Дипептидиламинопептидаза и способ ферментативного отщепления n-концевых дипептидов met-tyr, met-arg или met-asp от полипептидной последовательности - RU2096455C1

Описание

Изобретение относится к области биотехнологии, а более точно к дипептидиламинопептидазе, выделенной из слизневого грибка, Dictyostelium discoideum, которая может использоваться при получении рекомбинантных полипептидов.

Изобретение также касается способа ферментативного отщепления N-концевых дипептидов Met-Tyr. Met-Arg или Met-Asp от полипептидной последовательности, предусматривающего контактирование полипептидной последовательности с дипептидиламинопептидазой при условиях, достаточных для этой реакции.

Из патента США N 5126249 (C 12 P 21/06, 1992) известен способ энзиматического отщепления N-концевых дипептидов с использованием дипептидаминопептидазы DAP-1.

Дипептидиламинопептидазы (ДАП) являются ферментами, которые гидролизуют предпоследнюю пептидную связь у аминного конца, выделяя дипептиды из пептидов и белков, содержащих свободные концевые аминогруппы. В настоящее время известно четыре класса дипептидиламинопептидаз (их обозначают DAP-I, DAP-II, DAP-III и DAP-IV), которые различают по их физическим характеристикам и скоростям, с которыми они катализируют расщепление различных последовательностей аминоконцевых пептидов. DAP-I является относительно неспецифичной ДАП, которая способна катализировать высвобождение большого количества дипептидных комбинаций из пептидов и белков со свободными концевыми аминогруппами. DAP-I проявляет небольшую активность или не проявляет никакой активности в том случае, если образуется дипептид типа Х-Pro, Arg-X или Lys-X (где Х аминокислота). Использование DAP-II предпочтительно в случае таких дипептидных последовательностей с концевыми аминогруппами, которые начинаются с Arg-X или Lys-X, и в меньшей степени, Pro-X. По отношению к большинству других дипептидных комбинаций DAP-II демонстрирует значительно более низкие скорости расщепления. DAP-III проявляет склонность к дипептидным последовательностям с концевыми аминогруппами типа Arg-Arg и Lys-Lys. Наибольшая скорость гидролитической активности DAP-IV наблюдается по отношению к дипептидным последовательностям типа Pro-X. Было установлено, что ДАП ферменты, в частности DAP-I и DAP-IV могут быть использованы в производстве белков.

Настоящее изобретение касается новой ДАП из Dictyostelium discoideum, которая может быть использована при получении рекомбинантных белков с четным количеством N-концевых аминокислот.

Настоящее изобретение касается новой дипептидиламинопептидазы, выделенной из клеточного слизневого грибка Dictyostelium discoideum.

Dictyostelium discoideum является простейшим эукариотным микроорганизмом, обычно называемым слизневым грибком или, точнее, клеточным слизневым грибком. Его название возникло из двух крайних, с макроскопической точки зрения, состояний этого микроорганизма. Во время стадии активного роста Dictyostelium discoideum развивается как простая одноклеточная амеба. На этой стадии они не имеют клеточных стенок и поэтому напоминают тонкую пленку (или слизь). При отмирании на твердой поверхности независимые клетки агрегируют с образованием колонии. Колония проявляет черты, присущие многоклеточному организму, в частности, она может перемещаться в виде так называемого слизня, а также видоизменяется так, что задние клетки слизня образуют ножку, передние клетки стебель, а средние клетки способное к размножению тело. В природе этот микроорганизм встречается на поверхности почвы и навоза. Некультивированная амеба питается исключительно путем проглатывания (фагоцитоз) целиком всей бактерии; по этой причине их иногда относят к плотоядным. Были выделены мутанты Dictyostelium discoideum, которые способны расти в отсутствие культуры "пищевой" бактерии и поэтому могут быть выращены в жидкой среде.

ДАП-фермент по изобретению получен из штамма Dictyostelium discoideum АТСС 28368 и обладает следующими характеристиками:
молекулярный вес: около 225000 Да,
ферментативная активность: способна отщеплять аминоконцевой дипептид Met-Tyr, Met-Arg или Met-Asp от Met-Tyr-человеческого проинсулина, Met-Arg-человеческого проинсулина или Met-Asp-человеческого проинсулина соответственно, при рН оптимуме около 3,5.

Новый ДАП фермент, dDAP, проявляет активность, которая в некоторой степени напоминает как DAP-I, так и DAP-III, но значительно отличается от этих ферментов по своим физическим и другим ферментативным характеристикам. Изобретение касается также способов применения фермента dDAP для выделения дипептидов у N-конца рекомбинантно полученных исходных белков и пептидов. Фермент dDAP по настоящему изобретению может быть использован для выделения отдельных дипептидов у N-конца полипептидов, а также для последовательного выделения более чем одного дипептида у N-конца исходных полипептидов. И, наконец, изобретение касается способов выделения и очистки фермента dDAP из культуры Dictyostelium discoideum.

