Улучшенный способ получения фукозилированных олигосахаридов - RU2019114882A
Код документа: RU2019114882A
Формула
1. Способ получения фукозилированных олигосахаридов с использованием генетически модифицированной прокариотической клетки хозяина, включающий стадии:
- предоставления прокариотической клетки хозяина, генетически модифицированной таким образом, что по меньшей мере (1) активность фермента, преобразующего фруктозо-6-фосфат, которая в немодифицированной клетке хозяине находится на обычном уровне, понижена или подавлена; (2) по меньшей мере один ген, кодирующий фермент, необходимый для синтеза ГДФ-фукозы de novo, сверхэкспрессирован в клетке хозяине; (3) экзогенный ген, кодирующий альфа-1,2-фукозилтрансферазу и/или альфа-1,3-фукозилтрансферазу, экспрессирован в клетке хозяине;
- культивирования и/или выращивания указанной генетически модифицированной клетки хозяина в культуральной среде, содержащей источник углерода и/или энергии, выбранный по меньшей мере из одного из следующих источников: глицерина, сукцината, малата, пирувата, лактата, этанола, цитрата; и
- обеспечения подачи лактозы в культуральную среду;
с получением тем самым фукозилированного олигосахарида, который может быть извлечен из среды, в которой культивируют клетку хозяина.
2. Способ по п. 1, где фукозилированный олигосахарид выбран из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы или дифукозиллактозы.
3. Способ по п. 1 или 2, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной клетки хозяина, предпочтительно выбранной из штамма Escherichia coli, штамма видов Lactobacillus или штамма Corynebacterium glutamicum.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где количество фруктозо-6-фосфата в клетке возрастает в результате понижения или подавления активности фермента, преобразующего фруктозо-6-фосфат, который выбран из группы фосфофруктокиназы, глюкозо-6-фосфат-изомеразы, фруктозо-6-фосфат-альдолазы, транскетолазы или трансальдолазы, и/или в результате возрастания активности фруктозо-1,6-бифосфат-фосфатазы.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где генами, кодирующими ферменты, необходимые для синтеза ГДФ-фукозы de novo, являются: ген, кодирующий фосфоманномутазу, предпочтительно manB, ген, кодирующий маннозо-1-фосфат-гуанозилтрансферазу, предпочтительно manC, ген, кодирующий ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу, предпочтительно gmd, и ген, кодирующий ГДФ-L-фукозосинтазу, предпочтительно wcaG.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где ген, кодирующий по меньшей мере одну фукозилтрансферазу, проявляет альфа-1,2-фукозилтрансферазную и/или альфа-1,3-фукозилтрансферазную активность.
7. Способ по п. 6, где ген, кодирующий альфа-1,2-фукозилтрансферазу, выбран из группы, состоящей из гена wbgL из Е. coli O126 или гена fucT2 из Helicobacter pylori.
8. Способ по п. 6, где ген, кодирующий альфа-1,3-фукозилтрансферазу, выбран из группы, состоящей из генов альфа-1,3-фукозилтрансфераз видов Akkermansia muciniphila, Bacteroides fragilis, Helicobacter pylori или Helicobacter hepaticus.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где клетку хозяина подвергают дальнейшей генетической модификации с целью экспрессирования гена, кодирующего белок, который обеспечивает экспорт или способствует экспорту желаемого фукозилированного олигосахарида в культуральную среду.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где эндогенная или экзогенная пермеаза для импорта лактозы сверхэкспрессирована.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где гены, которые модифицированы в клетке хозяина или которыми модифицируют клетку хозяина, являются эндогенными или экзогенными генами.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где по меньшей мере один из генов, которые модифицированы в клетке хозяина или которыми модифицируют клетку хозяина, сверхэкспрессирован в результате эндогенного или экзогенного индуцирования или конститутивным образом.
13. Способ по п. 9, где ген, кодирующий белок, который обеспечивает экспорт или способствует экспорту желаемого фукозилированного олигосахарида, представляет собой ген, кодирующий эффлюксный переносчик сахара, предпочтительно выбранный из yberc0001_9420 и SetA.
14. Способ по любому из пп. 4-13, где фруктозо-1,6-бифосфат-фосфатаза кодируется геном, представляющим собой функционально активный вариант гена фруктозо-1,6-бифосфат-фосфатазы (fbpase) из Pisum sativum.
15. Способ по любому из пп. 10-13, где пермеаза лактозы представляет собой LacY из Е. coli.
16. Способ по любому из пп. 1-15, где предоставление лактозы осуществляют путем добавления лактозы от начала культивирования в концентрации по меньшей мере 5 мМ, предпочтительно в концентрации 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 мМ, более предпочтительно в концентрации выше 300 мМ.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где предоставление лактозы осуществляют путем добавления лактозы в культуральную среду в такой концентрации, что в течение фазы образования продукта при культивировании достигается концентрация лактозы, составляющая по меньшей мере 5 мМ, предпочтительно 10 мМ или 30 мМ.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где клетки хозяина культивируют в течение по меньшей мере примерно 60, 80, 100 или примерно 120 часов либо в непрерывном режиме.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где экзогенные гены интегрированы в геном штамма-хозяина.
20. Прокариотическая клетка для получения фукозилированного олигосахарида, отличающаяся тем, что данная клетка генетически модифицирована таким образом, что по меньшей мере (1) активность фермента, преобразующего фруктозо-6-фосфат, которая в немодифицированной клетке хозяина находится на обычном уровне, понижена или подавлена; (2) по меньшей мере один ген, кодирующий фермент, необходимый для синтеза ГДФ-фукозы de novo, сверхэкспрессирован; (3) экзогенный ген, кодирующий альфа-1,2-фукозилтрансферазу и/или альфа-1,3-фукозилтрансферазу экспрессирован в данной клетке.
21. Прокариотическая клетка по п. 20, где данная клетка выбрана из штамма Escherichia coli, штамма Lactobacillus или штамма Corynebacterium.
22. Прокариотическая клетка по п. 20 или 21, где внутриклеточное количество фруктозо-6-фосфата увеличивается в результате (1) понижения или подавления активности фермента, преобразующего фруктозо-6-фосфат, выбранного из группы фосфофруктокиназы, глюкозо-6-фосфат-изомеразы, фруктозо-6-фосфат-альдолазы, транскетолазы или трансальдолазы, или (2) повышения активности фруктозо-1,6-бифосфат-фосфатазы.
23. Прокариотическая клетка по любому из пп. 20-22, где гены, кодирующие ферменты, необходимые для синтеза ГДФ-фукозы de novo, сверхэкспрессированы.
24. Прокариотическая клетка по любому из пп. 20-23, где экзогенные гены, кодирующие альфа-1,2-фукозилтрансферазы и/или альфа-1,3-фукозилтрансферазы, выбраны из гена wbgL из Е. coli O126 или гена fucT2 из Helicobacter pylori, когда речь идет об альфа-1,2-фукозилтрансферазах, и из генов видов Akkermansia muciniphila, Bacteroides fragilis, Helicobacter pylori или H. hepaticus, когда речь идет об альфа-1,3-фукозилтрансферазах.
25. Применение прокариотической клетки по любому из пп. 20-24 для получения фукозилированного олигосахарида, предпочтительно 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы или дифукозиллактозы.
