Способ получения антигена вируса гепатита в из дрожжей - SU1604144A3

Описание

Изобретение относится к способу извлечения и очистки белка из культуральных сред, в частности к способам получения антигена вируса гепатита В, полученных методами рекомбинантных ДНК из дрожжевых штаммов, полученных методами генетической инженерии.

Целью изобретения является повышение выхода антигена вируса гепатита В (HBsAg);

Повьш1еНие выхода KBsAg обеспечивается за счет того, что в качестве ионного детергента используют полисорбатол-20 , обогащение фракции пооводят путем доведения рН до 6, добавляют ПЭГ-400 до конечной концентрации 32% или ПЭГ 600 до конечной концентрации 10%.. осадок отделяют центрифугированием , к супернатанту добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 40-50%, далее проводят ультрафильтрацию и ионообменную хроматографию с последующей гельфильтрацией или центрифугированием в градиенте хлористого цезия.

печ.ивающие экспрессию KBsA,c;, выращивают до массы сухих .клеток 30 г на 1 л культуры, суспендируют в 7,12л раствора (7,098 г/л),

В суспензию добавляют 142,5 мл 4%-ного раствора ЭД-ТА, 38,5 мл полисорбата-20 и 385 мп изопропанрла, содержащего 2,7 г фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Значение рН доводят до 8,1 (iO,l) добавлением NaOH (10%) в воде. Суспензию охлаждают на ледяной ванне и разрушают с по мощью двух пропусканий через охлаждае№ш гомогенизатор со стеклянными шариками. Гомогент (сырой экстракт) затем центрифугируют в течение 30 мин при 13000 g.

ПЭГ 400 (2,5л) медленно добавляют перемешиванием к сырому экстракту (7,7 л), который поддерживают при темпратуре ниже 15С. Затем рН поводят до 6 (iOjO добавлением уксусной кислоты (5 М) и среду сохраняют в течение часа при 4°С, после чего центрифугируют 45 мин при 7400-11000 и.

Надоеадочную жидкость дово;тдт до рН 7,0 (±0,05) добавлением 1 н NaOH и добавляют 300 мп М СаС (т.е. 30 МП на 1 л кадосадочной жидкости ). Значение рН вновь доводят до 7 (±0,05) добавлением 1 н КаОН и сохраняют при в течение ночи. Суспензию центрифугируют при 3600 g в течение 45 мин и надосадочную жидкость подвергают ультрафильтрации на приборе Амнкон С (производимом фирмой Амикон кор., Дэнверс, шт. Массачусетс, США), оборудованном кассетой , имеющей отсечку на 100000 дал тон, и тем самым вначале концентрируют до 1/4 (1500 мл) начального обьема. Затем раствор непрерывно проьйшают с помощью 12,5 л 10 мМ трометамола , доведенного до рН В (±0,1) добавлением 1 н хлористоводородной кислоты (этот буфер в дальнейшем имануется трометамолом рН 8) и допол НЯ10Т ФМСФ (1 мМ), изопропанолом (2,5 об.Х) и ЭДТА (2 мМ) (оконча тельные концентрации). Ретентат за™ тем дополнительно концентрируют до 350 мл..

Сконцентрированный раствор вносят в колонку ( 10 см ж 100 см), содержащую 7л Фрактогеля TSKHF65 (F) (полутвер дын гель,состояп9 йиз гидрофильных виниловых полимеров с многочисленными ги дрок сильными группами на матричной

.поверхности при размере частиц 3263 мкм, производится и продается фирмой Э.Мерк, Дармштадт, ФРГ), уравновешенного в буфере трометамол Ш мМ НС1 рН 7 (+0,01) с добавлением 5 об.% этиленгликоля.