Для пояснения целей настоящего изобретения, приведенных выше, введены следующие термины и сокращения:
dDAP дипептидиламинопептидаза, выделенная из Dictyostelium discoideum, оптимальный рН для которой составляет приблизительно 3,5, при использовании в качестве субстрата GFpNA, и имеющая, по данным аналитического ультрацентрифугирования, природную мол. м. около 225000 Да и подблочную мол. м. по данным гельэлектрофореза на полиакриламиде SDS, около 66000 Да.

GFpNA Gly-Phe-p-нитроанилид.

Исходный полипептид рекомбинантно полученный полипептид, который состоит из четного количества аминокислот, выстроенных с аминного конца заданного целевого полипептида.

Превращенный полипептид полипептид, в котором удален N-концевой дипептид или дипептиды с целью получения заданного полипептида
RRBNA Arg-Arf-β-нафталамид.

Все сокращения для аминокислот, используемые в описании данного изобретения, приняты управлением США по патентам и товарным знакам в соответствии с 37 C.F.R. параграф 1.822(b) (2) (1190).

Настоящее изобретение относится к dDAP, дипептидиламинопептидазе, выделенной из клеточного слизневого грибка Dictyostelium discoideum. Фермент dDAP проявляет склонность к расщеплению последовательностей незаблокированных аминокислотных остатков, которую обычно связывают с как DAP-I, так и DAP-III, однако dDAP значительно отличается от указанных ферментов как по физическим, так и по другим ферментативным характеристикам, dDAP имеет оптимальный рН около 3,5 при использовании в качестве субстрата GFpNA и природную мол. м. около 225000 Да и подблочную мол. м. около 66000 Да. Афинная хроматография на лектинах показывает, что фермент dDAP, вероятно, является гликопротеином. dDAP обладает способностью выделять дипептиды из синтетических субстратов, Gly-Phe-p-нитроанилида (GFpNA) и Arg-Arg-b-нафтиламида (RRBNA), а также из других синтетических и полученных рекомбинантно полипептидов.

Известный фермент DAP-I был выделен из большого количества организмов животных и животных тканей. Новый фермент, dDAP, выделен из бульона с культурой Dictyostelium discoideum. Фермент DAP-I требует для проявления своей активности присутствия галогена и восстановительного агента. Такие реагенты, как иодоацетат, которые модифицируют SH группы цистеина, дезактивируют фермент DAP-I, DAP-I проявляет оптимальную активность при рН между 5 и 6. Напротив, для dDAP, оптимальное значение рН составляет приблизительно 3,5, при использовании в качестве субстратов Gly-Phe-p-NA или Gly-Arg-p-NA, и он проявляет значительную активность при рН 3,5 по отношению к пептидам и белкам. Фермент dDAP лишен какой бы то ни было активности при рН более 6. Фермент dDAP не требует дополнительного применения восстановительного агента и полностью активен в присутствии модификаторов цистеина, таких как иодоацетат или тетратионат. dDAP напоминает бычий DAP-I в том, что он не в состоянии расщепить пептиды с заблокированными N-концами, однако в отличие от бычьего DAP-I dDAP активен по отношению к окисленному метионину у N-конца. Бычий DAP-I не в состоянии расщепить субстраты с окисленными метионинами у N-конца. Далее в отличие от DAP-I фермент dDAP легко расщепляет субстрат Arg-Arg-b-нафтиламид. Это способность расщеплять субстраты, содержащие аминоконцевые дипептидилы Arg-Arg, скорее напоминает активность ферментов DAP-III, выделенных из млекопитающих или микробных источников, однако сообщалось, что фермент DAP-III имеет оптимальное значение рН в щелочной области, в то время как dDAP функционирует наиболее эффективно в кислой области. Субблочная мол. м. dDAP, установленная по SDS PAGE, приблизительно составляет 66000 Да, в то время как субблочная мол. м. DAP-I млекопитающих составляет около 22000 Да.

Фермент dDAP по изобретению наиболее пригоден для получения превращенных полипептидов из исходных полипептидов. Например, если заданным полипептидом является человеческий гормон роста, необходимо лишь выделить исходный для человеческого гормона роста полипептид (в частности, Met-Asp-человеческий гормон роста и подействовать на него активностью dDAP, чтобы разделить дипептид Met-Asp и желаемый превращенный полипептид, человеческий гормон роста. Превращенный полипептид не обязательно должен быть "природным" некультивированным полипептидом, поскольку часто требуется получить аналоги или промежуточные соединения. Метод превращения исходных полипептидов также является частью настоящего изобретения. Другими исходными полипептидами, которые могут быть подвергнуты превращению с использованием dDAP, являются Met-Arg-hGH, Met-Tyr-проинсулин, аналог Met-Arg-проинсулина (В28 Lys, B29 Pro), аналог Met-Tyr-проинсулина (B28 Lys, B29 Pro), аналог Met-Arg-проинсулина (B10, Asp, des B29-30) и аналог Met-Tyr-проинсулина (B10 Asp, des B28-30). Аналог инсулина (B28 Lys, B29 Pro) описан в Европейской заявке на патент с серийным номером 90301224.3, а аналог инсулина (B10 Asp, des B28-30) описан в Европейской заявке на патент с серийным номером 92305678.2. Далее, dDAP может быть использован для последовательного выделения более одного дипептида у N-конца исходных полипептидов. Превращение Met-Arg-проинсулина и аналогов Met-Arg-проинсулина с применением DAP-1 быка описано Becker et.al, в заявке на патент США с номером 5126249, опубликованной 30 июня 1992, полная методика которой приводится здесь в качестве ссылки.

