Кольцевая молекула днк, характеризующаяся зависимой от условий точкой начала репликации, способ их получения и их применение в генной терапии - RU2005114367A

Реферат

1. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина, содержащая гетерологичный белок инициации репликации, который активирует зависимую от условий точку начала репликации, и внехромосомную молекулу ДНК, содержащую гетерологичный терапевтический ген и зависимую от условий точку начала репликации, функциональность которой в прокариотической рекомбинантной клетке хозяина требует белка инициации репликации, который является чужеродным для клетки хозяина.

2. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.1, в которой зависимая от условий точка начала репликации происходит из бактериальной плазмиды или бактериофага.

3. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.2, в которой зависимая от условий точка начала репликации происходит из R2K, R6K, R1, pSC101, Rts1, F, RSF1010, P1, P4, лямбда, фи-82 или фи-80.

4. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.3, в которой зависимая от условий точка начала репликации происходит из бактериальной плазмиды R6K.

5. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.4, где клетка хозяина дополнительно содержит ген, включающий в себя амбер-мутацию.

6. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.1, где указанный гетерологичный белок инициации репликации кодируется геном pir116.

7. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.6, где указанная клетка хозяина дефицитна по гену endA.

8. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.7, где указанная клетка хозяина дефицитна по гену traD.

9. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.8, где указанная клетка хозяина представляет собой TEX1.

10. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.9, где указанная клетка хозяина дополнительно содержит мутантный ген recA.

11. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.10, где указанный гетерологичный белок инициации репликации кодируется pir116 pir42.

12. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.11, где указанный гетерологичный белок инициации репликации кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 21.

13. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.11, где указанная клетка хозяина представляет собой TEX2pir42.

14. Способ продуцирования плазмиды, содержащей гетерологичный терапевтический ген и зависимую от условий точку начала репликации, функциональность которой в прокариотической клетке хозяина требует белка инициации репликации, чужеродного для клетки хозяина, подразумевающий

a) культивирование TEX2pir42, содержащей подлежащую продукции плазмиду; и

b) выделение плазмиды.

15. Способ по п.14, где точка начала репликации содержит SEQ ID NO: 1.

16. Способ по п.15, где плазмида дополнительно содержит ген селекции, который не обеспечивает устойчивость к антибиотику.

17. Способ по п.16, где ген отбора кодирует супрессорную транспортную РНК для конкретных кодонов.

18. Способ по п.17, где ген селекции представляет собой супрессор транспортной РНК амбер-кодона, а клетка хозяина дополнительно содержит ген, включающий в себя амбер-мутацию.

19. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина, содержащая гетерологичный ген pir, кодирующий белок pi, и внехромосомную молекулу ДНК, содержащую гетерологичный терапевтический ген и зависимую от условий точку начала репликации, функциональность которой в прокариотической рекомбинантной клетке хозяина требует присутствия белка pi.

20. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.19, в которой гетерологичный ген pir содержит по меньшей мере одну мутацию.

21. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.20, в которой одна или несколько мутаций присутствуют в одной и той же или различных областях, кодирующих ген pir, кодирующих область контроля копийности и/или связывающую ДНК область и/или мотив, подобный лейциновой застежке, или другие области белка П.

22. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.20, в которой гетерологичный ген pir включает в себя мутации в области контроля копийности и в мотиве, подобном лейциновой застежке.

23. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.22, дополнительно содержащая мутацию в связывающей ДНК области гена pir.

24. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.20, в которой гетерологичный ген pir содержит мутации в области контроля копийности и в связывающей ДНК области.

25. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.20, в которой гетерологичный ген pir содержит мутации в связывающей ДНК области и мотиве, подобном лейциновой застежке.

26. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.19, в которой гетерологичный ген pir находится в плазмиде.

27. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.19, в которой гетерологичный ген pir находится в геноме клетки хозяина.

28. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.20, где указанная клетка хозяина дефицитна по гену endA.

29. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.20, где указанная клетка хозяина дефицитна по гену traD.

30. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.20, где указанная клетка хозяина дополнительно содержит мутантный ген recA.

31. Способ продуцирования плазмиды, содержащей гетерологичный терапевтический ген и зависимую от условий точку начала репликации, функциональность которой в прокариотической клетке хозяина требует присутствия белка инициации репликации, чужеродного для клетки хозяина, подразумевающий

(a) культивирование прокариотической рекомбинантной клетки хозяина по п.20 в условиях, в которых продуцируется плазмида; и

(b) выделение плазмиды.

32. Способ по п.31, в котором плазмида дополнительно содержит ген селекции, который не обеспечивает устойчивость к антибиотику.

33. Способ по п.32, где ген отбора кодирует супрессорную транспортную РНК для конкретных кодонов.

34. Способ по п.33, где ген селекции представляет собой супрессор транспортной РНК амбер-кодона, и клетка хозяина дополнительно содержит ген, содержащий амбер-мутацию.

35. Способ детекции мутации, повышающей копийность плазмиды, подразумевающий

(a) введение по меньшей мере одной мутации в последовательность-мишень;

(b) трансформацию мутантной последовательностью-мишенью клетки хозяина, содержащей плазмиду, где плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую уро-III-метилтрансферазу и где число копий плазмиды подлежит воздействию последостельности-мишени;

(c) выращивание клетки хозяина в условиях, в которых данная нуклеотидная последовательность экспрессируется с продукцией культуры клеток хозяина;

(d) воздействие на культуру клеток хозяина УФ-светом; и

(e) детекцию флуоресценции, продуцируемой культурой клеток хозяина.

36. Способ по п.35, в котором нуклеотидная последовательность представляет собой ген cobA из Pseudomonas denitrificans.

37. Способ по п.35, дополнительно включающий в себя сравнение флуоресценции, детектированной в (e), с флуоресеценцией, продуцируемой культурой клеток хозяина, содержащих немутантную последовательность-мишень.

38. Плазмида, содержащая гетерологичный ген pir, содержащий по меньшей мере одну мутацию.

39. Плазмида по п.38, в которой одна или несколько мутаций присутствуют в одной и той же или различных областях, кодирующих ген pir, кодирующий область контроля копийности и/или связывающую ДНК область и/или мотив, подобный лейциновой застежке, и/или другие области белка П.

40. Плазмида по п.38, в которой гетерологичный ген pir содержит мутации ДНК в области контроля копийности и в мотиве, подобном лейциновой застежке.

41. Плазмида по п.40, дополнительно содержащая мутацию в связывающей ДНК области гена pir.

42. Плазмида по п.38, в которой гетерологичный ген pir содержит мутации в области контроля копийности и в связывающей ДНК области.

43. Плазмида по п.38, в которой гетерологичный ген pir содержит мутации в связывающей ДНК области и мотиве, подобном лейциновой застежке.

44. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.24, в которой мутация в связывающей ДНК области представляет собой мутацию 114C.

45. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.24, в которой мутация в связывающей ДНК области представляет собой мутацию 100B.

46. Прокариотическая рекомбинантная клетка хозяина по п.24, в которой мутация в связывающей ДНК области представляет собой мутацию 201C.

47. Плазмида по п.42, в которой мутация в связывающей ДНК области представляет собой мутацию 114C.

48. Плазмида по п.42, в которой мутация в связывающей ДНК области представляет собой мутацию 100B.

49. Плазмида по п.42, в которой мутация в связывающей ДНК области представляет собой мутацию 201C.