с по меньшей мере вторым инсектицидным средством для контроля Diabrotica, вследствие чего осуществляется контроль насекомого рода Diabrotica, где указанное второе инсектицидное средство не предусматривает инсектицидный белок В. thuringiensis.

46. Способ по п. 43, где второе инсектицидное средство предусматривает пататин, протеазу, ингибитор протеазы, уреазу, ингибитор альфа-амилазы, порообразующий белок, лектин, сконструированные антитело или фрагмент антитела или хитиназу.

47. Способ по п. 45, где второе инсектицидное средство предусматривает инсектицидный белок Bacillus cereus, инсектицидный белок Xenorhabdus spp., инсектицидный белок Photorhabdus spp., инсектицидный белок Brevibacillus laterosporous, инсектицидный белок Lysinibacillus sphearicus, инсектицидный белок Chromobacterium spp., инсектицидный белок Yersinia entomophaga, инсектицидный белок Paenibacillus popiliae или инсектицидный белок Clostridium spp.

48. Способ уменьшения популяции взрослых насекомых рода Diabrotica на трансгенном растении, экспрессирующем белок Cry, гибридный белок Cry или модифицированный белок Cry, предусматривающий обеспечение экспрессии в трансгенном растении молекулы нуклеиновой кислоты, которая представляет собой молекулу интерферирующей РНК по п. 1 или которая способна обеспечить ее образование, причем она подавляет экспрессию целевого гена у взрослого насекомого рода Diabrotica, вследствие чего обеспечивается уменьшение популяции взрослых насекомых рода Diabrotica.

49. Способ уменьшения развития устойчивости у популяции насекомых рода Diabrotica в отношении молекулы интерферирующей РНК по п. 1, причем способ предусматривает обеспечение экспрессии в трансгенном растении, которым питается популяция насекомых рода Diabrotica, молекулы интерферирующей РНК по п. 1, которая подавляет экспрессию целевого гена у насекомого рода Diabrotica на стадии личинки и у взрослого насекомого, вследствие чего обеспечивается уменьшение развития устойчивости у популяции насекомых рода Diabrotica по сравнению с популяцией насекомых рода Diabrotica, подвергнутой воздействию молекулы интерферирующей РНК, способной подавлять экспрессию целевого гена у насекомого рода Diabrotica на стадии личинки или взрослого насекомого.

50. Способ снижения уровня целевой РНК, которая транскрибируется с целевого гена у насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с композицией, содержащей молекулу интерферирующей РНК по любому из пп. 1-8, где молекула интерферирующей РНК снижает уровень целевой РНК в клетке насекомого рода Diabrotica.

51. Способ по п. 50, где обеспечивают снижение продуцирования белка, кодируемого целевой РНК.

52. Способ по п. 51, где белок содержит аминокислотную последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью по отношению к SEQ ID NO: 241-270 или SEQ ID NO: 376.

53. Способ по п. 50, где интерферирующая РНК происходит из трансгенного организма, экспрессирующего интерферирующую РНК.

54. Способ по п. 53, где трансгенный организм представляет собой трансгенное растение, трансгенный микроорганизм, трансгенную бактерию или транс генный эндофит.

55. Способ по п. 50, где интерферирующая РНК обладает летальным действием в отношении насекомого рода Diabrotica.

56. Способ по п. 55, где насекомое рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из D. barberi, D. virgifera virgifera, D. undecimpunctata, D. balteata, D. undecimpunctata, D. significata и D. speciosa.

57. Способ придания растению или его части выносливости в отношении насекомого рода Diabrotica, предусматривающий введение в растение или его часть молекулы интерферирующей РНК, молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты и/или композиции по любому из соответствующих предыдущих пунктов, вследствие чего обеспечивается выносливость растения или его части в отношении насекомого рода Diabrotica.

58. Способ уменьшения повреждения корней у растения, которым питается насекомое рода Diabrotica, предусматривающий введение в клетки растения молекулы интерферирующей РНК, молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты и/или композиции по любому из соответствующих предыдущих пунктов, вследствие чего обеспечивается уменьшение повреждения корней у растения.