Преимущество использования фермента dDAP для удаления дипептидов из исходных белков состоит в том, что dDAP имеет оптимальное значение рН около 3,5, что позволяет проводить реакцию в кислой среде, в которой смогут быть растворены многие исходные полипептиды. Далее, превращение некоторых исходных полипептидов в нейтральных или больших значениях рН может привести к более высоким уровням образования межцепочечных дисульфидных димеров или полимеров субстрата, что сопровождается уменьшением выхода продукта. Это явление, получившее название дисульфидного захвата, представляет особую проблему, когда используют бычий DAP-I, поскольку DAP-I требует добавления к реакционной смеси восстановительных агентов, таких как бета-меркаптоэтанол или цистеин. В кислотном интервале значений рН также наблюдается более медленное окисление остатков метионина. Далее экономически целесообразнее использовать фермент, полученный из культуры Dictyostelium discoideum, чем полагаться на коммерческое производство ферментов из животных источников, поскольку ферментационная технология обеспечивает большую однородность продукта и воспроизводимость фермента. Отказ от ферментов, полученных из животных источников, позволяет получить постоянный источник особо чистого объемного материала. Ферментация Dictyostelium discoideum Ax3 (АТСС 28368) с последующим центрифугированием, анионной обменной хроматографией, хроматографией гидрофобных взаимодействий и хроматографией по размеру молекул приводит к высоко чистому раствору фермента dDAP, который можно хранить или же немедленно использовать для превращения исходных полипептидов. Выделение и очистка dDAP из ферментационного бульона также является частью настоящего изобретения.

Изменение исходных полипептидов в превращенные может быть осуществлено в широком интервале значений температуры, рН и времени. Реакцию обычно проводят в водной среде, которая содержит подходящий буфер для поддержания заданного значения рН в интервале приблизительно от 2,5 до 5,5. Предпочтительно, рН среды составляет от 3,0 до приблизительно 4,5, а еще более предпочтительно от 3,0 до приблизительно 3,5. Оптимальное значение рН может слегка изменяться в зависимости от субстрата. Например, скорость превращения Gly-Phe-pNA и Gly-Arg-pNA наибольшая при рН приблизительно 3,5, в то время как скорость превращения Met-Asp-hGH наибольшая в интервале рН приблизительно от 3,0 до 3,5. Скорость превращения Arg-Arg-bNA наибольшая при рН около 4,5. Опытный экспериментатор согласится с тем, что оптимальное значение рН конкретной реакции определяется такими факторами как устойчивость и растворимость данного исходного полипептида и фермента. В некоторых случаях могут быть применены солюбилизаторы, такие как мочевина, додецилсульфат натрия, гуанидин и т.п.

Реакция может протекать в течение любого временного интервала, начиная от нескольких секунд до нескольких дней. Предпочтительное время проведения реакции составляет от 1 мин до 24 ч, а наиболее предпочтительно от приблизительно 1 ч до приблизительно 8 ч. Опытный экспериментатор согласится с тем, что время проведения реакции можно подобрать таким образом, чтобы перекрыть любое значение, требуемое для любого необходимого исходного полипептида или превращенного полипептида.

Температуру проведения реакции также можно подобрать для каждого определенного субстрата. Реакцию предпочтительно проводят при температуре приблизительно от 15^o C до 45^oC. Более предпочтительная температура реакции лежит в интервале приблизительно от 20^oC до 37^oC, а наиболее предпочтительная температура реакции лежит в интервале приблизительно от 25^oC до 37^oC. Вновь, опытный экспериментатор согласится с тем, что такие параметры реакции, как время, температура и рН могут меняться в зависимости от свойств требуемого исходного или превращенного полипептида.

Может быть использован большой круг буферных агентов, единственным требованием является их способность поддерживать рН в заданном интервале. Примерами типичных буферных агентов являются фосфат натрия, ацетат натрия, цитрат натрия, глицин и т.п. Предпочтительными буферными агентами являются ацетат натрия, фосфат натрия и глицин.

