Ортогональные белки cas9 для рнк-направляемой регуляции и редактирования генов - RU2016104161A
Код документа: RU2016104161A
Формула
1. Способ модулирования экспрессии двух или более целевых нуклеиновых кислот в клетке, включающий:
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или более РНК, комплементарные к двум или более целевым нуклеиновым кислотам,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей два или более ортогональных РНК-направляемых не обладающих нуклеазной активностью ДНК-связывающих белков, которые соответственно связываются с двумя или более целевыми нуклеиновыми кислотами и направляются двумя или более РНК,
введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей два или более транскрипционных регуляторных белка или домена,
где экспрессируются РНК, ортогональные РНК-направляемые не обладающие нуклеазной активностью ДНК-связывающие белки и транскрипционные регуляторные белки или домены,
где формируется два или более колокализованных комплекса между РНК, ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком, транскрипционным регуляторным белком или доменом и целевой нуклеиновой кислотой, и где транскрипционный регуляторный белок или домен регулируют экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, где чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок, дополнительно кодирует транскрипционный регуляторный белок или домен, слитый с ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком.
3. Способ по п. 1, где чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая две или более РНК, дополнительно кодирует мишень РНК-связывающего домена, и чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая транскрипционный регуляторный белок или домен, дополнительно кодирует РНК-связывающий домен, слитый с транскрипционным регуляторным белком или доменом.
4. Способ по п. 1, где клетка представляет собой эукариотическую клетку.
5. Способ по п. 1, где клетка представляет собой клетку дрожжей, клетку растения или клетку животного.
6. Способ по п. 1, где РНК включает от примерно 10 до примерно 500 нуклеотидов.
7. Способ по п. 1, где РНК включает от примерно 20 до примерно 100 нуклеотидов.
8. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок или домен представляет собой активатор транскрипции.
9. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок или домен увеличивает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
10. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок или домен увеличивает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или вредного для здоровья состояния.
11. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок или домен представляет собой репрессор транскрипции.
12. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок или домен снижает уровень экспрессии целевой нуклеиновой кислоты.
13. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок или домен снижает уровень экспрессии целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или вредного для здоровья состояния.
14. Способ по п. 1, где целевая нуклеиновая кислота ассоциирована с заболеванием или состоянием, причиняющим ущерб здоровью.
15. Способ по п. 1, где одна или более РНК представляет собой гидовую РНК.
16. Способ по п. 1, где одна или более РНК представляет собой слитую tracrPHK-crPHK.
17. Способ по п. 1, где ДНК представляет собой геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.
18. Способ по п. 1, где происходит активация первой целевой нуклеиновой кислоты и репрессия второй целевой нуклеиновой кислоты.
19. Способ по п. 1, где первое множество целевых нуклеиновых кислот подавляется и второе множество целевых нуклеиновых кислот подавляется.
20. Способ по п. 1, где происходит активация первых одной или более целевых нуклеиновых кислот и репрессия второй одной или более целевых нуклеиновых кислот.
21. Способ изменения одной или более целевых нуклеиновых кислот в клетке одновременно с регуляцией экспрессии одной или более целевых нуклеиновых кислот в клетке, включающий:
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или более РНК, где, по меньшей мере, одна РНК является комплементарной к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены, и, по меньшей мере, одна РНК является комплементарной к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны регулироваться,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей 1) один ортогональный РНК-направляемый белок с никазной активностью, имеющий один неактивный нуклеазный домен и направляемый одной или более РНК, комплементарными к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены, и 2) один или более ортогональных РНК-направляемых не обладающих нуклеазной активностью ДНК-связывающих белков, которые связываются с и направляются одной или более РНК, комплементарными к целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены,
введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более транскрипционные регуляторные белки или домены,
где экспрессируются РНК, ортогональный РНК-направляемый белок с никазной активностью, ортогональные РНК-направляемые не обладающие нуклеазной активностью ДНК-связывающие белки и транскрипционные регуляторные белки или домены,
где формируется, по меньшей мере, один колокализованный комплекс между РНК, ортогональным РНК-направляемым белком с никазной активностью и целевой нуклеиновой кислотой, которая должна быть изменена, и где белок с никазной активностью расщепляет одну цепь целевой нуклеиновой кислоты, которая должна быть изменена,
где формируется, по меньшей мере, один колокализованный комплекс между РНК, ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком, транскрипционным регуляторным белком или доменом и целевой нуклеиновой кислотой, которая должна регулироваться, и где транскрипционный регуляторный белок или домен регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты, которая должна регулироваться.
