Мoдифицированные протеазы - RU2496875C2
Код документа: RU2496875C2
Чертежи
Показать все 30 чертежа(ей)
Описание
Текст описания приведен в факсимильном виде.
Реферат
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный модифицированный полинуклеотид, кодирующий модифицированную полноразмерную протеазу. При этом часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует про-участок указанной полноразмерной протеазы, содержит мутацию, кодирующую замену в одном аминокислотном положении, выбранном из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 244, где указанный полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, приблизительно на 95% полинуклеотидной последовательности SEQ ID NО:4, 12 или 243 с учетом вырожденности генетического кода, где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой сериновую протеазу, где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой щелочную сериновую протеазу, полученную из предшественника щелочной сериновой протеазы дикого типа, где указанный предшественник щелочной сериновой протеазы представляет собой щелочную сериновую протеазу В. clausii или В. lentus, и где указанная модифицированная полноразмерная протеаза имеет повышенную активность продукции по сравнению с полипептидом указанного предшественника. Изобретение позволяет расширить арсенал высокоэффективных протеаз. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 4 пр.
Формула
1. Выделенный модифицированный полинуклеотид, кодирующий модифицированную полноразмерную протеазу, где часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует проучасток указанной полноразмерной протеазы, содержит мутацию, кодирующую замену в одном аминокислотном положении, выбранном из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 244,
где указанный полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, приблизительно на 95% полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4, 12 или 243 с учетом вырожденности генетического кода,
где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой сериновую протеазу,
где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой щелочную сериновую протеазу, полученную из предшественника щелочной сериновой протеазы дикого типа,
где указанный предшественник щелочной сериновой протеазы представляет собой щелочную сериновую протеазу В. clausii или В. Lentus, и
где указанная модифицированная полноразмерная протеаза имеет повышенную активность продукции по сравнению с полипептидом указанного предшественника.
где указанный полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, идентичную, по меньшей мере, приблизительно на 95% полинуклеотидной последовательности SEQ ID NO:4, 12 или 243 с учетом вырожденности генетического кода,
где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой сериновую протеазу,
где указанная модифицированная полноразмерная протеаза представляет собой щелочную сериновую протеазу, полученную из предшественника щелочной сериновой протеазы дикого типа,
где указанный предшественник щелочной сериновой протеазы представляет собой щелочную сериновую протеазу В. clausii или В. Lentus, и
где указанная модифицированная полноразмерная протеаза имеет повышенную активность продукции по сравнению с полипептидом указанного предшественника.
2. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где полинуклеотид, кодирующий протеазу-предшественника, имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, 9 или 240.
3. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная часть указанного модифицированного полинуклеотида, которая кодирует проучасток, содержит мутацию, кодирующую замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из Е33, Е43, А44, Е47, V49, Е57, А59, Е63, Е70, Е74, Е84 и Е88 SEQ ID NO:5, 13 или 244.
4. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.3, где указанная замена Е33 выбрана из E33D, E33I, E33S, E33N, Е33К, Е33Н, E33Q и E33R.
5. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.3, где указанная замена Е57 выбрана из E57F, E57W, Е57К, E57R, E57D, Е57М, Е57С, E57Q, E57S, Е57Н, E57N и E57G.
6. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.1, где указанная мутация, кодирующая замену, по меньшей мере, в одном аминокислотном положении, выбранном из положений, эквивалентных аминокислотным положениям 28-108 и 109 SEQ ID NO:5, 13 или 244, кодирует замену, выбранную из группы, состоящей из: A28Q, А28Т, Е29Т, E29Y, E29V, E29Q, Е29К, Е29М, Е29Р, E29N, E29S, E29G, Е29А, E30Q, Е30К, Е30М, Е30А, E30G, E30R, E30S, Е30Н, E30N, Е30Т, A31R, A31G, A31S, А31К, А31Р, E33R, E33Q, E33G, Е33Н, E33N, E33S, E33D, E33I, Е33К, Е33М, K34R, N40V, N40K, N40E, N40Q, N40H, N40Y, N40T, N40A, N40L, N40W, N40F, N40R, Е41А, E41S, E41N, Е41Т, Е41Н, E41R, Q42M, Q42R, Q42P, Q42W, E43S, E43R, E43D, Е43Н, Е43А, A44D, A44Q, А44Е, A44S, V45L, V45A, V45C, S46H, S46R, S46T, S46A, S46Q, S46Y, S46W, E47D, E47R, Е47К, E47Q, Е47Н, F48W, V49G, Е50Н, Q51M, Q51R, V52L, V52W, Е53А, Е53К, E53R, Е53Н, A54L, A54S, D56G, D56S, D56K, D56R, E57N, Е57Н, E57S, E57G, E57Q, Е57С, Е57М, E57D, E57R, Е57К, E57W, E57F, V58R, V58Y, V58H, V58M, V58K, V58C, V58L, V58A, V58F, A59R, A59Y, A59V, A59I, A59F, A59W, А59М, A59L, А59Н, I60L, L61M, L61T, L61A, L61I, L61V, L61G, L61P, L61D, S62V, S62W, S62M, S62P, S62N, S62H, S62Q, S62D, S62G, S62I, S62A, S62L, S62C, S62R, S62T, Е63А, E63G, E63D, E63R, Е63Т, E63Q, Е63С, Е63К, .Е63Н, E63I, E63S, Е64Т, E64R, E64S, Е64А, Е65М, E65R, E65Q, Е65А, E65V, E65Y, E66S, Е66А, Е66Т, Е66Р, E66R, E66Y, Е66К, E66G, E66V, Е66М, E66Q, V67I, Е68К, E68Q, I69V, Е70Т, E70R, E70N, E70S, E70V, L71V, L71I, E74Q, E74R, E74V, Е74К, Е74А, E74I, F75Y, Е76К, E76S, Е76Т, Е76Н, E76N, E76D, T77N, Т77Н, I78T, S82L, S82Q, S82V, V83N, V83Y, E84L, Е84К, E84V, Е84М, E84S, Е84А, E84G, Е84Т, E84R, E84F, E84Q, L85F, S86R, S86D, S86K, S86N, S86A, Е88Р, E88D, D89K, D89H, D91E, D91P, D91A, D91T, D91N, D91K, D91W, D91R, D91F, A92R, А92К, А92Т, А92М, A92V, A92Q, A92I, A92L, A92S, Е94А, Е94М, Е94Т, E94R, E94S, E94L, L95E, L95R, L95K, L95S, L95C, L95A, L95T, L95D, L95G, L95V, L95H, D96Y, D96H, D96C, D96S, D96L, D96E, D96I, D96W, D96Y, A98R, A98K, A98D, A98L, S100A, E103T, E103P, E104P, A106F, A106K, A106V, A106L, A106M, E107Q, E107P, T109Y, T109E, T109G, T109N, T109S, T109M, T109R, T109Q и T109W.
7. Выделенный модифицированный полинуклеотид по п.6, где указанная мутация кодирует, по меньшей мере, одну замену указанных положений SEQ ID NO:13.
8. Вектор экспрессии, содержащий модифицированный полинуклеотид по п.1.
9. Клетка-хозяин, способная экспрессировать экзогенный генетический материал, трансформированная вектором по п.8,
где необязательно указанная клетка-хозяин представляет собой микроорганизм,
и где необязательно указанная клетка-хозяин представляет собой микроорганизм, выбранный из группы, состоящей из Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp.H Aspergillus sp.
где необязательно указанная клетка-хозяин представляет собой микроорганизм,
и где необязательно указанная клетка-хозяин представляет собой микроорганизм, выбранный из группы, состоящей из Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp.H Aspergillus sp.
10. Клетка-хозяин по п.9, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку В. subtilis.
11. Протеаза, продуцируемая клеткой-хозяином по п.9.
12. Способ получения гетерологичной протеазы в микроорганизме, включающий стадии:
(a) культивирования клетки-хозяина Bacillus в пригодных условиях, где клетка-хозяин Bacillus содержит модифицированный полинуклеотид по п.1, кодирующий модифицированную протеазу; и
(b) позволения микроорганизму продуцировать указанную протеазу,
где необязательно указанную гетерологичную протеазу, продуцируемую указанным хозяином Bacillus, выделяют.
(a) культивирования клетки-хозяина Bacillus в пригодных условиях, где клетка-хозяин Bacillus содержит модифицированный полинуклеотид по п.1, кодирующий модифицированную протеазу; и
(b) позволения микроорганизму продуцировать указанную протеазу,
где необязательно указанную гетерологичную протеазу, продуцируемую указанным хозяином Bacillus, выделяют.
13. Способ по п.12, где указанная модифицированная протеаза содержит мутацию, соответствующую аминокислотной замене, выбранной из E33D, E33I, E33S, E33N, Е33К, Е33Н, E33Q, E33R, E57F, E57W, Е57К, E57R, E57D, Е57М, Е57С, E57Q, E57S, Е57Н, E57N и E57G.