Исходные полипептиды для использования по изобретению обычно получают по рекомбинантной технологии с использованием ДНК. В процессе их получения кодирующую последовательность нуклеотидов для требуемого исходного полипептида подготавливают по обычным для этого синтеза методикам. Эти методы, как правило, включают подготовку кода олигонуклеотидов как для фрагментов требуемой кодирующей последовательности, так и комплементарной ей последовательности, олигонуклеотиды подготовлены таким образом, чтобы обеспечить перекрывание одного фрагмента кодирующей последовательности с двумя фрагментами комплементарной последовательности, и наоборот. Олигонуклеотиды группируются парами и связываются, образуя в конце концов заданную последовательность гена.

Эту последовательность наносят на клонирующий вектор с тем, чтобы выделить продукт, который он кодирует. Подходящий клонирующий вектор содержит по меньшей мере часть контрольной последовательности.

Следующие примеры приведены для пояснения настоящего изобретения, но не для его ограничения.

Пример 1. Ферментация Dictyostelium discoideum
Лиофилизованные культуры Dictyostelium discoideum Ах3 были получены из American Type Culture Cjlltection (Роквиль, штат Мериленд) по номеру каталога АТСС 28388 и были нанесены с разной толщиной на пластины из агар-агара (1,2% Difco Bacto Agar), содержащие буферную среду дрожжевой экстракт пептон при следующем содержании компонентов, г/л: дрожжевой экстракт Difco (7,15), пептон Difco Bacto (14,3), Na₂HPO₄ (0,51) и KH₂PO₄ (0,49), к которому асептично после нескольких стерилизаций прибавляют глюкозу (окончательная концентрация 10 г/л) и рН которого доводят до конечного значения 6,5 (+/-0,1) с помощью едкого натра или серной кислоты. Ту же среду (без добавления агар-агара) используют для выращивания жидкой культуры в объемах не более 1 л. Пластины агар-агара помещают на 3 5 дней в термостат при температуре от 21^oC до 24^oC. Мешочки со спорами осторожно снимают с пластин, чтобы предотвратить попадание "пищевых бактерий", лиофилизованных с культурой Ах3, а затем вносят в 3 мл бульона буферный дрожжевой экстракт - пептон и выращивают при небольшом встряхивании при 21 24^oC. Далее клетки Dictyostelium discoideum распространяют последовательным переносом в бульон буферный дрожжевой экстракт пептон с большим объемом. Каждую операцию последовательного переноса осуществляют разбавлением от 10 до 25 раз, которое проводят, когда плотность клеток превысит значение около 2 х 10⁶ /мл. Бульоны выдерживают в одинаковых условиях при 21 24^oC при небольшом перемешивании.

Ферментации при перемешивании обычно проводят в аналогичной среде, заменяя пептон Bacto в исходной среде "буферный дрожжевой экстракт пептон" на соевый пептон (например пептон Phytone или соевый пептон Marcor) с концентрацией от 2 до 14,3 г/л. Выделяют целевой продукт из ферментаторов с рабочим объемом от 10 до 5000 л, снабженных от 1 до 3 турбин типа Rushton, рабочие колеса которых вращаются со скоростью 40 150 об/мин. Температуру поддерживают на уровне 22 ± 1^oC, поток воздуха устанавливают на уровне от 0,1 до 0,5 объемов воздуха на объем жидкости в бульоне, а обратное давление поддерживают на уровне 3 5 р.s.i. Некоторые ферментации проводят, поддерживая рН на уровне 6,4 с помощью серной кислоты, а некоторые ферментации проводят, контролируя количество растворенного кислорода на уровне 40 60% с помощью изменения скорости перемешивания и скорости газового потока. Принимают меры для уменьшения количества срезов при переносе и ферментации клеток, поскольку в процессе роста они представляют собой амебу, не имеющую клеточных стенок.

В общем случае перемешиваемые культуры Dictyostelium discoideum Ах3 растут с временем удвоения от 12 до 36 ч. Количество растворенного кислорода быстро уменьшается (если его содержание не поддерживается на заданном уровне), а затем начинает возрастать через некоторое время после того, как плотность клеток прекращает увеличиваться. Заключительная плотность клеток составляет от 3 • 10⁶/мл до 5 • 10⁷/мл, при этом перенос кислорода, вероятно, лимитирован в тех ферментациях, при которых достигается нижний указанный предел плотности клеток.

Время от времени отбирают пробы, которые подвергают анализу на плотность клеток и активность по отношению к GF-pNA (см. ниже пример 3). Для оценки плотности клеток выше приблизительно 5 • 10⁵/мл используют счетную камеру Петрова-Хаузера. В целом, активность по отношению к GFpNA возрастает в процессе ферментации. Максимальная активность dDAP наблюдается через 2 4 дня после того, как достигается максимальная плотность клеток. Весь бульон целиком хранят при 4^oC или же замораживают при -20^oC, а позднее размораживают и анализируют активность. Ферментации выделяют охлаждением до температуры менее 10^oC с последующим центрифугированием в постоянном потоке.