Содержащий HBsAg антиген вносят в колонку (05 см X 30 см) с 300 мп Фрактогеля TSK DEAE(M) (слабо1ц,елочная анионообменная смола, в которой диэтиламиноэтиловые группы связаны с гидроксильными группами матрицы Фрактогеля TSK HW-65 через эфирные связки; производится и продается фирмой Э.Мерк, Дармштадт, ФРГ), урановешенного в трометамоле рН 8 при 4 С. Колонку промывают трометамолом рН 8, содержащим 0,05 М NaCl, и HBsA элюируют с помощью 0,15 М NaCl в трометамоле рН 8.

Элюат вносят в колонку с Фракто- гелем TSK HW 65 (F) урановешенным с буфером NaH2P04. (10 мМ) рН 6,8, дополненного NaCl (160 мМ), что дает раствор составных мицелл HBsAg/полисорбата .

Уровень очистки, достигнутый на каждой стадии очистки, указан в табл.1.

В табл.2 указан состав составных мицелл для трех различных партий вакцин , полученных с применением предлагаемого способа на полисорбате-20.

Пример 2. ПЭГ 400 (882 мл) медленно добавляют к 2,650 л сырого экстракта, приготовленного по методике примера 1, и рН доводят до 6,0 (±0,1). Среду выдерживают при 4 С в течение 1 ч, а затем центрифугируют при 7400 к. Надосадочную жидкость концентрируют до 1000 мл на приборе Амикон С, оборудованном кассетой, имеюшей отсечку на 100000 дапьтон, а затем промывают 3 объемами 20 мМ трометамола рН 8. После этого к ретентату медленно добавляют порошковый сульфат аммония (277 г) при 4 С и перемешивании . По прошествии 1ч при осадок центрифугируют 15 мин при lOOOg. Надосадочную жидкость отбрасывают и осадок растворяют в 400 мл 20 мМ трометамола рН 8, дополненного 1 мМ ФМСФ. Раствор подвергают ультрафильтрации на приборе Амикон С, оборудованном кассетой, имеюиуей отсечку на 0 дапьтон. Ретентат (500 мп) промывают 2 объемами тео5 метанола рН 8, а затем вносят в колонку , содержап уго 300 мл TSK DEAE 650 М-геля уравновешенного с трометамолом рН 8. После завершения пропускания пробы, колонку промывают с помотцью 0,05 М NaCl в трометамоле рН 8 и в колонке затем создают линейный градиент NaCl (0,05 м- 0,5 М) Фракция, элюированная с помо1цью 0,15 М NaCl, содержит HBsAg, ее концентрируют до 50 МП на приборе Амикон С, снабженном кассетой, имеюш й отсечку на 10000 дальтон, и вносят в колонку ( р 50 мм X 100 см) Сефарозы 4В-С1 (агарознЫй гель,про изводимый и продаваемый фирмой Фармация файн кемиклз, Уппсапа, Швеция урановешенной с 20 мМ трометамола рН 8, дополненного 5% этиленгликоля с получением раствора составных мицелл HBsAg полисорбата. Достигнутый на каждой стадии уровень очистки приведен в табл.3. Пример 3. Сырой экстракт MBsAg (2 л) осветляют с помощью ПЭГ 400, как это описано в примере 1 При перемешивании к нему добавляют порошковый сульфат аммония (АМС) 450 г (окончательная концентрация составляет 45% АСМ-насьшения). После солюбилизации АМС раствор выдерживают .при в течение 3 ч, в конце этого периода получают две выраженные фазы, которые разделяют на делительной воронке: прозрачная (желтая) верхняя фаза (фаза ПЭГ 400) и прозрачная нижняя фаза (водная фаза), причем каждая фаза составляет около +50% первоначального объема. Водную фазу отбрасывают, а верхнюю фазу под вергают ультрафильтрации на приборе Амикон С, как это описано дпя СаС надосадочной жидкости в примере 1. З тем процедуру очистки проводят по ме тодике примера I, что дает раствор составных мицелл HBsAg (полисорбат). Достигнутый на каждой стадии уровень очистки приведен в табл.4. Пример 4. Сырой экстракт HBsAg (2 л) осветляют с помо1цью