Слитые белки fmdv-e2 и их применение - RU2714428C2

Чертежи

Показать все 16 чертежа(ей)

Описание

Отсылки к родственным заявкам

Для настоящей заявки испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США № 62/259,043, поданной 23 ноября 2015 г.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к композициям, предназначенным для борьбы с заражением вирусом ящура (FMDV) животных. Предлагаются фармацевтические композиции, содержащие антиген FMDV, способы вакцинации животных против инфекции FMDV, способы получения антигенов FMDV и наборы для применения этих способов и композиций.

Уровень техники

Ящур (FMD) является одним из самых вирулентных и контагиозных инфекционных заболеваний, поражающих животных. Во многих странах это заболевание эндемично, особенно в Африке, Азии и Южной Америке. Кроме того, периодически случаются эпидемические вспышки. Наличие ящура в стране может иметь весьма серьезные экономические последствия, вытекающие из того, что эта болезнь приводит к потере продуктивности, снижению массы тела и продукции молока в зараженных стадах, а также из того, что на такие страны накладывается запрет торговли животноводческой продукцией. Мероприятия, предпринимаемые для борьбы с этим заболеванием, включают строгое ограничение импорта, санитарный контроль и карантин, забой больных животных и программы вакцинации, предполагающие применение вакцин на основе инактивированного возбудителя для профилактики в общегосударственном или региональном масштабе и для периодического вакцинирования при эпидемических вспышках.

Ящур отличается коротким инкубационным периодом, высокой контагиозностью, язвочками на слизистой оболочке ротовой полости и в области межкопытной щели на конечностях и иногда смертью молодых животных. Вирус ящура поражает многие виды животных, в том числе, в частности крупный рогатый скот, свиней, овец и коз. Возбудителем заболевания является РНК-вирус, относящийся к роду Aphthovirus семейства Picornaviridae (Cooper et al., 1978, Intervirology 10, 165-180). В настоящее время известно по меньшей мере семь типов вирусов, вызывающих ящур (FMDV): европейские типы (A, O и C), африканские типы (SAT1, SAT2 и SAT3) и азиатский тип (Asia 1). Среди них различают также ряд подтипов (Kleid et al., 1981, Science 214, 1125-1129).

FMDV представляет собой лишенный оболочки икосаэдрический вирус диаметром около 25 нм, содержащий молекулу РНК, состоящую из около 8500 нуклеотидов, с положительной полярностью. Эта молекула РНК содержит одну открытую рамку считывания, кодирующую единичный полипептид, включающий, в частности, предшественник капсида, известный также как белок P1 или P88. Белок P1 на своем N-конце миристилирован. В процессе созревания белок Р1 расщепляется протеазой 3С на три белка, обозначаемые VP0, VP1 и VP3 (или 1AB, 1D и 1C соответственно; Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). В вирионе белок VP0 расщепляется на два белка - VP4 и VP2 (или 1A и 1B соответственно). Механизм превращения VP0 в VP1 и VP3 и формирования зрелых вирусных частиц неизвестен. Молекулярная масса белков VP1, VP2 и VP3 составляет около 26 000 Дa, тогда как у белка VP4 меньше - около 8000 Дa.

В попытках разработать эффективные вакцины против ящура предлагались различные гипотезы, пути исследования и предположения. В работе Cao et al. (Antiviral Research, 2013, 97:145-153; Veterinay Microbiology, 2014, 168:294-301) сообщалось о разработке специфичных к эпитопам белков, обладающих иммуногенностью против заражения FMDV. Было доказано, что синтетический полипептид, в котором слиты один Т-клеточный эпитоп и два В-клеточных эпитопа азиатского серотипа вируса ящура, вызывает защитный ответ (Ren et al., Vaccine, 2011, 29:7960-7965).

В настоящее время в продаже имеются только вакцины на основе инактивированного вируса ящура. Безопасность этих вакцин против FMDV вызывает опасения, поскольку вспышки FMD в Европе были связаны с несовершенством изготовления вакцин (King, A.M.Q. et al., 1981, Nature, 293: 479-480). Вакцины на основе инактивированного возбудителя не дают длительного иммунитета, так что при эпидемических вспышках заболевания требуются бустерные прививки раз в год или чаще. Кроме того, риск связан с неполнотой инактивации вируса и/или с утечкой вируса в процессе получения инактивированных вирионов (King, A.M.Q., там же).

