Способы получения вирусных частиц с упрощенным гликозилированием поверхностных белков - RU2607452C2

Чертежи

Описание

Перекрестные ссылки на связанные заявки

Эта заявка заявляет приоритет предварительной патентной заявки США с серийным номером 61/410,257, поданной 4 ноября 2010 года и озаглавленной «СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА», содержание которой включено в данный документ полностью ссылкой.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вирусам и, в частности, к получению вирусных частиц с упрощенными гликанами. В частности, настоящее изобретение относится к получению частиц вируса гриппа с упрощенным гликозилированием. Конкретнее, изобретение относится к способам получения моногликозилированных частиц вируса гриппа.

Предшествующий уровень техники

Раскрытое в данном документе изобретение продемонстрировано на примере получения моногликозилированных вирусов гриппа. Предполагается, что эти же способы могут быть использованы для получения других вирусов с упрощенной гликановой структурой, включая ретровирусы, такие как вирус иммунодефицита человека (HIV) и флавивирусы, такие как вирус Денге, вирус Западного Нила, вирус гепатита С (HCV) и т.п.

Грипп вызывается РНК-вирусом семейства Orthomyxoviridae. Существует три типа этих вирусов и они вызывают три различных типа гриппа: типы А, В и С. Вирусы гриппа типа А инфицируют млекопитающих (людей, свиней, хорьков, лошадей) и птиц. Это очень важно для человечества, поскольку это тот тип вируса, который вызывает всемирные пандемии. Вирус гриппа типа В (также известный просто как грипп В) инфицирует только людей. Обычно он вызывает локальные вспышки гриппа. Вирусы гриппа С также инфицируют только людей. Они инфицируют большинство людей в молодости и редко вызывают серьезное заболевание.

Вирусы гриппа А инфицируют широкий круг млекопитающих, включая людей, лошадей, свиней, хорьков и птиц. Основной человеческий патоген, связанный с эпидемиями и пандемиями. Существует, по меньшей мере, 1 известный серотип гемагглютинина (Н) и 9 известных серотипов нейраминидазы (N). Считается, что свиньи и птицы являются особенно важными резервуарами, образующими пулы генетически и антигенно разнообразных вирусов, которые переносятся обратно в человеческую популяцию через близкие контакты между людьми и животными. Вирусы гриппа В инфицируют млекопитающих и вызывают заболевание, в целом не такое тяжелое, как вызванное типами А. В отличие от вирусов гриппа А, вирусы гриппа В не имеют различаемых серотипов. Вирусы гриппа С также инфицируют только млекопитающих, но редко вызывают заболевание. Они генетически и морфологически отличны от типов А и В.

В вирусе гриппа присутствует 4 антигена, гемагглютинин (НА), нейраминидаза (NA), нуклеокапсид (NA), матрикс (М) и белки нуклеокапсида (NP). NP является тип-специфичным антигеном, который существует в 3 формах, А, В и С, которые обеспечивают основу для классификации вирусов гриппа человека. Матричный белок (М-белок) окружает нуклеокапсид и составляет 35-45% массы частицы. Два поверхностных гликопротеина видны на поверхности как палочкообразные выступы. Гемагглютинин изначально синтезируется как тримерный предшественник (НАО), содержащий три идентичных белковых цепи, каждая из которых протеолитически процессируется в две субъединицы, НА1 и НА2, которые удерживаются вместе с ковалентной одиночной дисульфидной связью. НА опосредует прикрепление вируса к клеточному рецептору.

Молекулы нейраминидазы (NA) присутствуют в оболочке в меньших количествах. Циркулирующие человеческие штаммы известны своей тенденцией накапливать мутации из года в год и вызывать повторяющиеся эпидемии.

У эукариот остатки сахаров, как правило, связаны с четырьмя различными аминокислотными остатками. Эти аминокислотные остатки классифицируются как O-связывающие (серии, треонин и гидроксилизин) и N-связывающие (аспарагин). O-связанные сахара синтезируются в Гольджи или в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) из нуклеотид сахаров. N-связанные сахара синтезируются из общего предшественника, а затем процессируются. Известно, что добавление N-связанных углеводных цепей важно для стабилизации фолдинга, предотвращения деградации в эндоплазматическом ретикулуме, олигомеризации, биологической активности и транспорта гликопротеинов. Добавление N-связанных олигосахаридов к специфических остаткам Asn играет важную роль в регуляции активности, стабильности и антигенности зрелых белков вирусов (Opdenakker G. et al FASEB Journal 7, 1330-1337 1993). Также было высказано предположение, что N-связанное гликозилирование требуется для фолдинга, транспорта, экспрессии на клеточную поверхность, секреции гликопротеинов (Helenius, A., Molecular Biology of the Cell 5, 253-265 1994), защиты от протеолитической деградации и усиления растворимости гликопротеина (Doms et al.. Virology 193, 545-562 1993). Гликопротеины вирусной поверхности требуются не только для корректного фолдинга белков, но также обеспечивают защиту против нейтрализующих антител в качестве «гликанового щита». В результате, сильный хозяин-специфичный отбор часто ассоциируется с положениями кодонов потенциального N-связанного гликозилирования. Следовательно, участки N-связанного гликозилирования имеют тенденцию к консервативности среди штаммов и клад.

Вспышки гриппа А продолжают приводить к масштабным заболеваниям и смертности по всему миру. Только лишь в Соединенных Штатах, по оценкам, ежегодно вирусом гриппа А инфицируется от 5 до 20% населения, что вызывает примерно 200000 госпитализаций и 36000 смертей. Установление всеобъемлющих принципов вакцинации было бы эффективной мерой для ограничения заболеваемости гриппом. Однако частый генетический дрейф вируса требует ежегодного пересоставления вакцины, что потенциально приводит к несовпадению между вирусным штаммом, присутствующим в вакцине, и тем, который циркулирует. Таким образом, противовирусные терапии против вируса гриппа являются важными инструментами для ограничения как тяжести заболевания, так и передачи заболевания.

Высокопатогенные вирусы гриппа H5N1 вызывали вспышки среди домашней и дикой птицы начиная с 2003 года (Li К S et al. (2004) Nature 430:209-213). По данным на февраль 2010 года, эти вирусы инфицировали не только виды птиц, но также свыше 478 человек, из которых 286 случаев достоверно являлись фатальными (www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2010_02_111en/index.html).

Высокопатогенный H5N1 вирус гриппа А и вирус гриппа А свиного происхождения (H1N1) 2009 года вызвали глобальные вспышки и явились причиной острого беспокойства, что могут произойти дальнейшие изменения в вирусах, которые приведут к смертельной пандемии (Garten R J, et al.(2009) Science 325: 197-201, Neumann G, et al. (2009) Nature 459:931-939). Существует острая обеспокоенность тем, что вирус гриппа может приобрести способность эффективно распространяться среди людей, тем самым угрожая возникновением пандемии. Вакцина против гриппа должна, следовательно, быть интегральной частью любого плана подготовки к пандемии.

