Ws-7622а ди-сульфаты или их фармацевтически приемлемые соли и фармацевтическая композиция - RU2087482C1

Чертежи

Описание

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям WS 7622A ди-сульфатам или их фармацевтически приемлемым солям, которые могут найти применение в медицине, и к фармацевтической композиции.

Предлагаемые соединения обладают способностью ингибировать действие эластазы человеческих лейкоцитов.

Авторы данного изобретения сначала получили вещество WS 7622A, которое используется в качестве исходного материала в данном изобретении, путем культивирования штамма Streptomyces resistomycificus N 7622 в питательной среде и подали заявку на данное вещество в различных странах (Европейская патентная заявка N 90104500.5). Streptomyces resistomycificus N 7622 депонирован в соответствии с Будапештским договором о международно признанных коллекциях, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, -Tsukubashi, Ibaraki-ken, 305, Япония) под регистрационным номером FERM BP-2306 (дата депонирования 23 февраля 1989).

Однако вещество WS 7622A нерастворимо в воде, поэтому авторы изобретения изучили возможность улучшения растворимости в воде вещества WS 7622A, достигли успеха в этом с помощью получения сульфатов вещества WS 7622A.

WS 7622A моно- или ди-сульфат и их фармацевтически приемлемые соли изобретения можно получить сульфатированием вещества WS 7622A или его соли.

Исходное соединение, вещество WS 7622A, является новым соединением и обладает следующими физико-химическими свойствами:
внешний вид: бесцветные призмы;
природа вещества: кислотная;
цветная реакция: положительная сульфат церия, пары иода
отрицательная нингидрин,
растворимость: растворимо -метанол, этанол, н-бутанол, умеренно растворимо хлороформ, ацетон, этилацетат, нерастворимо вода, н-гексан.

Тонкослойная хроматография (ТСХ):
хлороформ метанол (5 1 по объему) Pf 0,51
ацетон-метанол (10 1) 0,62
(Kiesel гель 60 F254 силикагельная пластина, Merek)
Точка плавления: 250 252^oC (разлагается)
Удельное вращение плоскости поляризации: [α]+36^° (C 1,0 метанол)

Спектр инфракрасного поглощения: ν
3400, 3300, 3060, 2980, 2940, 1735, 1710,
1690, 1670, 1660, 1640, 1540, 1520, 1470,
1380, 1330, 1300, 1260, 1220, 1200, 1160,
1130, 1090, 1000, 980, 940, 920 см^-1
Аминокислотный анализ: WS 7622A (1 мг) гидролизуют в 6 н HCl (1 мл) при 110^oC в течение 20 ч, смесь испаряют досуха. Полученную смесь анализируют на автоматическом аминокислотном анализаторе Hitachi 835.

Спектр ядерного магнитного резонанса¹H: (400 МГц, CD₃OD)δ
7,22 7,09 (3H, м)
6,88 6,77 (3H, м)
6,74 (1H, c)
6,46 (1H, c)
5,46 (1H,м)
5,18 (1H, c)
4,85 (1H, c)
4, 77 (1H, м)
4,65 (1H, м)
4,50 (1H, м)
3,96 (1H, м)
3,91 (1H, д, J=9 Гц)
3,60 3,47 (2Н, м)
3,03 (1Н, м)
2,90 (3Н, с)
2,86 (1Н, м)
2,59 2,49 (2Н, м)
2,39 (1Н, м)
2,29 2,16 (2Н, м)
2,00 (1Н, м)
1,84 (1Н, м)
1,74 (3Н, д, J=6 Гц)
1,72 1,53 (4Н, м)
1,44 (3Н, д, J=6 Гц)
1,12 (1Н, м)
1,10 (6Н, д, J=6 Гц)
0,99 (3Н, д, J=6 Гц)
0,94 (3Н, д, J=6 Гц)
Спектр ядерного магнитного резонанса¹³C: (100 МГц, CD₃OD) d
179,7 (с)
176,3 (с)
174,7 (с)
173,3 (с)
172,4 (с)
171,4 (с)
170,3 (с)
165,8 (с)
160,2 (с)
145,7 (с)
145,6 (с)
137,5 (с)
134,0 (д)
131,4 (с)
130,6 (д)х2
129,8 (с)
129,1 (д)х2
129,1 (с)
127,6 (д)
119,1 (д)
118,0 (д)
76,0 (д)
73,4 (д)
63,1 (д)
61,4 (д)
57,1 (д)
53,6 (д)
52,7 (д)
50,5 (д)
39,9 (т)
36,1 (т)
35,8 (д)
31,8 (кв)
31,0 (т)
30,8 (д)
29,9 (т)
29,7 (т)
25,2 (т)
22,3 (т)
20,2 (кв)
20,0 (кв)х2
19, 7 (кв)
19,5 (кв)
13,3 (кв)
Для сравнения используют стандартный раствор аминокислот. Использованы тип H (WaKO Chemicals 013 08391) и Тип B (WAKO Chemicals 016 08641). В результате обнаружены треонин, валин, фенилаланин, орнитин, NH₃ и неизвестные нингидрин положительные компоненты.