Недавно для получения белков вируса иммунодефицита человека типа 1 (HIV-1) использовали в качестве опорной структуры субъединицу Е2 дегидрогеназного мультиферментного комплекса (Caivano et al., 2010, Virology, 407:296-305; Krebs et al., PLOS One, 2014, DOI:10.1371/journal.pone.0113463; Schiavone et al., 2012, Int. J. Mol. Sci., 13:5674-5699). Пируватдегидрогеназные (PDH) комплексы – это многофункциональные ферментные комплексы, включающие три основных фермента: тиамин-зависимую пируватдекарбоксилазу (E1), дигидролипоил-ацетилтрансферазу (E2) и флавопротеин-дигидролипоилдегидрогеназу (E3) (Lengyel et al., Structure, 16:93-103, 2008). Было обнаружено, что шестьдесят копий полипептида E2 из PDH-комплекса Bacillus stearothermophilus образуют пентагональную додекаэдрическую опорную структуру, которую можно модифицировать так, чтобы она имела на своей поверхности «чужие» белки и пептиды (Domingo et al., 2001, J. Mol. Biol., 305:259-267). В работе Dalmau et al. (Biotechnology and Bioengineering, 101(4):654-664, 2008) описаны мутантные варианты E2 PDH, оптимизированные для экспрессии в клетках Escherichia coli. В работе D’Apice et al. (Vaccine, 25:1993-2000, 2007) обсуждается экспрессия эпитопов, распознаваемых хелперными Т-лимфоцитами, в трех носителях: филаментном фаге fd, белке E2 комплекса PDH и белке CotC оболочки спор Bacillus subtilis.

Учитывая восприимчивость животных и человека к FMDV, подчеркнем, что метод предотвращения этой инфекции и защиты животных очень важен. Соответственно, имеется насущная потребность в эффективной, безопасной и несложной в изготовлении вакцины против FMDV.

Раскрытие изобретения

Предлагаются композиции, содержащие антигенный полипептид FMDV и его фрагменты и варианты. Антигены FMDV, их фрагменты и варианты обладают иммуногенностью и, соответственно, защитными свойствами. Антигены FMDV могут быть получены в виде слитого белка, включающего E2 Geobacillus stearothermophilus. Слитые белки FMDV по данному изобретению формируют частицы, имеющие сходство с природными вирионами FMDV или вирусоподобными частицами (VLP).

Антигенные полипептиды, их фрагменты и варианты могут быть включены в состав вакцин и/или фармацевтических композиций. Такие вакцины можно использовать для прививки животных и создания защиты от по меньшей мере одного штамма FMDV.

Способы по данному изобретению включают способы получения антигенных полипептидов. Эти способы включают способы получения антигенов или антигенных полипептидов, слитых с белком E2 из Geobacillus stearothermophilus. По данному изобретению предлагается способ получения эффективных и безопасных вакцин путем конструирования конформационно адекватных иммуногенов без инфекционного генома FMDV. Этот способ без особых сложностей обеспечивает экспрессию антигенов FMDV in vitro, реплицирующихся и имитирующих конформацию природных и аутентичных вирионов FMDV или вирусоподобных частиц, которые сложно устроены и с трудом поддаются получению.

В число способов по данному изобретению входят также способы применения, включающие введение животному эффективного количества антигенного полипептида, его фрагмента или варианта для индуцирования в его организме защитной иммунологического ответа. Коль скоро антигенный полипептид получен, его можно частично или полностью очистить, чтобы использовать для изготовления вакцины.

Также предлагаются наборы, включающие по меньшей мере один антигенный полипептид, или его фрагмент, или вариант, и инструкции по применению.

Краткое описание фигур

Изложенное ниже подробное описание носит иллюстративный характер и не предназначено для ограничения изобретения приведенными в настоящем документе его конкретными воплощениями; для большей ясности изложения описание сопровождается следующими фигурами.

Фиг. 1 представляет таблицу, описывающую последовательности ДНК и белковые последовательности.

Фиг. 2A-2F представляет последовательности ДНК и белковые последовательности и выравнивание последовательностей.

Фиг. 3 представляет результаты вестерн-блоттинга и дот-блоттинга экспрессированного слитого белка FMDV-E2.

Фиг. 4A-4C представляет изображения полученных частиц FMDV-E2.

Фиг. 5 представляет результаты непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) частиц E2-FMDV.

Фиг. 6 представляет результаты определения плазматических клеток на 27-й день эксперимента по иммунизации вакцинами O1M.

Фиг. 7 представляет результаты определения плазматических клеток на 42-й день эксперимента по иммунизации вакцинами O1M.

Фиг. 8 представляет результаты определения γ-интерферона методом иммуноферментных пятен (ELISpot) на 27-й день эксперимента по иммунизации вакцинами O1M.

Фиг. 9 представляет результаты определения γ-интерферона методом иммуноферментных пятен (ELISpot) на 42-й день эксперимента по иммунизации вакцинами O1M.

Фиг. 10 представляет результаты определения В-клеток памяти на 42-й день эксперимента по иммунизации вакцинами O1M.

Фиг. 11 представляет результаты по вакцине O1 Manisa против FMDV.

Осуществление изобретения

Предлагаются композиции, содержащие полипептид FMDV, его антиген, фрагменты и варианты, вызывающие иммунологическую реакцию у животного. Антигенные полипептиды, или их фрагменты, или варианты получают в виде слитых или химерных белков, включающих E2 Geobacillus stearothermophilus. Антигенные полипептиды, или их фрагменты, или варианты могут входить в состав вакцин или фармацевтических композиций и служат для того, чтобы вызывать или стимулировать в организме животного защитную реакцию. В одном из воплощений данного изобретения антигенный полипептид представляет собой синтетические антигены VP1 FMDV, или их активные фрагмент, или вариант.