ПЭГ 400, как это описано в примере 1 При перемешивании к нему добавляют порошковый сульфат аммония (АМС) 450 г (окончательная концентрация 4 выраженные фазы, которые разделяют на делительной воронке: прозрачная (желтая) верхняя фаза (фаза ПЭГ 400) и прозрачная нижняя фаза (водная фаза), причем каждая фаза составляет около 50% первоначального объема. Водную фазу отбрасывают и лит ровую аликвотную порцию ПЭГ-фазы (верхняя фаза) двукратно разбавляют с помоп ью 10 мМ триметамола рН 8 и вводят в колонку, содёржап ю 300 мл Фрактогеля TSK - DEAE 650 (М). (геля), уравновешенного трометамолом рН 8, с расходом 100 мл/ч. Гель промывают трометамолом рН 8, содержаш м 0,05 М NaCl, и затем HBsAg элюируют с помош ью градиента NaCl (0,050 ,5 М NaCl в трометамоле рН 8). Пик HBsAg элюируют с помош ю О,15 М NaCl и после концентрирования на приборе Амикон с, снабженном кассетой, имеюш,ей отсечку на 10000 дальтон, ретентат вводят в колонку (5x100 см) Сефарозы 4В-С1, уравновешенную трометамолом рН 8, срдержаш им 5 об.% этиленгликоля, что дает пик соста вных мицелл HBsAg (полисорбат). Уровень очистки на каждой стадии приведен в табл,5. Пример 5. Сырой экстракт HBsAg (500 мл) осветляют медленным добавлением раствора 50 г ПЭГ-6000 в 160 мл воды при перемешивании и . Значение рН доводят до 6,1. добавлением 5 М уксусной кислоты. После хранения при 4°С в течение 1ч экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 7000 g. Затем к надосадочной жидкости при перемешивании добавляют порошковый сульфат аммония (157 г).(окончательная концентрация составляет 50% насьш енного сульфата аммония). После солюбилизации раствор выдерживают при 4°С в течение 3 ч, по прошествии которых.получают две выраженные фазы, которые разделя-. ют на делительной воронке. Верхнюю фазу (ПЭГ-фазу, содержаш ю HBsAg) двукратно разбавляют трометамолом рН 8, а затем вводят в колонку, содержашую 300 мл TSK DEAE 650 (М)-геля, уравновешенного . в трометамоле рН 8, с расходом 100 МП/ч. Гель промывают трометамо- лом рН 8, содержац{им 0,05 МNaCl, и HBsAg-антиген элюируют трометамолом рН 8, содержащим 0,15 М NaCl, концентрируют на приборе Амикон С, оборудованном кассетой, имеющей отсе ку на 10000, и ретентат затем вводят в 2-литровую колонку (5x100 см) Фрактогеля TSK - WJ 65 (F), уравно вешанную трометамрлом рН 8, содерKauiHM 10 об,7, этиленгликоля, что дает раствор составных мицелл НЕзАя (полисорбат). Уровень очистки на каждой стадии приведен в табл.6, ; Пример 6. ПЭГ-400 (13 мл) медленно добавляют к сырому экстракту альфа-1-антитрипсина (120 мл) из дрожжевой культуры, полученной методами генной инженерии, и рН доводят до 6,1 добавлением S М уксусной кислоты. После хранения в течен часа при среду центрифугируют при 5000 g в течение I5 мин и мед: ленно добавляют -IM СаС1,-раствор до окончательной концентрации 40 мМ. Значение рН доводят до 7 разбавлением Ш МаОК . и после хранения при °С в течение ночи среду центрифуги руют 15 мин при 7000 g. Надосадочную жидкость двукратно разбавляют с помош ью 50 мМ трометамола, доведенного до рН 8,7, добавлением 0,01 Н хлористоводородной кислоты, и вносят в колонку с Фрактогелем TSK DEAE 650 (М) (20 ют), уравновешенную с помощью 50 мМ трометамолом рН 8,7, приготовленным указанным выше образом, но с добавлением 5 мМ меркаптоэтанола. Колонку промывают трометамолом рН 8,7, приготовленным описанным выше образом, но дополненным 10 мМ NaCl, создают градиент Nad (10 мМ - 250 мМ) и аль6а-1-ан титрипсин (ААТ) элюируют при концентрации NaCl 124 мМ, выделяют из белкового пика, элюированного при 80 мМ NaCl. Альфа-1-антитрипсиновый пик концентрируют на приборе Амикон С, снабженном кассетой, имею цей отсечку на 10000, и вносят в ко лонку Сефадекс 150, урановешенную с использованием 50 мМ трометамола рН 8,7, приготовленного указанным выше образом, что дает раствор очиir eHHoro альфа-1-антитрипсина. Уровень очистки, достигнутый на важдой стадии, указан в табл.7. дукта аналогичны приведенным для продукта , полученного в конце примера 1. Пример 8. Методика соответствует описанной в примере 1, но с заменой 38,5 мл полисорбата-20 на 20 мл Тритона Х-100 (продукт производства фирмы Ром энд Хаас, Дармштадт, ФРГ). Характеристики конечного продукта аналогичны приведенным для продукта, полученного в конце примера 1. Пример 9. Методика соответствует описанной в примере 1, но с заменой 38,5 мл полисорбата-20 на 38,5 МП полисорбата-80. Характеристики конечного продукта аналогичны приведенным для продукта, полученного в конце примера 1. Г Пример 10. Раствор составных мицелл KBsAe, полученных в конце примера 1, доводят до содержания белка 10 мкг на 1 мл добавлением NaCl фосфатного буфера , и Алгидрогеля (.гель гидроксида алюминия , производимый и продаваемый фирмой Суперфос экспорт Ко, Копенгаген , Дания) до окончательных концентраций 0,9% /О мМ и 0,15% Al(OH)j соответственно, причем конечное значение рН равно 6,9. Препарат стерилизуют и распределяют в стеклянные ампулы по 2 мп, каждая из которых содержит миллилитровую единичную дозу вакцины. Формула изобретения 1. Способ получения антигена вируса гепатита В из дрожжей, включающий разрушение клеток, обработку неионным детергентом в присутствии фенилметилсульфонилфлюорида, обогащение фракции .целевого продукта путем высаливания и разделения биологических молекул по их размерам, отличающийся тем, что, с целью повьшения выхода антигена вируса гепатита Bj, в качестве ионного детергента используют полисорбатол-20, обогащение фракции проводят путем доведения рН до значения, равного6, добавляют ПЭГ 4UO до конечной концентрации 32% или ПЭГ 600 до конечной концентрации 10%, осадок отделяют центрифугированием, к супернатанту добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 40-50%, далее

проводят ультраЛильтрацию и ионообменную хроматографию.

2. Способ поп.1,отличающ и и с я тем, что дополнительно

проводят гельфильтрацню или центрифугирование в градиенте хлористого цезия.

Таблица I

Таблица 4

Таблица 7

Реферат

Изобретение относится к способу извлечения и очистки белка из культуральных сред, в частности к способу получения антигена вируса гепатита В, полученных методами рекомбинатных ДНК из дрожжевых штаммов, полученных методами генетической инженерии. Целью изобретения является повышение выхода антигена вируса гепатита В (HBSAG). Повышение выхода HBSAG обеспечивается за счет того, что в качестве ионного детергента используют полисорбатол-20, обогащение фракции проводят путем добавления PH до значения, равного 6, добавляют ПЭТ 400 до конечной концентрации 32% или ПЭТ 600 до конечной концентрации 10%, осадок отделяют центрифугированием, к супернатанту добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 40-50%, далее проводят ультрафильтрацию и ионообменную хроматографию с последующей гельфильтрацией или центрифугированием в градиенте хлористого цезия. 7 табл.

Формула