Пример 2. Получение dDAP
А. Удаление клеток и концентрирование
Первичная очистка dDAP, полученной из Dictyostelium discoideum, включает в себя операции удаления клеток и концентрирования. Удаление клеток осуществляют центрифугированием в постоянном потоке на центрифуге Western States. Свободную от клеток среду концентрируют в 20 раз с помощью ультрафильтрации с тангенциальным потоком на мембране, отсекающей мол. м. 50000. Остаток сливают из узла ультрафильтрации, который дополнительно промывают буфером Tris, рН 7, с концентрацией 50 мМ для выделения дополнительного количества dDAP. Остаток и промывочный раствор объединяют, получая конечный концентрат, который хранят замороженным при -20^oC в течение нескольких месяцев перед проведением дальнейших операций.

Б. Осветление
Замороженный конечный концентрат оттаивают в течение 12 ч при комнатной температуре. После оттаивания конечный концентрат осветляют перед первым этапом колоночной хроматографии. Осветление проводят с помощью центрифугирования с последующей фильтрацией через мембрану с размером пор 5 мкм. Доводят рН осветленного конечного концентрата до 7,0 и хранят его при температуре 4 10^oC не более 12 ч перед операцией анионной обменной хроматографии.

В. Анионная обменная хроматография
Первой хроматографической стадией процесса очистки dDAP является ионообменная хроматография с использованием смолы Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow (FFQ). Колонку уравновешивают 50 мМ буфера Tris, рН 7. Осветленный очищенный от клеток концентрат подают с линейной скоростью потока 50 см/ч при отношении 60 л неконцентрированной ферментативной среды на 1 л смолы. Это приводит к загрузке белка на уровне 60 г на 1 л смолы (количественную оценку белка проводят по методике Pierce BCA Protein Assay по отношению к стандартному образцу альбумина бычьей сыворотки). На 1 л смолы FFQ подают приблизительно 250 единиц активности dDAP. Проводимость освобожденного от клеток концентрата составляет около 5 mMHOS на 1 см. По окончании загрузки образца смолу FFQ промывают уравновешивающим буферным раствором в количестве, равном трем объемам колонки. Активность dDAP элюируют из смолы, используя линейный градиент NaCl от 0 до 1 М, 50 мМ буфер Tris, рН 7, в количестве, равном 10 объемам колонки, со скоростью 50 см/ч. Размер фракции составляет 0,1 от объема колонки. Далее колонку с FFQ элюируют 1,0 М раствором NaCl в 50 мМ буфера Tris, рН 7, в количестве трех объемов колонки. Эффлюент контролируют по электропроводности и поглощению при 280 нм и фракции подвергают анализу на активность dDAP по их способности расщеплять колориметрический субстрат Gly-Phe-п-нитроанилид (GFpNA) при рН 3,5. Целевую фракцию составляют, объединяя фракции, содержащие приблизительно 90% общей активности dDAP, подвергнутой элюированию. Активность dDAP элюируется в виде одиночного пика в количестве около двух объемов колонки. Целевую фракцию подкисляют до рН 3,5 10%-ным раствором HCl. Подкисленную целевую фракцию после FFQ хранят при 4^oC не более двух дней.

Г. Хроматография гидрофобных взаимодействий
Подкисленную целевую фракцию после FFQ далее очищают методом хроматографии гидрофобных взаимодействий (HlC) на смоле Pharmacia Phenyl Sepharose Fast Flow. Объем колонки составляет одну треть от объема колонки для ионообменной хроматографии. Помещают около 650 единиц активности на 1 л смолы, а загрузка белка составляет 4 г на 1 л смолы (1 единица поглощения при 280 нм соответствует 1 мг/мл белка). Целевая фракция после FFQ была подготовлена для загрузки в колонку HlC прибавления сульфата аммония в количестве 140 г на 1 л, рН доводят до 3,5, при этом окончательная электропроводность составляет около 90 mMHOS на 1 см. Колонку HlC уравновешивают 50 мМ цитратным буфером, рН 3,5, содержащим сульфат аммония в количестве не менее 140 г на 1 л. Загрузку осуществляют с линейной скоростью потока 40 см/ч и промывают смолу уравновешивающим буфером в количестве не менее трех объемов колонки. Активность dDAP элюируют из смолы, используя линейный градиент сульфата аммония от 140 г на 1 л до 0 г на 1 л в 50 мМ цитратном буфере, рН 3,5, в количестве, равном 10 объемам колонки, со скоростью 40 см/ч. Далее колонку промывают 50 мМ раствором цитратного буфера, рН 3,5, в количестве, равном трем объемам колонки. Размер фракции составляет 0,1 объема колонки. Эффлюент контролируют по электропроводности и поглощению при 280 нм и фракции подвергают анализу на активность dDAP по их способности расщеплять GFpNA при рН 3,5. Целевую фракцию составляют, объединяя фракции, содержащие приблизительно 90% общей активности dDAP, подвергнутой элюированию. Активность dDAP элюируется в виде одиночного пика в количестве около двух объемов колонки. Целевую фракцию подкисляют до рН 3,5 10%-ным раствором HCl или 10%-ным раствором NaOH. Целевую фракцию после HlC хранят при 4^oC не более одного дня до начала проведения превращений.