22. Способ изменения одной или более целевых нуклеиновых кислот в клетке одновременно с регуляцией экспрессии одной или более целевых нуклеиновых кислот в клетке, включающий:
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или более РНК, где, по меньшей мере, одна РНК является комплементарной к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены, и, по меньшей мере, одна РНК является комплементарной к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны регулироваться,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей 1) один ортогональный РНК-направляемый белок с нуклеазной активностью, который направляется одной или более РНК, комплементарными к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены, и 2) один или более ортогональные РНК-направляемые не обладающие нуклеазной активностью ДНК-связывающие белки, которые связываются с и направляются одной или более РНК, комплементарными к целевым нуклеиновым кислотам, которые должны регулироваться,
введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более транскрипционные регуляторные белки или домены,
где экспрессируются РНК, ортогональный РНК-направляемый белок с нуклеазной активностью, ортогональные РНК-направляемые не обладающие нуклеазной активностью ДНК-связывающие белки и транскрипционные регуляторные белки или домены,
где формируется, по меньшей мере, один колокализованный комплекс между РНК, ортогональным РНК-направляемым белком с нуклеазной активностью и целевой нуклеиновой кислотой, которая должна быть изменена, и где нуклеаза расщепляет целевую нуклеиновую кислоту, которая должна быть изменена,
где формируется, по меньшей мере, один колокализованный комплекс между РНК, ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком, транскрипционным регуляторным белком или доменом и целевой нуклеиновой кислотой, которая должна регулироваться, и где транскрипционный регуляторный белок или домен регулирует эекспрессию целевой нуклеиновой кислоты, которая должна регулироваться.
23. Клетка, включающая:
первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую две или более РНК, комплементарные к двум или более соответствующим целевым нуклеиновым кислотам,
вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую два или более РНК-направляемых не обладающих нуклеазной активностью ДНК-связывающие белка, и
третью чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую два или более транскрипционных регуляторных белка или домена, где каждая РНК, ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связываюший белок и транскрипционный регуляторный белок или домен являются членами колокализованного комплекса для соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.
24. Клетка по п. 23, где чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок, дополнительно кодирует транскрипционный регуляторный белок или домен, слитый с ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком.
25. Клетка по п. 23, где чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая одну или более РНК, дополнительно кодирует мишень РНК-связывающего домена и чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая транскрипционный регуляторный белок или домен, дополнительно кодирует РНК-связывающий домен, слитый с транскрипционным регуляторным белком или доменом.
26. Клетка по п. 23, где клетка представляет собой эукариотическую клетку.
27. Клетка по п. 23, где клетка представляет собой клетку дрожжей, клетку растения или клетку животного.
28. Клетка по п. 23, где РНК включает от примерно 10 до примерно 500 нуклеотидов.
29. Клетка по п. 23, где РНК включает от примерно 20 до примерно 100 нуклеотидов.
30. Клетка по п. 23, где транскрипционный регуляторный белок или домен представляет собой активатор транскрипции.
31. Клетка по п. 23, где транскрипционный регуляторный белок или домен увеличивает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
32. Клетка по п. 23, где транскрипционный регуляторный белок или домен увеличивает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или вредного для здоровья состояния.
33. Клетка по п. 23, где целевая нуклеиновая кислота ассоциирована с заболеванием или состоянием, причиняющим ущерб здоровью.
34. Клетка по п. 23, где одна или более РНК представляет собой гидовую РНК.
35. Клетка по п. 23, где одна или более РНК представляет собой слитую tracrPHK-crРНК.
36. Клетка по п. 23, где ДНК представляет собой геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.
37. Способ по п. 1, где РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок представляет собой ДНК-связывающий белок CRISPR системы типа II.
38. Способ по п. 1, где РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок представляет собой ортогональный не обладающий нуклеазной активностью белок Cas9.
39. Клетка по п. 23, где РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок представляет собой ДНК-связывающий белок CRISPR системы типа II.
40. Клетка по п. 23, где РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок представляет собой ортогональный не обладающий нуклеазной активностью белок Cas9.