14. Способ по п.12, где указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из В. licheniformis, В. lentus, В. subtilis, В. amyloliquefaciens, В. brevis, В. stearothermophilus,, В. clausii, В. alkalophilus, В. halodurans, В. coagulans, В. circulans, В. pumilus и В. Thuringiensis,
где необязательно указанная гетерологичная протеаза представляет собой протеазу В. clausii или В. lentus.
где необязательно указанная гетерологичная протеаза представляет собой протеазу В. clausii или В. lentus.
15. Способ по п.12, где указанная гетерологичная протеаза обладает отношением продукции, равным, по меньшей мере, 1.
16. Способ по п.12, где указанная модифицированная протеаза содержит мутацию, соответствующую аминокислотной замене, выбранной из группы, состоящей из: A28Q, А28Т, Е29Т, E29Y, E29V, E29Q, Е29К, Е29М, Е29Р, E29N, E29S, E29G, E29A, E30Q, Е30К, Е30М, Е30А, E30G, E30R, E30S, Е30Н, E30N, Е30Т, A31R, A31G, A31S, А31К, А31Р, E33R, E33Q, E33G, Е33Н, E33N, E33S, E33D, E33I, Е33К, Е33М, K34R, N40V, N40K, N40E, N40Q, N40H, N40Y, N40T, N40A, N40L, N40W, N40F, N40R, Е41А, E41S, E41N, Е41Т, Е41Н, E41R, Q42M, Q42R, Q42P, Q42W, E43S, E43R, E43D, Е43Н, Е43А, A44D, A44Q, А44Е, A44S, V45L, V45A, V45C, S46H, S46R, S46T, S46A, S46Q, S46Y, S46W, E47D, E47R, Е47К, E47Q, Е47Н, F48W, V49G, Е50Н, Q51M, Q51R, V52L, V52W, Е53А, Е53К, E53R, Е53Н, A54L, A54S, D56G, D56S, D56K, D56R, E57N, Е57Н, E57S, E57G, E57Q, Е57С, Е57М, E57D, E57R, Е57К, E57W, E57F, V58R, V58Y, V58H, V58M, V58K, V58C, V58L, V58A, V58F, A59R, A59Y, A59V, A59I, A59F, A59W, А59М, A59L, А59Н, I60L, L61M, L61T, L61A, L61I, L61V, L61G, L61P, L61D, S62V, S62W, S62M, S62P, S62N, S62H, S62Q, S62D, S62G, S62I, S62A, S62L, S62C, S62R/S62T, E63A, E63G, E63D, E63R, E63T, E63Q, E63C, E63K, E63H, E63I, E63S, E64T, E64R, E64S, E64A, E65M, E65R, E65Q, E65A, E65V, E65Y, E66S, E66A, E66T, E66P, E66R, E66Y, E66K, E66G, E66V, E66M, E66Q, V67I, E68K, E68Q, I69V, E70T, E70R, E70N, E70S, E70V, L71V, L71I, E74Q, E74R, E74V, E74K, E74A, E74I, F75Y, E76K, E76S, E76T, E76JH, E76N, E76D, T77N, T77H, I78T, S82L, S82Q, S82V, V83N, V83Y, E84L, E84K, E84V, E84M, E84S, E84A, E84G, E84T, E84R, E84F, E84Q, L85F, S86R, S86D, S86K, S86N, S86A, E88P, E88D, D89K, D89H, D91E, D91P, D91A, D91T, D91N, D91K, D91W, D91R, D91F, A92R, A92K, A92T, A92M, A92V, A92Q, A92I, A92L, A92S, E94A, E94M, E94T, E94R, E94S, E94L, L95E, L95R, L95K, L95S, L95C, L95A, L95T, L95D, L95G, L95V, L95H, D96Y, D96H, D96C, D96S, D96L, D96E, D96I, D96W, D96V, A98R, A98K, A98D, A98L, S100A, E103T, E103P, E104P, A106F, A106K, A106V, A106L, A106M, E107Q, E107P, T109Y, T109E, T109G, T109N, T109S, T109M, T109R, T109Q и T109W,
и где необязательно указанная мутация кодирует, по меньшей мере, одну замену указанных положений SEQ ID NO:13.
и где необязательно указанная мутация кодирует, по меньшей мере, одну замену указанных положений SEQ ID NO:13.