Важные вклады в понимание инфекций гриппа пришли из исследований гемагглютинина (НА), гликопротеина вирусной оболочки, который связывает специфические рецепторы с сиалированными гликанами в дыхательных путях, что позволяет вирусу проникнуть в клетку (Kuiken Т, et al. (2006) Science 312:394-397; Maines TR, et al. (2009) Science 325:484-487; Skehel JJ, Wiley DC (2000) Ann Rev Biochem 69:531-569; van Riel D, et al.(2006) Science 312:399-399). Для преодоления межвидового барьера и инфицирования человеческой популяции должны измениться предпочтения связывания птичьим НА с рецептора с терминально сиалированным гликаном, содержащего мотивы α2,3-связанной (птичий) сиаловой кислоты на рецептор, содержащий мотивы α2,6-связанной (человеческий) сиаловой кислоты (Connor RJ, et al. (1994) Virology 205:17-23), и это переключение должно произойти всего лишь двумя мутациями, как при пандемии 1918 года (Tumpey TM, et al.(2007) Science 315:655-659). Следовательно, понимание факторов, которые влияют на связывание гриппа с гликановыми рецепторами, является критически важным для разработки способов контроля любых будущих кроссоверных штаммов гриппа, которые имеют пандемический потенциал.

Гемагглютинин (НА) вируса гриппа является гомотримерным тренсмембранным белком с эктодоменом, состоящим из глобулярной головы и области стержня (Kuiken Т, et al. (2006) Science 312:394-397). Обе области несут N-связанные олигосахариды (Keil W, et al. (1985) EMBO J 4:2711-2720), которые оказывают влияние на функциональные свойства НА (Chen ZY, et al.HA (Chen ZY, et al. (2008) Vaccine 26:361-371; Ohuchi R, et al. (1997) J Virol 71:3719-3725). НА является гликопротеином поверхности вириона, который прикрепляет вирус к его рецепторам на клетках-хозяевах и сливает вирусную оболочку с мембранами эндоцитозных везикул для инициации инфекционного процесса. (Crecelius D.М., et al. (1984) Virology 139, 164-177). НА также является компонентом вириона, который стимулирует образование защитных антител. Природа и степень гликозилирования НА вовлечены в изменение его свойств связывания рецептора, в появление вирусных вариантов с повышенной цитопатогенностью (Aytay S., Schuize I.Т. (1991) J. Virol. 65, 3022-3028) и вирулентностью (Deshpande К. L., et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 36-40), и в маскировку его антигенных участков (Skehel J.J., et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1779-1783).

Мутационная делеция участков гликозилирования НА может оказать влияние на связывание с вирусным рецептором (Gunther I, et al. (1993) Virus Res 27:147-160).

Аминокислотная последовательность НА и, следовательно, расположение на нем участков N-гликозилирования, определяется вирусным геномом. Структуры этих олигосахаридов, по всей видимости, определяются по их положению на НА (Keil W., et al. (1985) EMBO J. 4, 2711-2710) и биосинтетическими и обрезающими ферментами, предоставляемыми клеткой-хозяином, в которой вырос вирус. Пластичность вирусного генома и определяемого хозяином механизма гликозилирования могут совместно привести к образованию вирусных популяций, которые являются более гетерогенными по структуре и функции, чем могли бы развиться в любом из процессов отдельно. Это разнообразие рассматривается как ответственное за выживание этих вирусов и за их способность преодолевать ингибирующие эффекты нейтрализующих антител и антивирусных агентов.

По всей видимости, НА обладает областями, которые должны быть гликозилированы, другими областями, которые должны быть свободными от олигосахаридов, а также областями, гликозилирование которых может оказывать либо благоприятное, либо вредное воздействие на выживание вируса. Участки гликозилирования в некоторых положениях на НА вируса гриппа А, выделенные из различных животных и людей, являются высококонсервативными и, следовательно, по всей видимости являются существенными для образования и/или поддержания функционального НА (Gallagher P. J., et al. (1992) J. Virol. 66, 7136-7145). И наоборот, образование участков гликозилирования в некоторых областях НА ухудшает его транспорт к клеточной поверхности и его стабильность и/или функцию (Gallagher P., et al. (1988) J. Cell Biol. 107, 2059-2073). В областях, в которых гликозилирование либо недопустимо, либо не требуется для образования функционального НА, эта олигосахаридное разнообразие может иметь основной селективный эффект, в зависимости от конкретной среды, в которой вирус будет расти.

Изменения в пептидной последовательности в участках гликозилирования или около участков гликозилирования могут изменить ЗВ-структуру НА, и, таким образом, специфичность связывания с рецептором и аффинность. Действительно, НА из различных подтипов H5N1 имеют различные паттерны связывания гликанов (Stevens J, et al. (2008) J Mol Biol 381: 1382-1394).

Мутагенез участков гликозилирования на H1 и Н3 был исследован в системе целых вирусов (Chandrasekaran А, et al. (2008) Nat Biotechnol 26: 107-113; Deom CM, et al. (1986) Proc Nati Acad Sci USA 83:3771-3775). Изменения в гликозилировании могут затронуть специфичность связывания рецепторов и аффинность, особенно в отношении наиболее патогенного H5N1 НА.

Области с меньшей степенью гликозилирования или негликозилированные области гемагглютинина продолжают мутировать для того, чтобы избежать иммунной системы хозяина. Вакцинный дизайн с использованием моногликозилированного НА раскрыт в публикации патентной заявки США No. 2010/0247571 (Wong et al). Таким образом, существует потребность в новых и эффективных способах получения моногликозилированных частиц вируса гриппа.

Сущность изобретения

В данном документе в описании представлена примерная демонстрация получения моногликозилированных вирусов гриппа. Описанные способы в равной степени применимы для получения вирусов с упрощенными гликанами на структурных белках. Консервативные области структурных белков с высокой степенью гликозилирования могут быть определены в качестве мишени для вакцинного дизайна, поскольку паттерны гликозилирования в этих участках упрощаются до моно-, ди-, три- или других степеней гликозилирования.

В частности, существует потребность в перекрестно нейтрализующих моноклональных антителах, которые могут быть использованы в дизайне и проверке процессов выработки вакцин, которые сохраняют или усиливают качество и антигенность перекрестно-нейтрализуемых эпитопов в текущей вакцине и в вакцине, которая будет изготовлена в будущем.

Если предположить, что связывание антитела с антигеном является отражением структурной целостности и антигенного потенциала, можно попытаться осуществить связывание перекрестно нейтрализующими антителами, например с моногликозилированными полипептидами НА, и количественно оценить их перекрестно-нейтрализующий потенциал. Вакцины, полученные против моногликозилированных производных НА гриппа, как ожидается, будут иметь повышенную иммуногенность по отношению к универсальным эпитопам.

