Растительные тимидинкиназы и их применение - RU2004133390A

Реферат

1. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и выделенный полинуклеотид; вектор, включающий указанный полинуклеотид и промотор; линию упаковывающих клеток, способную продуцировать инфекционный вирион, включающий указанный вектор; или клетку-хозяина, содержащую указанный вектор; причем указанный выделенный полинуклеотид кодирует фермент растительную тимидинкиназу, полученную из растения, при этом указанный выделенный полинуклеотид выбран из группы, включающей:

1) выделенный полинуклеотид, кодирующий фермент тимидинкиназу, полученный из резушки Таля (Arabidopsis thaliana), сосны {Pinus taeda), риса (Oryza sativa) или томата (Lycopersicum esculentum);

2) выделенный полинуклеотид, кодирующий фермент тимидинкиназу, полученный из растения, который при сравнении с тимидинкиназой вируса простого герпеса человека Herpes simplex 1 типа (HSV1-TK) и при трансдукции в эукариотическую клетку по меньшей мере в четыре (4) раза уменьшает IC₅₀ (50% ингибирующую концентрацию) по меньшей мере одного нуклеозидного аналога;

3) выделенный полинуклеотид, кодирующий фермент тимидинкиназу, полученный из растения, который способен фосфорилировать по меньшей мере один нуклеозидный аналог-монофосфат в большей степени, чем тимидинмонофосфат;

4) выделенный полинуклеотид, кодирующий фермент тимидинкиназу, полученный из растения, который имеет соотношение [k_cat/K_m (Thd)]/[k_cat/K_m (по меньшей мере нуклеозидный аналог)] меньше двух (2);

5) выделенный полинуклеотид, кодирующий фермент тимидинкиназу, полученный из растения, который при экспрессии и при сравнении с тимидинкиназой вируса простого герпеса человека Herpes simplex 1 типа (HSV1-TK) имеет по меньшей мере в пять (5) раз меньшее соотношение [k_cat/K_m (Thd)]/[k_cat/K_m (по меньшей мере один нуклеозидный аналог)], где аналог представляет собой любой нуклеозидный аналог; и

6) выделенный мутантный и/или укороченный полинуклеотид, кодирующий вариант фермента тимидинкиназы, полученный из растения, который при сравнении с тимидинкиназой вируса простого герпеса человека Herpes simplex 1 типа (HSV1-TK) и при трансдукции в эукариотическую клетку по меньшей мере в четыре (4) раза уменьшает IC₅₀ по меньшей мере одного нуклеозидного аналога.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где по меньшей мере один нуклеозидный аналог-монофосфат представляет собой 3'-азидо-3'-дезокситимидин (АЗТ) монофосфат, и/или где по меньшей мере один нуклеозидный аналог представляет собой АЗТ.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанный полинуклеотид способен гибридизоваться в условиях по меньшей мере средней жесткости с полинуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:12, или ее комплементарной цепью.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, где указанный полинуклеотид при определении его полной последовательности имеет по меньшей мере 73%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с полинуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:12.

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, где указанный полинуклеотид включает в себя полинуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:12, или ее функциональный аналог.

6. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и выделенный фермент растительную тимидинкиназу, выбранную из группы, включающей:

1) выделенную тимидинкиназу, кодируемую полинуклеотидом по любому из пп.1-5;

2) выделенный фермент растительную тимидинкиназу, полученный из резушки Таля (Arabidopsis thaliana), сосны (Pinus taeda), томата (Lycopersicum esculentum) или риса (Oryza sativa);

3) выделенный фермент растительную тимидинкиназу, который при сравнении с тимидинкиназой вируса простого герпеса человека Herpes simplex 1 типа (HSV1-TK) в эукариотической клетке по меньшей мере в четыре (4) раза уменьшает IC₅₀ по меньшей мере одного нуклеозидного аналога;

4) выделенный фермент тимидинкиназу, полученный из растения, который способен фосфорилировать по меньшей мере один нуклеозидный аналог-монофосфат в большей степени, чем тимидинмонофосфат;

5) выделенный фермент тимидинкиназу, полученный из растения, который имеет соотношение [k_cat/K_m (Thd)]/[k_cat/K_m (по меньшей мере один нуклеозидный аналог)] меньше двух (2);

6) выделенный фермент тимидинкиназу, полученный из растения, который при экспрессии и при сравнении с тимидинкиназой вируса простого герпеса человека Herpes simplex 1 типа (HSV1-TK) имеет по меньшей мере в пять (5) раз меньшее соотношение [k_cat/K_m (Thd)]/[k_cat/K_m (по меньшей мере один нуклеозидный аналог)], где аналог представляет собой любой нуклеозидный аналог; и

7) выделенный мутантный и/или укороченный вариант фермента тимидинкиназы, полученного из растения, который при сравнении с тимидинкиназой вируса простого герпеса человека Herpes simplex 1 типа (HSV1-TK) и при трансдукции в эукариотическую клетку по меньшей мере в четыре (4) раза уменьшает IC₅₀ по меньшей мере одного нуклеозидного аналога.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, где по меньшей мере один нуклеозидный аналог-монофосфат представляет собой АЗТ-монофосфат, и/или где по меньшей мере один нуклеозидный аналог представляет собой АЗТ.