Д. Хроматография по размеру молекул
Целевую фракцию после HlC подвергают далее хроматографиии по размеру молекул (SEC) на носителе S-200 Sepharose HR. Объем колонки вдвое превышает объем HlC колонки с высотой основания 78 см. Целевую фракцию после HlC готовят для SEC колонки концентрированием целевой фракции после HlC в ультрацентрифуге с использованием мембраны, отсекающей мол. м. 10000 Да. Целевую фракцию после HlC концентрируют до уровня 2,5% от объема SEC колонки и остаток выделяют из ультрацентрифуги. Узел ультрацентрифуги промывают 50 мМ раствором цитратного буфера, рН 3,5, в количестве 2,5% от объема SEC колонки. Остаток и промывочный раствор объединяют, получая конечный концентрат и доводят его рН до 3,5 с помощью 10%-ного раствора HCl или 10%-ного раствора NaOH. Электропроводность конечного концентрата составляет около 30 mMHOS на 1 см. SEC колонку уравновешивают раствором 50 мМ уксусной кислоты, 20 мМ хлористого натрия, рН 3,5, имеющего электропроводность около 2 mMHOS на 1 см. Загрузку конечного концентрата осуществляют с линейной скоростью потока 15 см/ч и активность dDAP элюируют из смолы, используя уравновешивающий буферный раствор в количестве, равном одному объему колонки. Размер фракции составляет 0,02 объема колонки. Эффлюент контролируют по электропроводности и поглощению при 280 нм и фракции подвергают анализу на активность dDAP по их способности расщеплять GFpNA при рН 3,5. Целевую фракцию составляют, объединяя фракции, содержащие приблизительно 90% общей активности dDAP, подвергнутой элюированию. Активность dDAP элюируется в виде одиночного пика в количестве около 0,08 объема колонки. Целевую фракцию после SEC можно сохранять при 4^oC в течение нескольких месяцев.

Очистка dDAP с использованием комбинации ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии по размерам молекул приводит к материалу, который перемещается в виде широкой полосы в SDS PAGE. Полоса перемещается к точке на геле, которой соответствует молекулярный эквивалент стандартного альбумина сыворотки быка (66 кДа). Этот белок подкрашивают красителем ISS Pro-blue. На картину перемещения в процессе приготовления образца не оказывает влияние присутствие или отсутствие 0,1 М DTT (плюс температура 100^oC в течение 5 мин). Субблочная мол. м. DAP-I быка, определенная по методу SDS-PAGE, составляет 22000 Да.

Пример 3. Активность dDAP
А. Реакции конверсии
1. Расщепление GF-pNA
Активность dDAP обычно контролируют по следующей реакции расщепления хромогенного субстрата Gly-Phe-п+-нитроанилида (GF-pNA). Как правило, анализ проводят 11-кратным разбавлением фермента в 1,0 мл 4 мМ раствора GFpNA с рН 3,5. Скорость расщепления GF дипептида контролируют при 37^oC, измеряя увеличение поглощения при 405 нм. В этих условиях одна единица активности приводит к изменению оптической плотности на 0,90 единиц за 1 мин. Оценку величины единица/мл можно провести, приняв коэффициент экстинкции свободной pNA равным 9,9 мМ^-1см^-1 при 405 нм.

Профиль ингибирования dDAP по отношению к субстрату GF-pNA сравнивали с соответствующей характеристикой DAP-I быка, используя иодоацетамид и тетратионат натрия, агенты, модифицирующие SH-группы, которые, как известно, ингибируют активность DAP-I. Образцы dDAP или DAP-I из селезенки быка выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре в растворах обоих ингибиторов с концентрациями 0; 0,5; 5,0 или 50 мМ при рН 7 в 100 мМ раствора буфера Tris. Затем проводят 21-кратное разбавление выдержанных растворов в 4 мМ растворе GF-pNA с рН 3,5. Скорость расщепления контролируют, измеряя увеличение поглощения при 405 нм при 37^oC. В случае DAP-I скорость расщепления GF-pNA уменьшается более чем на 90% при обработке 5 мМ иодоацетамидом и на 95% ингибируется действием 5 мМ тетратионата натрия. Не наблюдается существенного ингибирования dDAP при действии любых использованных при испытании уровней концентрации иодоацетамида или тетратионата.

Оптимальные рН для расщепления GF-pNA с использованием dDAP определяют, изменяя кислотность буферного раствора, содержащего Tris, фосфат и цитрат, с помощью 10%-ного раствора HCl или 10%-ного раствора NaOH в интервале от 3 до 8. Фермент dDAP подвергают 20-кратному разбавлению в 100 мМ растворе цистамина и 10мМ NaCl. DAP-I быка подвергнут 200-кратному разбавлению в том же буфере. Готовят раствор субстрата GF-pNA (4 мМ) в 2%-ном ДМФА. В микролитровой кювете объединяют 0,025 мл буфера Tris /фосфат/цитрат с различными значениями рН, 0,1 мл разбавленного фермента и 0,1 мл раствора субстрата. Скорость увеличения поглощения при 410 нм определяют в течение 30 мин. Результаты показывают, что оптимальный рН для dDAP при расщеплении GF-pNA находится в интервале от 3,5 до 4,0.