Антиген получают частичным удалением сахаров из вирусного гликопротеина для экспонирования участков гликозилирования (которые являются высококонсервативными и не мутируют или не мутируют агрессивно), и в то же время с сохранением сахаров в количестве, адекватном для поддержания четвертичной структуры гликопротеина. Частично гликозилированные вирусные гликопротеины образуются частичным дегликозилированием гликопротеинов, например, того или иного участка гликозилирования, сохраняющего одну, две или три единицы сахара. В некоторых аспектах частично гликозилированный гликопротеин может быть получен присоединением моно-, ди- или трисахарида к участкам гликозилирования белка или пептида, негликозилированного в одном или большем количестве специфических участков гликозилирования.

Описана вакцина, содержащая, по меньшей мере, один частично гликозилированный гликопротеин НА и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях частично гликозилированный гликопротеин НА выбирают из группы, состоящей из частично гликозилированного вируса гриппа H1, Н3 и Н5.

Описан способ, включающий введение объекту, восприимчивому к гриппу, вакцины содержащей, по меньшей мере, один дегликозилированный НА-гликопротеин и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях дегликозилированный НА-гликопротеин выбирают из группы, состоящей из H1, Н3 и Н5.

В некоторых воплощениях дегликозилирование оставляет один или большее количество участков гликозилирования на гликопротеине в состоянии моногликозилирования (остается один сахар). В некоторых воплощениях дегликозилирование оставляет по меньшей мере один участок гликозилирования на гликопротеине в состоянии дигликозилирования (остается 2 сахара). В некоторых воплощениях дегликозилирование оставляет один или большее количество участков гликозилирования на гликопротеине в состоянии тригликозилирования (остается 3 сахара). В некоторых воплощениях дегликозилирование сохраняет в состоянии моногликозилирования, дигликозилирования и тригликозилирования, по меньшей мере, один участок гликозилирования на гликопротеине.

В некоторых воплощениях НА-антиген гриппа является рекомбинантно продуцируемым в клеточной культуре. Клеточная культура содержит клетки MDCK, Vero или PER.C6. Кифунензин добавляют к клетке-хозяину, несущей рекомбинантный НА-антиген гриппа.

В некоторых аспектах ингибирование а-маннозидазы I приводит к появлению гликопротеинов с Man₉(GlcNAc)₂.

В других воплощениях НА-антиген гриппа содержит целый вирус гриппа. Целый вирус гриппа выращен в хозяине, свободном от особых патогенов (SRF) курином яйце с зародышем.

Затем кифунензин добавляется в аллантоисную полость свободного от особых патогенов (SPF) куриного яйца с зародышем.

В некоторых аспектах кифунензин добавляют в концентрации от 0,005 до 0,5 мг/мл.

Извлеченный На-антиген вируса гриппа обрабатывают от около 0,1 до около 100 мкг/мл Endo Н.

В некоторых аспектах моногликозилированный вирус гриппа выделяют способом, включающим ультрацентрифугирование в градиенте плотности.

В некоторых аспектах способ дополнительно включает очистку моногликозилированного НА-антигена вируса гриппа способом, включающим ультрафильтрацию. В некоторых воплощениях ультрафильтрация включает применение 0,2 мкм фильтра.

В некоторых аспектах способ дополнительно включает анализ моногликозилированного вируса гриппа электронной микроскопией.

В некоторых аспектах способ дополнительно включает количественную оценку моногликозилированного вируса гриппа способом, включающим обработку РNGазой. В некоторых аспектах способ дополнительно включает количественную оценку моногликозилированного вируса гриппа способом, включающим электрохроматографию в ДСН-ПААГ.

В некоторых аспектах способ дополнительно включает анализ гликановой композиции выделенного моногликозилированного вируса гриппа способом, включающим масс-спектрометрию.

Изобретение относится к моногликозилированному НА-антигену вируса гриппа (из целого вируса или к рекомбинантному), полученному любым способом, описанным в данном документе.

Изобретение относится к применению для получения вакцины моногликозилированного НА-антигена вируса гриппа (из целого вируса или к рекомбинантному), полученному любым способом, описанным в данном документе.

Этот и другие аспекты будут ясны из следующего описания предпочтительного воплощения, взятого вместе с нижеследующими чертежами, хотя вариации и модификации в нем могут быть осуществлены без отхода от сущности и объема новых концепций описания.

Краткое описание чертежей

Нижеперечисленные чертежи образуют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего описания, изобретения которые лучше могут быть поняты ссылкой на один или несколько из числа данных чертежей вместе с подробным описанием конкретных воплощений, представленных в данном документе. Комплект материалов патента или заявки содержит, по меньшей мере, один чертеж, выполненный в цвете. Копии публикации этих патента или патентной заявки с цветным чертежом(ами) будут предоставлены ведомством по запросу и после оплаты необходимого сбора.

На фигуре 1 показано получение моногликозилированного вируса NIBRG-14. (фиг. 1А) Вирус выращен при различных концентрациях ингибитора N-гликозилирования, кифунензина. (фиг. 1В) Вирус с высоким содержанием маннозы расщепляли до моногликозилированного вируса различными концентрациями Endo Н. (фиг. 1C) По сравнению с очищенным полностью гликозилированным вирусом, очищенный моногликозилированный вирус имел очевидные смещения как по НА1, так и по НА2. Эти образцы анализировали вестерн-блоттингом с использованием анти-Н5 НА кроличьей антисыворотки.

На фигуре 2 представлены изображения полностью гликозилированных и моногликозилированных вирусов гриппа, полученные с помощью электронной микроскопии, (фиг. 2А) Полностью гликозилированный NIBRG-14. (фиг. 2В) Моногликозилированный NIBRG-14. Вирусные частицы окрашивали 2%-й метиламин вольфраматом и анализировали трансмиссионной электронной микроскопией.

На фигуре 3 представлен количественный анализ гемагглютинина. Количество гемагглютинина вируса NIBRG-14 было определено по интенсивности дегликозированного PNGou F НА1 в ДСН-ПААГ.

На фигуре 4 представлен гликопептидный анализ моногликозилированного гемагглютинина NIBRG-14. (фиг. 4А) Участки гликозилирования гемагглютинина NIBRG-14 отмечены номерами аминокислотных остатков. Структура была создана с помощью PDB-кода 1jsm, а участок гликозилирования окрашен красным (фиг. 4В). Гликопептидный анализ моногликозилированного гемагглютинина NIBRG-14. После расщепления с помощью Endo H, большинство участков гликозилирования являются моногликозилированными, за исключением того, что участки гликозилирования 295 и 489 остаются частично (<10%) гликозилированы с высоким содержанием маннозы.

Подробное описание изобретения

Термины, использованные в данном описании, в целом имеют обычные значения в данной области в контексте изобретения, и в конкретном контексте, в котором используется каждый из терминов. Некоторые термины, используемые для описания изобретения, обсуждаются ниже, или где-либо еще в описании, для обеспечения дополнительных указаний специалисту-практику в отношении описания изобретения. Для удобства некоторые термины могут быть выделены, например, с помощью курсива и/или кавычек. Применение выделения не оказывает влияния на объем и значение термина; объем и значения термина являются теми же самыми в том же контексте, вне зависимости от того, выделен термин или нет. Следует иметь в виду, что то же самое можно сказать более чем одним способом.