59. Способ получения трансгенной растительной клетки, характеризующейся токсичностью для насекомого рода Diabrotica, предусматривающий введение в растительную клетку интерферирующей РНК, молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты и/или композиции по любому из соответствующих предыдущих пунктов, вследствие чего обеспечивается получение трансгенной растительной клетки, характеризующейся токсичностью для насекомого рода Diabrotica по сравнению с контрольной растительной клеткой.

60. Совокупность трансгенных растительных клеток, полученных посредством способа по п. 59.

61. Совокупность трансгенных растительных клеток по п. 60, где растительные клетки выращены в условиях, которые включают естественный солнечный свет.

62. Способ получения трансгенного растения, характеризующегося повышенной выносливостью в отношении повреждения, обусловленного питанием насекомого рода Diabrotica, предусматривающий введение в растение молекулы интерферирующей РНК, молекулы нуклеиновой кислоты или конструкции нуклеиновой кислоты по любому из соответствующих предыдущих пунктов, вследствие чего обеспечивается получение трансгенного растения, характеризующегося повышенной выносливостью в отношении повреждения, обусловленного питанием насекомого рода Diabrotica, по сравнению с контрольным растением.

63. Способ по п. 62, где стадию введения осуществляют посредством трансформации растительной клетки и получения трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.

64. Способ по п. 62, где стадию введения осуществляют путем скрещивания между собой двух растений.

65. Способ повышения контроля популяции насекомых рода Diabrotica, предусматривающий обеспечение трансгенного растения или части растения по п. 25 и применение химического пестицида в отношении растения или части растения.

66. Способ по п. 65, где химический пестицид представляет собой карбамат, пиретроид, фосфорорганическое соединение, фрипрол, неоникотиноид, хлорорганическое соединение, нереистоксин или их комбинацию.

67. Способ по п. 65, где химический пестицид содержит активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из карбофурана, карбарила, метомила, бифентрина, тефлутрина, перметрина, цифлутрина, лямбда-цигалотрина, циперметрина, дельтаметрина, хлорпирифоса, хлорэтоксифоса, диметоата, этопрофоса, малатиона, метил-паратиона, фората, тербуфоса, тебупиримифоса, фипронила, ацетамиприда, имидаклоприда, тиаклоприда, тиаметоксама, эндосульфана, бенсултапа и их комбинации.

68. Способ по п. 67, где активный ингредиент доставляют в продукте, выбранном из группы, состоящей из Furadan®, Lanate®, Sevin®, Talstar®, Force®, Ammo®, Cymbush®, Delta Gold®, Karate®, Ambush®, Pounce®, Brigade®, Capture®, ProShield®, Warrior®, Dursban®, Fortress®, Mocap®, Thimet®, AAstar®, Rampart®, Counter®, Cygon®, Dicap®, Regent®, Cruiser®, Gaucho®, Prescribe®, Poncho®, Aztec® и их комбинации.

69. Способ обеспечения производителя кукурузы средствами контроля популяции насекомых-вредителей рода Diabrotica в культуре кукурузы, предусматривающий (а) продажу трансгенного семени кукурузы, которое содержит молекулу интерферирующей РНК, молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты и/или композицию по настоящему изобретению, или обеспечение производителя им; и (b) извещение производителя о том, что трансгенное семя кукурузы дает трансгенные растения кукурузы, обеспечивающие контроль популяции вредителей рода Diabrotica.

70. Способ идентификации ортологичного целевого гена для применения в качестве стратегии RNAi для контроля вредителя растений, причем указанный способ предусматривает стадии:

a) получения пары праймеров, которые будут амплифицировать мишень, выбранную из группы, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 31-90, 397, 398 или их комплементарной последовательности,

b) амплификации ортологичного целевого гена из образца нуклеиновой кислоты вредителя растений,

c) идентификации последовательности ортологичного целевого гена,

d) получения молекулы интерферирующей РНК, где РНК содержит по меньшей мере одну dsRNA, где dsRNA представляет собой участок двухнитевой РНК, содержащей гибридизированные комплементарные нити, причем одна из нитей содержит последовательность из по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна ортологичной целевой нуклеотидной последовательности в пределах целевого гена, и

е) определения того, характеризуется ли молекула интерферирующей РНК из стадии (d) инсектицидной активностью в отношении вредителя растений;

где, если интерферирующая РНК характеризуется инсектицидной активностью в отношении целевого гена вредителя растений, то был идентифицирован ортологичный целевой ген для применения в контроле вредителя растений.