2. Расщепление Gly-Arg-pNA
4 Мм Gly-Arg-hNA (GR-pNA) готовят в 50 мМ уксусной кислоты и 50 мМ глицинового буфера, рН 5. Для получения разнообразных значений рН в интервале от 5,1 до 2,3 используют HCl или NaOH. К 180 ед/л полученного буферного раствора субстрата прибавляют 5 ед/л dDAP (конечная концентрация соответствует 49 миллиед. /мл). Контролируют скорость увеличения поглощения при 410 нм и сопоставляют ее с рН реакционной смеси. Как и в случае GF-pNA, оптимум рН для субстрата GF-pNA составляет около 3,5. При использовании данного субстрата фермент проявляет незначительную активность при рН менее 2,5 и рН более 5.

3. Расщепление Arg-Arg-B-нафтиламида (RR-BNA)
Готовят раствор приблизительно 0,25 мМ RR-BNA или 0, 25 мМ бензилоксикарбонил-RR-BNA либо в 100 мМ уксусной кислоты, рН 3,5, или 100 мМ цитратного буфера, рН 5,0. К 2 мл субстрата прибавляют dDAP или DAP-I быка (в виде раствора 15 миллиед./мл). Контролируют скорости расщепления (контроль проводят по усилению флюоресценции при 410 нм при возбуждении светом с длиной волны 340 нм). DAP-I быка не в состоянии расщепить ни один из этих субстратов. Неожиданно dDAP оказывается способным эффективно расщеплять субстрат RR-BNA, dDAP не в состоянии расщепить Z-RR-BNA субстрат с заблокированной аминогруппой, что подтверждает вывод о том, что dDAP является ферментом типа ДАП. Оптимальное значение рН устанавливают путем контроля скорости расщепления RR-BNA с использованием буферной системы, состоящей из 50 нМ уксусной кислоты и 50 мМ цитрата. Различные величины рН достигаются с помощью HCl или NaOH и к 1,5 мл полученных растворов прибавляют 0,5 мл 1 мМ раствора RR-BNA (конечная концентрация составляет 0,25 мМ). Прибавляют dDAP и определяют скорость расщепления. Оптимальное значение рН для расщепления RR-BNA составляет 4,5, при этом значительная активность наблюдается во всем изученном диапазоне (рН от 3,5 до 5,7). Этот удивительный результат говорит о том, что dDAP обладает некоторыми свойствами, присущими DAP-III.

Опытный экспериментатор должен признать, что оптимальное значение рН для расщепления субстрата зависит не только от фермента, но и самого субстрата, т. е. состава удаляемого дипептида, а также самой индикаторной группы. Например, при использовании dDAP Gly-Arg-pNA имеет оптимальное значение рН около 3,5, в то время как оптимальное значение рН для расщепления Gly-Arg-7-амидо-4-метилкумарина составляет около 5, что свидетельствует о том, что указанная группа может влиять на свойства при расщеплении.

Б. Превращения синтетических октапептидов и декапептидов
Октапептид Met-Asp-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu растворяют для получения раствора с концентрацией 4мМ в растворе 50 мМ уксусной кислоты, рН 3,5. Полученный раствор разбавляют 1:1 с помощью dDAP (10 миллиед./мл) и выдерживают при комнатной температуре в течение 6 ч. Прекращают реакцию 20-кратным разбавлением реакционной массы в 7 М растворе мочевины, содержащем 1% фосфорной кислоты. Взятые из полученной смеси пробы анализируют методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC) с обращенной фазой. Продукты расщепления сравнивают со стандартами, приготовленными из октапептида, дипептида Met-Asp и гексапептида Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu, dDAP легко выделяет дипептид Met-Asp у свободного аминного конца октапептида, но не может также легко расщепить образующийся дипептид Phe-Pro.

Синтезированный декапептид Met-Arg-Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu получают в виде исходного 1,7 мМ раствора в растворе 100 мМ глицина, рН 3,5. К 0,5 мл этого раствора прибавляют 8 мкл раствора, содержащего 6,4 миллиед./мл dDAP (готовят в растворе 100 мМ глицина, рН 3,5). Каждый час 5 мкл образовавшегося раствора непосредственно инжектируют в HPLC хроматографическую систему с обращенной фазой для контроля продуктов расщепления. Для сравнения независимо инжектируют дипептиды Met-Arg и Met-Tyr, а также пептиды Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu и Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu. dDAP легко выделяет дипептид Met-Arg из декапептида, а также образующийся дипептид Met-Tyr. Это свидетельствует о том, что с помощью dDAP дипептиды у аминного конца могут быть удалены последовательно.