Следовательно, для любого одного или большего количества терминов, обсуждаемых в данном документе, могут быть использованы альтернативная формулировка и синонимы, если какое-либо специальное значение не представлено где-либо, или если термин не конкретизирован или не затронут в данном документе. Для некоторых терминов предлагаются синонимы. Изложение одного или нескольких синонимов не исключает применение других синонимов. Применение примеров где-либо в описании, включая примеры любых терминов, обсуждаемых в данном документе, применяется только в иллюстративных целях и никак не ограничивает объем и значение изобретения или любого приведенного для примера термина. Также изобретение не ограничено различными воплощениями, представленными в данном описании.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, что и обычно понимаемые любым специалистом в области, к которой относится данное изобретение. В случае конфликта, настоящий документ, включая определения, будет господствующим. В следующих источниках специалистам в данной области предлагается общее определение множества терминов, используемых в изобретении: Singleton et al.. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1993); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., Cambridge University Press. 1990); The Glossary of Genetics, 5th ed., R. Rieger et al. (eds.). Springer Verlag (1991); and Hale & Margham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).

В общем, номенклатуры и методы, использованные в отношении клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии и белковой и олиго- или полинуклеотидной химии и гибридизации, описанные в данном документе, являются теми, которые хорошо известны и широко используются в данной области. Стандартные методы используются для рекомбинантных ДНК, синтеза олигонуклеотидов, тканевой культуры и трансформации (например, электропорации, липофекции). Ферментативные реакции и методы очистки осуществляются согласно описаниям производителя или так, как они обычно осуществляются в данной области, или так, как они описаны в данном документе. На практике в настоящем изобретении будут использоваться, если конкретно не указано иное, обычные подходы вирусологии, иммунологии, микробиологии, молекулярной биологии и методов рекомбинантных ДНК в данной области техники, многие из которых описаны ниже в иллюстративных целях. Такие методы в полной мере описаны в литературе. См., например, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

Термины «подтип гриппа А» или «подтип вируса гриппа А» используются взаимозаменяемо и относятся к вариантам вируса гриппа А, который характеризуется белком вирусной поверхности гемагглютинином (Н) и поэтому обозначается Н с числом, таким как, например, H1, H2 и Н3. Кроме того, подтипы могут быть дополнительно охарактеризованы по белку вирусной поверхности нейраминидазе (N), указываемой как N с числом, таким как, например, N1 и N2. По этой причине подтип может быть указан по обоим Н и N числам, таким как, например, H1N1, H5N1 и H5N2. Термины, в частности, включают все штаммы (включая исчезнувшие штаммы) в пределах каждого подтипа, которые, как правило, являются результатом мутаций и демонстрируют различные патогенные профили. Такие штаммы также будут указаны как различные «изоляты» вирусного подтипа, включая все изоляты прошлого, настоящего и будущего.

Соответственно, в данном контексте, термины «штамм» и «изолят» используются взаимозаменяемо. Подтипы содержат антигены, основанные на вирусе гриппа А. Антигены могут быть основаны на белке вирусной поверхности гемагглютинине и могут быть обозначены как «НА-антиген». В некоторых случаях такие антигены основаны на белке того или иного подтипа, такого как, например, H1 подтип и Н5 подтип, которые могут быть обозначены как H1-антиген и Н5-антиген соответственно.

При использовании в настоящем описании, термин «дегликозилированный» или «частично гликозилированный» белок служит для обозначения белка, у которого один или большее количество сахаров удалено из гликановой структуры полностью гликозилированного образца белка и который по существу сохраняет свою естественную конформацию/фолдинг. «Дегликозилированный» белок включает частично гликозилированный белок, в котором процесс дегликозилирования оставляет один или несколько участков гликозилирования, присутствующих на гликопротеине, в состоянии моногликозилирования, дигликозилирования или тригликозилирования.

«Частично гликозилированный» белок включает «дегликозилированный» белок, в котором один или большее количество сахаров сохраняется в каждом участке гликозилирования и каждый частичный участок гликозилирования содержит меньшую гликановую структуру (содержащую меньшее количество сахарных единиц) по сравнению с участком в полностью гликозилированном образце гликопротеина, а частично гликозилированный белок по существу сохраняет свою естественную конформацию/фолдинг. «Частично гликозилированный» белок образуется частичным дегликозилированием гликановой структуры, по меньшей мере, одного участка гликозилирования полностью гликозилированного образца гликопротеина. «Частично гликозилированный» белок также образуется введением гликозилирования в негликозилированный участок белка, так, чтобы добавленная последовательность гликозилирования была меньше, чем гликановая структура в этом участке в полностью гликозилированном образце гликопротеина. «Частично гликозилированный» белок также образуется синтезом вирусной гликопротеиновой последовательности, или ее фрагмента, введением единиц гликозилированных аминокислот (например, составляющих GlcNAc-Аргинин) в участки гликозилирования последовательности, так, чтобы добавленная гликановая структура была меньше, чем гликановая структура в данном участке в полностью гликозилированном образце гликопротеина.

Вирусная трансмиссия начинается с критически важного взаимодействия между гликопротеином гемагглютинином (НА), который находится на вирусной оболочке гриппа, и содержащими сиаловую кислоту (SA) гликанами, которые находятся на поверхности клетки-хозяина. Для выяснения роли гликозилирования НА в этом важном взаимодействии, были получены различные заданные гликоформы НА и с помощью синтетического SA-микроэррея были исследованы их аффинность связывания и специфичность. Укорочение структур N-гликанов на НА увеличивает аффинности связывания SA, при этом уменьшая специфичности по отношению к другим SA-лигандам. Вклад каждого из моносахаридов и сульфатных групп в структуре SA-лиганда в энергию связывания с НА был количественно проанализирован. Было установлено, что сульфатная группа добавляет приблизительно в 100 раз (2,04 ккал/моль) в энергию связывания с полностью гликозилированным НА, также как биантенальный гликан в моногликозилированной гликоформе НА. Антитела против НА-белка, несущего только одиночный, повторно присоединенный GlcNAc в каждом участке гликозилирования, демонстрируют повышенную аффинность связывания и активность нейтрализации против подтипов гриппа, чем антитела против полностью гликозилированного НА. Таким образом, удаление структурно несущественных гликанов на гликопротеинах вирусной поверхности является весьма эффективным и общим подходом для вакцинного дизайна против гриппа и других человеческих вирусов.