Предложена химическая структура WS 7622A со следующим фрагментом:

Подходящими сульфатирующими агентами, использованными для получения WS 7622A моно- и ди-сульфата и их фармацевтически пригодных солей настоящего изобретения, являются хлорсульфоновая кислота, сульфаминовая кислота, комбинация дициклогексилкарбодиимида и серной кислоты, комбинация дициклогексилкарбодиимида и тетрабутиламмонийгидросульфата, аддукты трехокиси серы такие, как комплекс пиридина и трехокиси серы, комплекс триметиламина и трехокиси серы, комплекс диоксана и трехокиси серы комплекс диметиланилидина и трехокиси серы и подобные.

Реакцию, как правило, проводят в обычном растворителе таком, как хлористый метилен, хлороформ, бензол, толуол, пиридин, диэтиловый эфир, диоксан, тетрагидрофуран, ацетон, ацетонитрил, этилацетат,
NN-диметилформамид или какой-либо другой органический растворитель, который не оказывает неблагоприятного действия на реакцию.

Температура реакции не критична, реакцию можно проводить при охлаждении, при комнатной температуре или при нагревании.

Предпочтительно проводить эту реакцию в присутствии основания. Подходящим основанием может быть неорганическое основание такое, как гидроокись щелочного или щелочно-земельного металла (например, гидроокись натрия, гидроокись калия, гидроокись кальция и др.), бикарбонат щелочного металла (например, бикарбонат натрия, бикарбонат калия и др.) карбонат щелочного или щелочно-земельного металла (например, карбонат натрия, карбонат калия, карбонат кальция и др.), фосфат щелочного металла (например, дигидрофосфат натрия, дигидрофосфат калия, динатрийгидрофосфат, дикалийгидрофосфат и др.) или органическое основание такое, как алкоголят щелочного металла (например, метилат натрия, этилат калия и др.), амин (например, триэтиламин, пиридин, лутидин и др.).

WS 7622A моно- или ди-сульфат и их фармацевтически пригодные соли являются новыми соединениями и среди них динатриевая соль WS 7622A ди-сульфата и ди-калиевая соль WS 7622A ди-сульфата имеют следующие физико-химические свойства соответственно.

Ди-натриевая соль WS 7622A ди-сульфата:
Внешний вид: бесцветные кристаллы,
Растворимость: растворима вода, метанол,
нерастворима хлороформ, н-гексан,
Точка плавления: 257-263^oC (разлагается),
Удельное вращение плоскости поляризации: [α]+37,5^° (C=1,0 метанол),
Молекулярная формула: C₄₇H₆₁ N₉O₁₉S₂Na₂
Элементный анализ:
Рассчитано (C₄₇H₆₁N₉ O₁₉S₂Na₂•6H₂O),
C 44,30, H 5,77, N 9,89, S 5,03, Na 3,61.

Найдено, C 44,98, H 5,90, N 10,06, S 5,00, Na 3,98.