В. Превращения гормона роста человека Met-Asp
Гормон роста человека Met-Asp (Met-Asp-hGH) получают в виде нерастворимого белка в цитоплазме E. coli. Нерастворимый белок солюбилизируют, свертывают с целью получения Met-Asp-hGH с нужными дисульфидными связями и очищают ионообменной хроматографией. Заменяют растворитель и доводят рН среды до 3,5. Met-Asp-hGH нагревают до 37^oC и определяют поглощение при 280 нм. Прибавляют dDAP в количестве 6 миллиединиц на каждый грамм Met-Asp-hGH. Позволяют реакции превращения протекать при 37^oC при перемешивании в течение от 4 до 6 ч. Протекание реакции может быть без ущерба замедленно путем использования меньшего количества фермента, более низкой температуры или меньшей концентрации Met-Asp-hGH. Скорость реакции можно увеличить, добавляя большее количество фермента, увеличивая концентрацию Met-Asp-hGH или температуру реакции. Ход реакции превращения контролируют хроматографией с обращенной фазой, реакцию превращения прерывают быстрым прибавлением NaOH при перемешивании до уровня рН 8 и прибавлением 30%-ного раствора ацетонитрила. Продукт реакции, гормон роста человека, полученный после действия dDAP, подвергают широкой серии аналитических процедур, включающих пептидное картографирование, определение последовательности аминокислот у N-конца, масс-спектрометрию, анализ на аминокислоты и хроматографию с обращенной фазой (HPLC). Все полученные данные указывают на то, что с помощью dDAP был получен продукт, аутентичный гормону роста человека.

Г. Превращения проинсулина человека Met-Arg
Проинсулин человека Met-Arg (Met-Arg-hPl) получают в виде нерастворимого белка в цитоплазме E.coli. Нерастворимый белок солюбилизируют в 7 М растворе мочевины. Белок очищают ионообменной хроматографией. Met-Arg-hPl сульфируют, заменяют растворитель и свертывают с целью образования нативных пар дисульфидных связей и нативной третичной структуры. Полученный образец очищают далее методом хроматографии с обращенной фазой. С помощью перекиси водорода из Met-Arg-hPl получают окисленный метионил (Met(0))-Arg-hPl, который далее подвергают очистке хроматографией с обращенной фазой и лиофилизации.

Концентрация полученного Met-Arg-hPl составляет приблизительно 24 мг/л (в растворе глицинового буфера с концентрацией около 20 мМ, рН 3,5). Приблизительно 2,4 мг этого материала выдерживают с 0,19 миллиединицами dDAP при рН 3,5. Реакция протекает при комнатной температуре. Время от времени отбирают аликвоты и разбавляют их 10%-ным раствором фосфорной кислоты. Полученные образцы инжектируют в HPLC систему с нейтральной обращенной фазой с целью контроля исчезновения Met-Arg-hPl или Met(0)-Arg-hPl и соответствующего получения hPl. Далее, аликвоты разбавляют подходящим разбавителем с целью контроля методом HPLC за появлением дипептидов Met-Arg или Met(0)-Arg. Приблизительно 60% Met-Arg-hPl в течение 8 ч было превращено в hPl. Неожиданно похожий результат был получен и в случае превращения Met(0)-Arg-hPl, т.е. был выделен hPl. Скорости расщепления обоих субстратов одинаковы. Это результат удивителен, так как DAP-I быка не может расщеплять Met(0)-X производные hPl, где Х Arg, Phe или Tyr. Анализ методом обращенной фазы с дипептидом Met-Arg в качестве свидетеля также подтверждает, что дипептид Met-Arg выделен из Met-Arg-hP, а в случае эксперимента с субстратом Met(0)-Arg-hPl в области пика дипептида Met-Arg появляется пик, который может быть отнесен к дипептиду Met(0)-Arg. Способность dDAP расщеплять окисленный субстрат Met(0)-X предоставляет ему значительные преимущества над ферментами, которые не могут проводить подобных расщеплений.

Д. Превращения аналога проинсулина человека Met-Arg
Фермент dDAP был также использован для эффективного превращения аналога проинсулина Met-Arg (B28 Lys, B29 Pro), а также аналога проинсулина - Met-Arg (B10 ASp, des B28-B30). Эти реакции проводят в полном соответствии с методиками, приведенными при описании превращений Met-Arg-hPl.

Реферат

Использование: биотехнология, генная инженерия. Сущность изобретения: дипептидиламинопептидаза, выделенная из клеточного слизневого грибка Dictyostelium discoideum АТСС 28368 имеет молекулярный вес около 225000 Да и способна отщеплять аминоконцевой дипептид Met-Tyr, Met-Arg или Met-Asp от соответствующей полипептидной последовательности; ферментативное отщепление указанного дипептида проводят при рН от 2,5 до 5,5, температуре от 15 до 45^oC и в течение 1 мин - 24 ч в зависимости от природы используемого субстрата. 2 с. и 4 з. п. ф-лы.

Формула