Гликозилирование полипептидов, как правило, является N-связанным или O-связанным. N-связанное относится к прикреплению углеводной составляющей к боковой цепи остатка аспарагина. «Секвой» является последовательностью трех последовательных аминокислот в белке, которые могут выполнять функцию участка прикрепления для полисахарида (сахара), называемого N-связанным гликаном. Это полисахарид, который связан с белком через атом азота в боковой цепи аспарагина (Asn). Секвон является либо Asn-X_aa-Ser, либо Asn-X_aa-Thr, где Х_аа является любой аминокислотой за исключением пролина. Таким образом, наличие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный участок гликозилирования. O-связанное гликозилирование относится к прикреплению одного из сахаров из числа N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также могут быть использованы 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин. Хотя секвон Asn-X-Ser/Thr абсолютно необходим для прикрепления N-связанных олигосахаридов к гликопротеину (Marshall RD, Biochemical Society Symposia 40, 17-26 1974), его присутствие не обязательно приводит к гликозилированию и некоторые секвоны в гликопротеинах могут оставаться негликозилированными (Curling ЕМ, et al., BiochemicalJoumal 272, 333-337 1990).

Одним аспектом настоящего изобретения является способ получения ненативных гликопротеинов, имеющих упрощенные углеводные структуры.

Соответственно, способ применим к ретровирусам, таким как HIV, флавивирусам, таким как вирусы гепатита С, Денге и Западного Нила, и т.п.

Примерно половина молекулярной массы gp120, рецептор-связывающего оболочечного белка вируса иммунодефицита человека (HIV), приходится на N-связанные гликаны. Почти половина этих гликанов является гликанами с высоким содержанием маннозы. Эти гликаны с высоким содержанием маннозы образуют густой лес остатков маннозы на поверхности вируса, делая HIV основной мишенью для взаимодействия с маннозо-специфичными пектинами иммунной системы.

Гликопротеины оболочки вируса гепатита С (HCV) являются сильно гликозилированными, в общем с 4 и 11 N-связанными гликанами на Е1 и Е2 соответственно. Несколько гликанов играют важную роль в сборке и/или инфекционности HCVcc. По меньшей мере, пять гликанов на Е2 (обозначенные как E2N1, E2N2, E2N4, E2N6, и E2N11) сильно снижают чувствительность HCV к нейтрализации антителами (Helle F et al, J Virol. 2010 Nov; 84(22):11905-15).

Е-белок большинства флавивирусов модифицированы Asn-связанным гликозилированием в остатках 153/154, а в случае четырех серотипов вируса Денге вторым гликаном в остатке 67. В вирусе Денге N-связанные гликаны на Е-белке являются смесью гликанов с высоким содержанием маннозы и комплексных гликанов. Белок оболочки (Е) вируса Западного Нила содержит одиночный участок N-связанного гликозилирования в участке 154. Так как удаление гликанов на этих участках заметно уменьшает, но не устраняет, инфекционность, вакцины, направленные на консервативные участки, когда они представлены с упрощенным гликозилированием, могут привести к эффективной терапии, которая менее чувствительна к мутационным вариациям вируса.

Ингибиторы гликозидазы

Гликозидгидролазы (также называемые гликозидазы или гликозилгидролазы) катализируют гидролиз гликозидной связи для высвобождения более мелких сахаров. Они являются распространенными ферментами с определенными ролями в природе, включающими деградацию биомассы, такими как целлюлоза и гемицеллюлоза, в противобактериальных защитных стратегиях (например, в лизоцимах), в механизмах патогененза (например, вирусные нейраминидазы) и в нормальной клеточной функции (например, обрезающие маннозидазы вовлечены в биосинтез N-связанных гликопротеинов). Вместе с гликозилтрансферазами, гликозидазы образуют основную часть каталитического механизма для синтеза и разрушения гликозидных связей.

Ингибиторы гликозилирования предполагаются для применения согласно способам изобретения. Примеры таких ингибиторов включают кинефузин, австралин, кастаноспермин, деоксиноджиримицин, деоксиманноджиримицин, свайнсонин, манностатин А и т.п.

Австралин - алкалоид, полигидрокислированный пирролизидин, который является хорошим ингибитором альфа-глюкозидазы амилоглюкозидазы (50% ингибирование при 5,8 микроМ), но не ингибирует бета-глюкозидазу, альфа- или бета-маннозидазу, или альфа- или бета-галактозидазу. Кастаноспермин является индолизиновым алкалоидом, который ингибирует активности альфа-глюкозидазы и изменяет распределение гликогена. Кастаноспермин ингибирует инфекцию вирусом Денге (Whitby et al., J Virol. 2005 July; 79(14): 8698-8706).

Биосинтез различных типов N-связанных олигосахаридных структур включает две серии реакций: 1) образование липид-связанного сахаридного предшественника, Glc₃Man₉(GlcNAc)2-пирофосфорил-долихола, пошаговым добавлением GlcNAc, маннозы и глюкозы к долихол-Р; и 2) удаление глюкозы и маннозы мембраносвязанными гликозидазами и добавление GlcNAc, галактозы, сиаловой кислоты и фукозы, локализованными в аппарате Гольджи гликозилтрансферазами для получения различных сложных полисахаридных структур.

Применение ингибиторов, которые блокируют реакции модификации на различных стадиях, служит причиной для того, чтобы клетка вырабатывала гликопротеины с измененными углеводными структурами. Было идентифицировано несколько алколоид-подобных соединений, которые являются специфическими ингибиторами глюкозидаз и маннозидаз, участвующих в процессировании гликопротеинов. Эти соединения вызывают образование гликопротеинов с глюкозосодержащими структурами с высоким содержанием маннозы, или различных цепей с высоким содержанием маннозы или гибридных цепей, в зависимости от участка ингибирования. (Elbein AD FASEB J. 1991 Dec; 5(15):3055-3063).

Первые четыре фермента, которые участвуют в процессировании N-связанных гликопротеинов, являются гликозидазами. GlcNAc-фосфотрансфераза катализирует первую стадию синтеза маннозо-6-фосфатного детерминанта. Подходящая углеводная структура сильно облегчает эффективное фосфорилирование GlcNAc-фосфотрансферазой. Углеводная структура вместе с фосфорилированием, необходимым для синтеза маннозо-6-фосфатного сигнала на GAA молекуле, является N-гликаном с высоким содержанием маннозы.

Известно несколько ингибиторов работы маннозидаз. Свайнсонин, выделенный из астрагала, был продемонстрирован как мощный ингибитор маннозидазы II из аппарата Гольджи, но не оказывал воздействие на маннозидазу I (James, L.F., Elbein, A.D., Molyneux, R.J., and Warren, C.D. (1989) Swainsonine and related glycosidase inhibitors. Iowa State Press, Ames, Iowa). Деоксиманноджиримицин является довольно мощным ингибитором маннозидазы I из печени крысы. В интактных клетках Деоксиманноджиримицин блокирует синтез N-связанных олигосахаридов комплексных типов и вызывает накопление гликопротеинов, имеющих структуры Man_7-9(GlcNAc)₂, с преобладанием Man₉(GlcNAc)₂-олигосахаридов (Elbein, A.D., et al. (1984) Arch. Biochem. Biophys. 235,579-588).