Молекулярный вес: FAb-MSm/z 1188 (M+Na)⁺
Спектр инфракрасного поглощения (к фиг. 1): ν
1500, 1380, 1250, 1200, 1060, 1030, 940, 890 см^-1
Спектр ядерного магнитного резонанса 1H
(400 МГц, D₂O)
7, 50 (1H, с)
7,27 (1H,с)
7,33-7,24 (3H, м)
6,94 (1H, кв J=7Гц)
6,85 (2H, брд J=8Гц)
5,53 (1H, м)
5,37 (1H, м)
4, 80 (1H, брс)
4, 63-4,57 (2H, м)
4,53 (1H, м)
4,06 (1H, м)
3,99 (1Н, д, J=10Гц)
3,56 (1H, брд J=14Гц)
3,46 (1H, м)
2,97 (3H, с)
2, 97-2,88 (2H, м)
2,72 (1H, м)
2,59 (1H, м)
2,51-2,38 (2H, м)
2,09-1,91 (4H, м)
1,82-1,60 (3H, м)
1,77 (3H, д, J=7Гц)
1,50 (3H, д, J=6, 5Гц
1,40 (1H, м)
1,11 (6H, д, J=7Гц)
0,99 (3H, д, J=6,5Гц)
0,97 (3H, д, J=6,5Гц)
Спектр ядерного магнитного резонанса¹³C
(100 МГц, D₂O)δ:
183,6 (с)
177,9 (с)
177,7 (с)
174,8 (с)
173,8 (с)
173,3 (с)
172,4 (с)
167,8 (с)
161,5 (с)
145,5 (с)
144,9 (с)
139,6 (д)
139,0 (с)
137,0 (с)
136,0 (с)
132,3 (д х 2)
131,0 (д х 2)
129,6 (д)
127,4 (д)
125,9 (д)
77,4 (д)
75,1 (д)
63,8 (д)
62,7 (д)
59,1 (д)
55,9 (д)
54,9 (д)
51,9 (д)
41,9 (т)
37,2 (д)
36,9 (т)
34,1 (кв)
32,3 (д)
31,9 (т)
31,8 (т)
31,2 (т)
27,5 (т)
23,7 (т)
21,7 (кв)
21,4 (кв)х2
21,3 (кв)
21,1 (кв)
15,5 (кв)
Аминокислотный анализ: ди-натриевую соль WS 7622A ди-сульфата (1 мг) гидролизуют 6н HCl (1 мл) при 110^oC в течение 20 ч и смесь испаряют досуха. Полученную смесь анализируют на автоматическом аминокислотном анализаторе Hitachi 835. Для сравнения используют стандартный раствор аминокислот, использованы Тип H/Wako Chemicals 013-08391/ и Тип B/Wako Chemicals 016-08641/.

В результате обнаружены треонин, валин, фенилаланин, орнитин, NH₃ и неизвестные нингидрин-положительные компоненты.

Ди-калийная соль WS7622A ди-сульфата:
Внешний вид: бесцветный аморфный порошок,
Растворимость: растворима вода, метанол,
нерастворима хлороформ, н-гексан,
Точка плавления: 230-237^oC (разлагается)
Удельное вращение плоскости поляризации [α]+34^° (C=1,0, метанол)
Молекулярная формула C₄₇H₆₁N₉O₁₉ S₂K₂
Элементный анализ:
Рассчитано (C₄₇ H₆₁N₉O₁₉S₂K₂•6H₂O),
C 43,21, H 5,63, N 9,65, S 4,91, K 5,99.

Найдено, C 43, 96, H 5,44, N 9,97, S 5,09, K 4,49.

Молекулярный вес: FAB-MSm/z 1236 (M+K)⁺
Спектр инфракрасного поглощения (к фиг. 4): ν
3360, 2960, 1735, 1660, 1640, 1530,1500, 1405, 1380, 1250, 1200, 1050, 1030, 940, 890 см^-1
Спектр ядерного магнитного резонанса¹H (к фиг. 5): 400 МГц, D₂O δ:
7,52 (1Н, с)
7,28 (1Н, с)
7,34 7,25 (3Н, м)
3,96 (1Н, кв, J=7 Гц)
6,87 (2Н, брд, J=8 Гц)
5,56 (1Н, м)
5,40 (1Н, м)
4,84 (1Н, брд, с)
4,70 4,55 (Н, м)
4,10 (1Н, м)
4,03 (1Н, м)
3,60 (1Н, брд J=14 Гц)
3,50 (1Н, м)
3,00 (3Н, с)
3,00 2,85 (2Н, м)
2,76 (1Н, м)
2,62 (1Н, м)
2,55-2,40 (2Н, м)
2,12 1,95 (4Н, м)
1,90 1,65 (3Н, м)
1,79 (3Н, д, J=7 Гц)
1,53 (3Н, д, J=6,5 Гц)
1,45 (1Н, м)
1,14 (6Н, д, J=7 Гц)
1,02 (3Н, д, J=6,5 Гц)
1,00 (3Н, д, J=6,5 Гц)
Аминокислотный анализ, ди-калийную соль WS 7622A-дисульфата (1 мг) гидролизуют 6 н, HCl (1 мл) при 110^oC в течение 20 ч и смесь испаряют досуха. Полученную смесь анализируют на автоматическом аминокислотном анализаторе Хитачи 835. Для сравнения используют стандартный раствор аминокислот, использованы Тип H-Wako Chemicals 013 08391) и Тип B (Wako Chemicals 016-08641).

В результате обнаружены треонин, валин, фенилаланин, орнитин, NH₃ и неизвестные нингидрид- положительные компоненты.

Предложена химическая структура ди-натриевой соли WS 7622-A ди-сульфата со следующим фрагментом:

WS 7622A моно- или ди-сульфаты и их фармацевтически пригодные соли обладают способностью ингибировать действие эластазы человеческого лейкоцита и полезны в качестве ингибиторов эластазы человеческого лейкоцита для лечения или профилактики дегенеративных болезней, например эмфиземы легких, атеросклероза, ревматического артрита, остеоартрита, псориаза, панкератита, респираторного дистресс-синдрома у взрослых и подобных, а также полезны для лечения и профилактики астмы, при отторжении трансплантата, нефрита и сепсиса.

Для иллюстрации полезных свойств WS 7622A моно- или дисульфатов и их фармацевтически пригодных солей, ниже приведены результаты их проверки.

1. Проверка ингибирования протеазы.

(1) Метод: буфером при испытании служит 0,1 M HEPES (N-(2-окси-этил)пиперазин-N⁺ -2- этансульфоновая кислота), содержащая 0,5 M Na Cl, pH 7,5. Двадцать пять микролитров 2 мМ метилоксисукцинил - (Ala)₂-Pro-Val пара-нитроанилина (100 мМ раствора диметилсульфоксида разбавляют буфером) и 50 мкл образца (10 мкл образца в органическом растворителе разбавляют в 5 раз буфером) смешивают на пластинке с 96 ячейками. На приборе для микрообразцов (Corona Electric Co, Jboraki, Japan) определяют поглощение при 415 нм. После измерения добавляют 25 мкл мокроты человека с содержанием эластазы 6 мкг/мл (HSE) и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Затем измеряют поглощение при 415 нм. Процент ингибирования лекарственных препаратов определяют по формуле 100•(1 r в присутствии ингибитора/'/r при отсутствии ингибитора), где r поглощение через 30 мин инкубации минус поглощение до добавки фермента. Аналогично проверяют действие ингибитора на другие протеазы, используя N-суцинил (Ala)₃ - пара-нитроанилид для эластазы свиной поджелудочной железы (Тип IV, с содержанием 5 мкг/мл), N α -бензоил-Arg-пара-нитроанилид для трипсина бычьей поджелудочной железы (тип I, с содержанием 16 мкг/ мл), метоксисукцинил-(Ala)₂-Pro-Met-пара-нитронилид для химотрипсина бычьей поджелудочной железы (Тип II, с содержанием 1,5 мкг/мл). HSE получают от Elastion Products Company Inc, США. Все другие субтраты и протеазы приобретены у Sigma Clemicals Co.

(2). Результат: ингибирующий эффект ди-натриевой соли WS 7622A дисульфата и ди-калийной соли WS 7622A ди-сульфата на активность в некоторых случаях протеазы серина (табл. 3). Каждое значение выражено в пересчете на 50%-ную ингибирующую концентрацию (IC₅₀).

I. Воздействие на смоделированное диссеминированное внутрисосудистое свертывание, вызванное эндотоксином
(1) Методика.

Диссеминированное внутрисосудистое свертывание было смоделировано на экспериментальных крысах по методике Нисикава и др. (Zife Science 39, III, 1986).

Во-первых, 7-недельным самцам крыс Вистар под анестезией пентабарбиталом (50 мг/кг, внутрибрюшинно) в правую бедренную вену через канюлю с помощью катетера для вливания PE-50 вводили эндотоксин (LPS) и лекарство. Нормальной группе вводился физиологический раствор, а контрольной группе вводили 0,25 мг/кг/ч эндотоксина в течение 4 ч. Группе, подвергавшейся лечению препаратом, вводилась смесь эндотоксина и лекарства, причем количество лекарства равно 10 мг/кг/ч. Все влияния осуществлялись со скоростью 2,3 мл/ч.

(2) Результаты воздействия на смоделированное диссеминированное внутрисосудистое свертывание, вызванное эндотоксином (табл. 4).

II. Определение активности при поражении легких, вызванном действием эластазы.

(1) Метод: исследуют хомяков при анестезии пентобарбиталом. Солевой раствор эластазы или содержащую солевой раствор эластазу человеческой мокроты вводят внутритрахеально через небольшой разрез на шее с брюшной стороны, используя 1 мл шприц с иглой 27 размера. Через 3 ч животных умерщвляют удушающим действием CO₂, у каждого животного вскрывают трахею. Затем орошают легкие, используя 2,5 мл аликвотного физиологического раствора, и затем, извлекая физиологический раствор, получают в результате конечный объем приблизительно 1,5 мл жидкости после бронхоальвеолярного промывания (BAL) от каждого животного.

Клетки жидкости BAL собирают при центрифугировании и затем разбавляют дистиллированной водой, деструктурируя, и определяют содержание гемоглобина спектрофотометрически при 541 нм.