8. Фармацевтическая композиция по п.6, где указанная тимидинкиназа включает в себя один или более чем один из следующих трех мотивов/областей:

Val lle Gly lle Asp Glu Ala Gin Phe Phe (Мотив I)

Val Ala Gly Leu Asp Gly (Мотив II)

Туг Met Pro Val Cys Агд (Мотив III)

Val A1 Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4 (Lid-область), где А1 выбран из Thr и Val, A2 выбран из Thr и Lys, A3 выбран из Ala и Ser, и A4 выбран из Leu и Val.

9. Фармацевтическая композиция по п.6, где указанная тимидинкиназа включает в себя все консервативные остатки, идентифицированные в таблице 1.

10. Фармацевтическая композиция по п.6, где указанная тимидинкиназа при определении ее полной последовательности включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с любой из этих последовательностей.

11. Фармацевтическая композиция по п.6, где указанная тимидинкиназа включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:13, или ее функциональный аналог.

12. Фармацевтическая композиция по п.6, где указанная тимидинкиназа имеет С-концевую делецию примерно 1-60 аминокислотных остатков, предпочтительно 1-50 аминокислотных остатков, более предпочтительно 1-40 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно 1-30 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно 1-26 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно 1-24 аминокислотных остатков.

13. Фармацевтическая композиция по п.12, где указанная тимидинкиназа получена из томата и имеет С-концевую делецию 26 аминокислотных остатков (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5).

14. Фармацевтическая композиция по п.12, где указанная тимидинкиназа получена из резушки Таля и имеет С-концевую делецию 24 аминокислотных остатка (имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11).

15. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-12, где указанная тимидинкиназа получена из сосны и демонстрирует по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:2.

16. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-12, где указанная тимидинкиназа получена из томата и демонстрирует по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:4.

17. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-12, где указанная тимидинкиназа получена из риса и демонстрирует по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:7.

18. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-12, где указанная тимидинкиназа получена из резушки Таля и демонстрирует по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:9.

19. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-12, где указанная тимидинкиназа получена из резушки Таля и демонстрирует по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:11.

20. Фармацевтическая композиция по любому из пп.6-12, где указанная тимидинкиназа получена из резушки Таля и демонстрирует по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID NO:13.

21. Фармацевтическая композиция по п.6, где указанная тимидинкиназа по меньшей мере в три (3) раза уменьшает летальную дозу (ЛД₁₀₀) по меньшей мере одного нуклеозидного аналога при сравнении с действием тимидинкиназы вируса простого герпеса человека Herpes simplex 1 типа (HSVI-TK).

22. Способ сенсибилизации клетки к пролекарству, включающий стадии:

(1) трансфекции или трансдукции указанной клетки полинуклеотидной последовательностью, кодирующей фермент растительную тимидинкиназу, который способствует превращению указанного пролекарства в (цитотоксическое) лекарство, и

(2) доставки указанного пролекарства в указанную клетку;

где указанная клетка более чувствительна к указанному (цитотоксическому) лекарству, чем к указанному пролекарству.

23. Способ по п.22, где полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент растительную тимидинкиназу, представляет собой полинуклеотидную последовательность по любому из пп.1-5.

24. Способ по любому из пп.22-23, где пролекарство представляет собой нуклеозидный аналог.

25. Способ по п.24, где нуклеозидный аналог представляет собой АЗТ (3'-азидо-3'-дезокситимидин).

26. Способ ингибирования патогенного агента в организме теплокровного животного, включающий введение указанному животному полинуклеотида или вектора по любому из пп.1-5.

27. Способ по п.26, где указанную полинуклеотидную последовательность или указанный вектор вводят in vivo.

28. Способ по любому из пп.26-27, где указанный патогенный агент представляет собой вирус, бактерию или паразита.

29. Способ по любому из пп.26-27, где указанный патогенный агент представляет собой опухолевую клетку.

30. Способ по любому из пп.26-27, где указанный патогенный агент представляет собой аутореактивную иммунную клетку.

31. Способ по п.26, дополнительно включающий стадию введения указанному теплокровному животному нуклеозидного аналога.

32. Способ по п.31, где указанный нуклеозидный аналог представляет собой АЗТ (3'-азидо-3'-дезокситимидин).

33. Применение фермента растительной тимидинкиназы по любому из пп.6-21 для фосфорилирования нуклеозидного аналога-монофосфата.

34. Способ фосфорилирования нуклеозидного аналога-монофосфата, включающий стадии, на которых:

1) нуклеозидный аналог-монофосфат подвергают воздействию фермента растительной тимидинкиназы по любому из пп.6-21; и

2) выделяют нуклеозидный аналог-дифосфат.

35. Способ контроля или модификации роста растения, включающего в себя растительные клетки, содержащие полинуклеотид, кодирующий фермент растительную тимидинкиназу по любому из пп.6-21, включающий стадию, на которой растение или растительную клетку подвергают воздействию нуклеозида или нуклеозидного аналога.

36. Средства, включающие нуклеозидный аналог и тимидинкиназу по любому из пп.6-21, или ген, кодирующий указанную полученную из растения тимидинкиназу, или вектор, включающий указанный ген, кодирующий указанную полученную из растения тимидинкиназу, в виде комбинации для одновременного, раздельного или последовательного введения при лечении рака.

37. Выделенный фермент растительная тимидинкиназа, полученный из сосны, имеющий по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2.

38. Выделенный фермент растительная тимидинкиназа, полученный из томата, имеющий по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с любой из последовательностей SEQ ID NO:4 или 5.

39. Выделенный фермент растительная тимидинкиназа, полученный из Arabidopsis thaliana, имеющий по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с последовательностью SEQ ID NO:9 или 11.