Манностатин А является метаболитом, продуцируемым микроорганизмом, Streptoverticillium verticillus, и о данном соединении сообщалось как о мощном ингибиторе крысиной эпидидимальной α-маннозидазы. (Aoyagi, Т., et al. (1989) J. Antibiot. 42, 883-889).

Кифунензин (Kif) впервые был выделен из актиномицета, Kitasatosporia kifunense No. 9482 (M. Iwami, О. et al. J. Antibiot., 40, 612, 1987) и является циклическим оксамидным производным 1-амино-манноджиримицина. Кифунензин ингибирует фермент аппарата Гольджи животных, маннозидазу I. Если кифунензин добавлен к культивируемым клеткам млекопитающих в концентрациях 1 мкг/мл и выше, то он вызывает полное переключение структуры N-связанных олигосахаридов от комплексных цепей к Man₉(GlcNAc)₂-структурам, из-за ингибирования им маннозидазы I. С другой стороны, Деоксиманноджиримицин, даже при 50 мкг/мл не предотвращает образование всех комплексных цепей (Elbein, A.D., et al. (1990) Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I.J Biol. Chem. 265, 15599-15605). Таким образом, кифунензин является одним из наиболее эффективных ингибиторов обработки гликопротеинов.

Кифунензин также продемонстрировал многообещающую иммуномодулирующую активность при ингибировании α-маннозидазы. О синтезе кифунензина сообщили как «Fujisawa Pharmaceutical Co.» (H. Kayakiri, et al, Tetrahedron Lett., 31, 225, 1990; H. Kayakiri, et al., Chem. Pharm. Bull., 39, 1392, 1991), так и Hudlicky et al. (J. Rouden and T. Hudlicky, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1095, 1993; J. Rouden, T. et al., J. Am. Chem. Soc, 116,5099, 1994).

Обработка клеток кифунензином (Kif) приводит к ингибированию процессирования гликопротеинов в этих клетках (Elbein et al (1991) FASEB J(5):3055-3063; и Bischoff et al (1990) J. Biol. Chem. 265(26): 15599-15605). Kif блокирует прикрепление комплексных сахаров к модифицированным белкам. Однако если достаточное количество Kif используется для полного ингибирования процессирования гликопротеинов на лизосомальных гидролазах, то полученные гидролазы имеют структуры с маннозой-9, которые не являются наиболее эффективными субстратами для фермента GlcNAc-фосфотрансферазы.

Согласно изобретению, ингибитор гликозидазы, такой как Kif, добавляют к клеткам в количестве, по меньшей мере, от 0,01 мкг/мл до около, по меньшей мере, 500 иг/мл, включая 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,25, 9,5, 9,75 и все значения среди представленных.

Кифунензин ингибирует функцию фермента α-маннозидазы I в пути N-гликозилирования и приводит к образованию гликопротеинов с Man₉GlcNAc₂-композициями.

Уровни и/или типы сложных углеводных структур могут быть измерены с помощью известных способов. Например, гликопротеины и ассоциированные с ними олигосахариды могут быть охарактеризованы с помощью эндогликозидаз для различения между олигосахаридами с высоким содержанием маннозы и олигосахаридами комплексного типа (Maley et al (1989) Anal. Biochem. 180:195-204). Пептид-N₄-(N-ацетил-1-β-глюкозаминил)аспарагин амидаза (PNGaзa F) способна гидролизовать аспарагин-связанные (N-связанные) олигосахариды в В-аспартилглюкозаминовой связи с получением аммиака, аспарагиновой кислоты и олигосахарида с интактной ди-N-ацетилхитобиозой на восстанавливающем конце. Специфичность PNGaзы является широкой из-за того, что ее субстратами являются олигосахариды с высоким содержанием маннозы, гибриды, ди-, три- и тетраантенные комплексные, сульфатированные олигосахариды и олигосахариды с полисиаловой кислотой. Кроме того, эндо-β-N-ацетилглюкозаминидаза H (EndoH) эффективно гидролизует единицу хитобиозы в гибрид- и маннозосодержащие N-связанные олигосахариды, имеющие три остатка маннозы, при условии что плечо α-1,6-маннозы имеет другую прикрепленную маннозу. Комплексные олигосахариды устойчивы к расщеплению EndoH.

Для описания типа N-связанных олигосахаридов присутствующих в гликопротеинах, аликвота белка может быть расщеплена PNGasou F (0,5% ДСН, 1% β-меркаптоэтанол, 50 мМ NP-40, 50 мМ фосфат натрия, рН 7,5) или EndoH (0.5% ДСН, 1% β-меркаптоэтанол, 50 мМ цитрат натрия, рН 5,5) в восстанавливающих условиях. Нативные и расщепленные белки затем анализировали электрофорезом в ДСН-полиакриламиде в восстанавливающих условиях и сравнивали относительные подвижности. Если гликопротеин содержит только олигосахариды с высоким содержанием маннозы, то обработанные РМGазой F и EndoH образцы будут иметь повышенную подвижность, по сравнению с необработанным образцом. Обработанный EndoH белок будет иметь значимо более высокую молекулярную массу из-за наличия одиночного N-ацетилглюкозамина в каждом участке N-связанного гликозилирования. Если гликопротеин содержит только комлексные олигосахариды, то обработанный EndoH белок не будет иметь смещения миграции по сравнению с необработанным белком. Если присутствуют как комплексные олигосахариды, так и олигосахариды с высоким содержанием маннозы, то обработанный EndoH белок будет меньше, чем необработанный гликопротеин, но больше, чем белок, обработанный PNGазoй F. Различие будет тем больше, чем больше будет насчитываться оставшихся N-ацетилглюкозаминов.

Для получения упрощенных гликанов на гликопротеинах-мишенях использовали эндогликозидазы. Эндогликозидаза является ферментом, который высвобождает олигосахариды из гликопротеинов или гликолипидов. Или этот фермент всего лишь расщепляет полисахаридные цепи между остатками, которые не являются конечными остатками, хотя высвобождение олигосахаридов из конъюгированного белка и липидных молекул является более распространенным. Фермент разрушает гликозидные связи между двумя сахарными мономерами в полимере. Примеры эндогликозидаз включают, без ограничения перечисленным, эндоглюкозидазу D, эндоглюкозидазу F, эндоглюкозидазу F1, эндоглюкозидазу F2, эндоглюкозидазу Н и эндоглюкозидазу S.

Получение моногликозилированного вируса гриппа

Для получения белков с гликопротеинами с высоким содержанием маннозы, клетки, несущие вирус гриппа, экспонировали Kif (и/или DMJ) для ингибирования процессирования гликопептидов. Для получения моногликозилированного вируса гриппа, вирус инъецировали в аллантоисную полость беспатогенных куриных яиц с зародышем вместе с ингибиторами маннозидаз, такими как кифунензин.