Анализируемые лекарственные средства растворяют в физиологическом растворе и вводят внутритрахеально таким же образом, как вводят эластазу, за 5 мин до введения эластазы.

(2) Результат: ингибирующий эффект на кровотечение в легких, вызванное действием эластазы. (табл. 5).

(^xp 0,05,^xxp 0,01,^xxxp 0,001 по сравнению с контрольной группой, тест Стъюдента).

Фармацевтические композиции изобретения можно использовать в разнообразных фармацевтических формах таких, как порошки, мелкие гранулы, гранулы, таблетки, драже, микрокапсулы, капсулы, суппозитории, растворы, суспензии, эмульсии, сиропы и подобные. Если требуется, с указанными композициями можно смешивать разбавители или наполнители (например, сахарозу, лактозу, крахмал, кристаллическую целлюлозу, мало-замещенную оксипропилцеллюлозу, синетический алюмосиликат и др.), связующие агенты (например, целлюлозу, метилцеллюлозу, оксиропилцеллюлозу, оксипропилметилцеллюлозу, полипропилпирролидон, поливинилпирролидон, желатин, аравийскую камедь, полиэтиленгликоль и др.), подкрашивающие агенты, подслащающие агенты, смазывающие вещества (например, стеарат магния и др.) или подобные.

Дозировка указанных композиций данного изобретения зависит от возраста пациента, веса, условий и пр. при оральном приеме обычно выписывают дневную дозу от 100 мг до 10 г рассматриваемого соединения или его фармацевтически пригодной соли, предпочтительно от 1 до 5 г на том же основании при приеме 1-3 раза в день. Типичной разовой дозой может быть 50, 100, 200, 500 мг и 1 г хотя это только примеры, а не ограничение.

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации изобретения.

Пример 1. В трехгорлую колбу на 300 мл помещают комплекс трехокиси серы и триметиламина (13,9 г, Aldrich), безводный карбонат калия (6,9 г) и вещество WS 7622A (10 г), добавляют безводный диметилформамид (50 мл) и смесь энергично перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь упаривают досуха при пониженном давлении, остаток растворяют в ледяной воде (300 мл) и загружают в колонку HP20_ss (9,6•25 cм). Колонну промывают водой (10 л) и элюируют смесью MeOH Н₂O (4:6,2 л). Фракции продукта собирают и упаривают досуха, получая порошок. Порошок растворяют в H₂O (70 мл), пропускают через колонку AG50W X4 (Na⁺ форма 4• 32 см, лаборатории Bio-Rao') и испаряют досуха. Полученный порошок (11,2 г) перекристаллизовывают из теплого этанола (50 мл), получая 10,6 г ди-натриевой соли WS 7622A ди-сульфата в виде бесцветных кристаллов.

Пример 2. В трехгорлую колбу на 300 мл помещают комплекс трехокиси серы и триметиламина (13,9 г, Aldrich), безводный карбонат калия (6,9 г), добавляют безводный диметилформамид (50 мл) и вещество WS 7622A (10 г) и смесь энергично перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь испаряют досуха при пониженном давлении, остаток растворяют в ледяной воде (300 мл) и загружают в колонну HP20_ss (9,6•25 см). Колонну промывают водой (10 л) и элюитруют смесью MeOH H₂O (4:6) 2 л. Фракции продукта собирают и испаряют досуха, получая 11,8 г ди-калийной соли WS 7622A ди-сульфата в виде бесцветного порошка.

На фиг. 1 5 приведены ИК-,¹H-ЯМР т¹³C-ЯМР спектры полученных соединений.

Реферат

Использование: в медицине как соединения, обладающие способностью ингибировать действие эластазы лейкоцитов человека. Сущность изобретения: WS 7622А ди-сульфаты или их фармацевтически приемлемые соли, среди которых ди-натриевая соль WS 7622A ди-сульфата C₄₇H₆₁N₉0₁₉S₂ Na₂•6H₂O, мол. вес FAB-MS M/Z 1188(M + Na)+, бесцветные кристаллы, т. пл. 257 - 263 град. C (разлож.). Ди-калиевая соль WS 7622A 1b-сульфата C₄₇H₆₁N₉0₁₉S₂ K₂ •6H₂O, мол. вес. FAB-MS M/Z 1236 (M + K)+, аморфный порошок, т. пл. 230 - 237 град. C (разлож), обе соли хорошо растворимы в воде и метаноле, нерастворимы - в хлороформе, н-гексане. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала эффективное количество дисульфата WS 7622A в виде калиевой или натриевой соли. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 ил.

Формула