Кифунензин ингибирует функцию фермента α-маннозидазы I в пути N-гликозилирования и приводит к появлению гликопротеинов с Man₉(GlcNAc)₂-композициями. Концентрация кифунензина при ингибировании гликозилирования гемагглютинина находится в диапазоне от 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 500 мкг/мл до вплоть до 500 мкг/мл, включая все значения между представленными.

После около 1-3 дней инкубации, обработанную кифунензином алантоисную жидкость собирали и расщепляли эндогликозидазой (Endo H) для удаления гликанов с высоким содержанием маннозы, т.е. концентраций способных конвертировать из Man₉(GlcNAc)₂ в одиночный GlcNAc. Концентрация Endo H в алантоисной жидкости для получения моногликозилированного гемагглютинина находится в диапазоне, по меньшей мере, около 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 500 или больше мкг/мл алантоисной жидкости.

Затем моногликозилированный вирус извлекали и очищали.

Применение моногликозилированного вируса гриппа

Описанные в данном документе антигены моногликозилированного вируса гриппа могут быть использованы для иммунизации против инфекции вирусом гриппа. Конкретный вирус, из которого получают антигены, может быть таким же или отличным от конкретного вируса, против которого обеспечивается защита, из-за того, что перекрестная защита от различных изолятов, как известно, имеет место с вирусами гриппа, особенно в пределах одних и тех же вирусных подтипов.

Вакцины против гриппа, используемые в настоящее время, обозначаются как вакцина с цельным вирусом (whole virus, WV) или вакцина с субвирионом (subvirion, SV) (также называемым «расщепленным вирионом» или «очищенным поверхностным антигеном»). WV-вакцина содержит интакнтый, инактивированный вирус, тогда как SV-вакцина содержит очищенный вирус, разрушенный детергентами, которые солюбилизируют липидсодержащую вирусную оболочку, с последующей химической инактивацией остаточного вируса. Ослабленные вирусные вакцины против гриппа также находятся в разработке. Обсуждение способов получения обычной вакцины можно найти в Wright, P.F. & Webster, R. G., FIELDS VIROLOGY, 4d Ed. Обсуждение способов получения обычной вакцины можно найти в Wright, Р.F. & Webster, R.G., FIELDS VIROLOGY, 4d Ed. (Knipe, D.M. et al. Ed.), 1464-65 (2001),

Если вакцина включает более одного штамма гриппа, то различные штаммы, как правило, выращивают отдельно и смешивают после сбора вирусов и получения антигенов. В ином случае, различные сегменты различных изолятов вируса гриппа могут быть объединены для получения мультипотентной вакцины. Вирус(ы) гриппа, используемые в процессах изобретения, могут быть реассортантными штаммами, и/или могут быть получены методами обратной генетики. Вирус(ы) могут быть ослабленными. Вирус(ы) могут быть температурочувствительными. Вирус(ы) могут быть холодоадаптированными.

Может быть использован реассортантный штамм, включающий вирусные сегменты НА и/или NA из патогенного штамма, а оставшиеся шесть или семь сегментов из непатогенного штамма.

Антиген вируса гриппа, используемый в иммуногенной композиции по изобретению, может быть в форме живого вируса или, предпочтительно, в виде инактивированного вируса. Инактивация вируса, как правило, включает обработку химическим агентом, таким как формалин или β-пропиолактон. Если используется инактивированный вирус, то антиген может быть целым вирусом, расщепленным вирусом или вирусными субъединицами. Расщепленные вирусы получают обработкой вирионов детергентами (например, этиловым эфиром, полисорбатом 80, деоксихолатом, три-N-бутил фосфатом. Тритоном Х-100, Тритоном N101, цетилтриметиламмония бромидом и т.п.) для получения препаратов субвирионов. Субъединичные вакцины содержат один или оба поверхностных антигена гриппа, гемагглютинин и нейраминидазу. Антигены гриппа также могут быть представлены в виде виросом.

Если антиген получен из вируса гриппа (т.е. он не произведен в рекомбинантной или синтетической системе, которые не включают рост вирусов гриппа), вирус может быть выращен либо в яйцах, либо в клеточной культуре. Выращивание в специальных беспатогенных яйцах с зародышем является традиционным путем, с помощью которого вирусы гриппа выращивают для получения вакцины, а клеточная культура является более недавней разработкой. Если используется клеточная культура, то вакцину против вируса гриппа, как правило, выращивают в клетках млекопитающих, таких как клетки MDCK, Vero или PER. C6. Эти клеточные линии общедоступны, например, в Американской коллекции типовых культур (АТСС) или в «Coriell Cell Repositories» (Камден, Нью-Джерси). Например, АТСС предоставляет различные клетки Vero под каталожными номерами CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 и CRL-1587, а клетки MDCK - под каталожным номером CCL-34. Также возможно выращивание в птичьих клеточных линиях, включая клеточные линии, полученные из кур, например куриные эмбриональные фибробласты (CEF).

Аналогичным образом, вирус (такой как HIV, HCV, вирус Денге, вирус гриппа, флавивирус и т.п.) может быть выращен в клеточной культуре в присутствии одного или большего количества ингибиторов глюкозидаз (таких как кинефузин, австралин, кастаноспермин, деоксиноджиримицин, деоксиманноджиримицин, свайнсонин, манностатин А, и т.п.). Системы клеточных культур для выращивания этих вирусов хорошо известны в данной области. Вирус Западного Нила может быть выращен в тканевой культуре эпителиальных клеток почки обезьяны или куриных эмбриональных клеток. HIV можно культивировать в культуре мононуклеаров периферической крови (РВМС). HCV можно выращивать в клетках, полученных из клеточной линии гепатомы человека Huh-7.

Иммуногенные и лекарственные композиции изобретения также подходят для введения пациенту. Введение может быть осуществлено различными путями, включая, без ограничения перечисленным: интрадермальную инъекцию; трансдермальное введение; и местное введение. Они могут быть использованы вместе с обработкой кожи абразивом, например с помощью наждачной бумаги или путем применения микроабразивов.

Иммуногенные и лекарственные композиции изобретения предпочтительно представлены в виде вакцин.

Композиции изобретения могут включать адъювант. Адъюванты, которые используются в вакцинах против гриппа, включают соли алюминия, хитозан, CpG-олигонуклеотиды, такие как CpG 7909, эмульсии масло-в-воде, такие как MF59, эмульсии вода-в-масле-в-воде, термолабильный токсин E. coli, и его детоксифицированные мутанты, монофосфорил липид А, и его 3-0-деацетилированное производное, мутанты коклюшного токсина, мурамил дипептиды и т.п.

ПРИМЕРЫ

Без намерения ограничить объем данного изобретения, ниже представлены примерные инструменты, устройство, способы и связанные с ними результаты согласно воплощениям настоящего изобретения. Следует отметить, что для удобства читателя в примерах могут быть использованы заголовки или подзаголовки, которые никоим образом не должны ограничивать объем данного изобретения. Более того, в данном документе предлагаются и описываются некоторые теории; однако они никоим образом, вне зависимости от того, правильны они или нет, не должны ограничивать изобретение, поскольку данное изобретение осуществляется практически согласно изобретению без относительно какой-либо определенной теории или схемы действия.

ПРИМЕР 1. Получение полностью гликозилированных и моногликозилированных вирусов

Вирус гриппа A, NIBRG-14 (H5N1) (Nicolson С, et al. (2005) Vaccine 23(22):2943-2952), инъецировали (1000 TCID50 (50%-я инфекционная доза в тканевой культуре) в 200 мкл PBS) в аллантоисную полость 10 дневных свободных от особых патогенов (SFP) куриных яиц с эмбрионом для получения обыкновенного полностью гликозилированного вируса (WHO (2005) WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. (Всемирная организация здравоохранения, Женева)).

Для получения моногликозилированного вируса, вирус инъецировали в аллантоисную полость с 0,2 мг/мл кифунензина («Cayman Chemical»). Кифунензин ингибирует функцию фермента α-маннозидазы I в пути N-гликозилирования и в результате приводит к появлению гликопротеинов с Man₉GlcNAc₂-композициями (Elbein AD, et al. (1990) J Biol Chem 265(26): 15599-15605).

Анализировали зависимость ингибирования гликозилирования гемагглютинина от концентрации кифунензина (фиг. 1А). Через 3 дня инкубации, алантоисную жидкость собирали и центрифугировали для удаления дебриса в течение 10 мин при 3000 g. Обработанную кифунензином алантоисную жидкость затем расщепляли эндогликозидазой Endo H (20 мкг на мл алантноисной жидкости) в течение 12 часов при 4°С для удаления гликанов с высоким содержанием маннозы, т.е. от Man₉GlcNAc₂ до одиночного GlcNAc. Анализировали зависимость выработки моногликозилированного гемагглютинина от концентрации Endo Н в алантоисной жидкости (фиг. 1В).

Затем моногликозилированный вирус осаждали ультрацентрифугированием в течение 90 мин при 46000 g, ресуспендировали в PBS и очищали в прерывистом градиенте плотности сахарозы (25%, 40%) в течение 90 мин при 27000 g. Вирус в градиенте собирали и осаждали ультрацентрифугированием в течение 90 мин при 120000 g. Наконец, осадок ресуспендировали в PBS и фильтровали через 0,22 мкм фильтр (CDC (1982) Concepts and Procedures for Laboratory-based Influenza Surveillance (U.S. Dept. of Health and Human Services., Washington, DC); Harvey R, et al. (2008) Vaccine 26(1):6550-6554). По сравнению с очищенным полностью гликозилированным вирусом, очищенный моногликозилированный вирус имел очевидные смещения как по НА1, так и по НА2 (фиг. 1C).

ПРИМЕР 2. Анализ полностью и моногликозилированного вирусов с помощью электронной микроскопии

Вирусный раствор помещали на покрытую коллодием-углеродом поверхность медной решетки («Electron Microscopy Sciences»). Избыток жидкости удаляли фильтровальной бумагой и для окрашивания добавляли в течение 30 секунд 2%-й метиламин вольфрамат («Ted Pella, Inc.»). Избыточную жидкость удаляли фильтровальной бумагой и промывали Н₂О в течение 30 секунд. Затем решетку высушивали на воздухе в течение 4 часов и вирусные частицы фотографировали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии («Hitachi H-7000»). Полностью гликозилированный и моногликозилированный вирусы гриппа NIBRG-14 похожи по размеру и морфологии (фиг. 2).

ПРИМЕР 3. Количественная оценка гемагглютинина в вирусе

Вирус смешивали с денатурирующим буфером (5% ДСП и 10% β-меркаптоэтанол) и кипятили в течение 10 минут, затем в образец добавляли 10%-й NP-40 и обрабатывали PNGasou F («New England Biolabs») при 25°С в течение ночи. Образец смешивали с буфером для образцов ДСН-ПААГ и нагревали при 95°С в течение 10 минут перед загрузкой в гель. Гель окрашивали «SYPRO RUBY®» («Invitrogen») и анализировали с помощью системы визуализации «VERSA DOC®» («Bio-rad»). Обработку РМGазой F перед анализом ДСН-ПААГ проводили для отделения НА1 от NP-белка в образце полностью гликозилированного вируса. Это позволяет провести сравнение прямой интенсивности белков НА1 как в полностью гликозилированном, так и в моногликозилированном вирусах на ДСН-ПААГ для количественной оценки гемагглютинина в данном вирусе (фиг. 3).

ПРИМЕР 4. Анализ гликопептидов с помощью LC-MS-MS

Масс-спектрометрию использовали для анализа композиции гликанов моногликозилированного вируса. Вирусный раствор смешивали с невосстанавливающим буфером для образцов и нагревали до 95°С в течение 10 минут перед загрузкой в гель. Гель окрашивали кумасси синим. Полосу НАО вырезали малым куском для расщепления трипсином в геле. После расщепления образец анализировали с помощью LC-MS-MS (Wu Y, et al. (2010) Rapid Commun Mass Spectrom 24(7):965-972) («Agilent Technologies», «Thermo Scientific»), В вирусе гриппа NIBRG-14 существует шесть участков N-гликозилирования. За исключением малого процента присутствия гликанов с высоким содержанием маннозы в остатке 295 (~10% Man₆(GlcNAc)₂) и остатке 489 (~10% Man_7-9(GlcNAc)₂), все другие гликаны являются моногликозилированными с прикрепленным одиночным сахарным остатком GlcNAc (фиг. 4).

Все публикации и патентные заявки, процитированные в данном описании, включены в данный документ ссылкой так, как если бы каждая индивидуальная публикация или патентная заявка были специально и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки.

Хотя вышепредставленное изобретение было описано с некоторыми подробностями посредством иллюстраций и примеров для ясности и понимания, специалистам в данном области будет совершенно ясно в свете изложения изобретения, что некоторые изменения и модификации могут быть сделаны без отхода от смысла и сущности прилагаемой формулы изобретения.

Реферат

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения вируса гриппа с моногликозилированным гемагглютинин-антигеном (НА-антиген). Способ включает наращивание вируса гриппа, содержащего гемагглютинин-антиген, в специфическом беспатогенном (SPF) курином яйце с эмбрионом с эффективным количеством ингибитора маннозидазы, концентрация которого достаточна для ингибирования α-маннозидазы I в пути N-гликозилирования с последующим выделением полученного вируса гриппа. Дальнейший контакт выделенного вируса гриппа с эндогликозидазой (EndoH) приводит к получению вируса гриппа, имеющего моногликозилированный НА-антиген вируса гриппа. Предложенный способ позволяет получить вирус гриппа с моногликозилированным гемагглютинин-антигеном (НА-антиген), с высоким выходом с использованием специфических беспатогенных (SPF) куриных яиц с эмбрионом, и может быть использован для получения моногликозилированного гемагглютинин-антигена при производстве вакцин. 18 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Формула