Антигенные полипептиды или антигены по данному изобретению могут быть полноразмерными полипептидами, или же их активными фрагментами, или вариантами. Термины «активный фрагмент» или «активный вариант» в настоящем документе означают фрагменты или варианты, сохраняющие антигенные свойства исходного полипептида. Таким образом, данным изобретением охватываются любые полипептиды, антигены, эпитопы или иммуногены FMDV, вызывающие иммунологическую реакцию в организме животного. Полипептидом, антигеном, эпитопом или иммуногеном FMDV по данному изобретению может быть любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, например (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера) белок, пептид, или их фрагмент, или вариант, который вызывает, индуцирует или стимулирует ответную реакцию в организме животного, например овцы, быка, козы или свиньи.

Конкретные антигенные полипептиды FMDV включают VP1 FMDV. FMDV представляет собой икосаэдрический вирус, лишенный оболочки, диаметром около 25 нм, содержащий однонитевую молекулу РНК, состоящую из около 8500 нуклеотидов, с положительной полярностью. Эта молекула РНК содержит одну открытую рамку считывания, кодирующую единичный полипептид, включающий, в частности, предшественник капсида, известного как белок P1 или P88. Белок P1 на своем N-конце миристилирован. В процессе созревания белок Р1 расщепляется протеазой 3С на три белка, обозначаемые VP0, VP1 и VP3 (или 1AB, 1D и 1C соответственно; Belsham G. J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). В вирионе белок VP0 расщепляется на два белка - VP4 и VP2 (или 1A и 1B соответственно). Механизм превращения VP0 в VP1 и VP3 и формирования зрелых вирусных частиц неизвестен. Молекулярная масса белков VP1, VP2 и VP3 составляет около 26 000 Дa, а у белка VP4 меньше - около 8000 Дa.

Простое сочетание капсидных полипептидов дает протомер или молекулу 5S, который является элементарной структурной единицей капсида FMDV. Из таких протомеров формируется пентамер с образованием молекулы 12S. Вирион образуется в результате заключения молекулы РНК внутрь капсида из двенадцати пентамеров 12S, тем самым составляя частицы 146S. Возможно образование вирусных капсидов, внутри которых нет РНК (здесь и далее «пустой капсид»). Пустой капсид FMDV также обозначается как частица 70S. Образование пустых капсидов может происходить естественным путем в процессе репликации вируса или его можно вызвать искусственно путем химической обработки.

Данное изобретение относится к предназначенным для крупного рогатого скота, коз, овец или свиней вакцинам или композициям, содержащим эффективное количество антигена FMDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, вспомогательное вещество (адъювант) или несущую среду.

В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемые вакцины также содержат адъюванты, например, эмульсии типа «масло в воде» (O/W), описанные в патенте США № 7,371,395.

В других воплощениях данного изобретения адъюванты включают продукт EMULSIGEN, гидроксид алюминия, сапонины и CpG-мотивы или их комбинации.

В некоторых воплощениях данного изобретения ответная реакция в организме животного является защитным иммунным ответом.

Термин «животное» в настоящем документе включает млекопитающих, птиц и др. Животные, или организмы-хозяева включают млекопитающих, в том числе, парнокопытных и человека. Животное по данному изобретению выбирают из группы, состоящей из представителей семейств лошадиных (например, лошади), собачьих (например, собак, волков, лисиц, койотов, шакалов), кошачьих (например, львов, тигров, домашних кошек, диких кошек и других больших кошек и представителей кошачьих, в том числе гепарда и рыси), овечьих (например, овец), бычьих (например, крупного рогатого скота), свинообразных (например, свиньи), козьих (например, козы), птичьих (например, куриц, уток, гусей, индеек, куропаток, фазанов, попугаев, вьюрков, хищных птиц, ворона, страуса и казуара), приматов (например, полуобезьян, в том числе, долгопята, мартышки, гиббона и крупных человекообразных обезьян) и рыб. Термин «животное» в настоящем документе включает также понятие отдельной особи на всех стадиях индивидуального развития, в том числе, стадиях эмбриона и зародыша.

Все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, употребляются (если не оговорено иного) в общепринятых значениях, понятных рядовому специалисту в той области техники, к которой относится данное изобретение. Единственное число включает значение множественного числа, если только из контекста не следует с очевидностью иного. Союз «или» включает значение «и», если только из контекста не следует с очевидностью иного.

Отметим, что в настоящем описании и, в частности, в формуле изобретения и/или в основном тексте выражения «содержит», «содержавший», «содержащий» и т.п. могут иметь значение, придаваемое им патентным правом США, а именно, они могут значить «включает», «включавший», «включающий» и т.п., а такие выражения, как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из», имеют значение, придаваемое им патентным правом США, а именно, допускают элементы, не перечисленные явным образом, но исключают элементы, присутствующие в ранее достигнутом уровне техники или влияющие на основные либо новые отличительные признаки изобретения.

Антигенные полипептиды по данному изобретению способны защищать от FMDV. Это значит, что они способны стимулировать иммунный ответ у животного. Термины «антиген» или «иммуноген» подразумевают субстанцию, вызывающую специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может представлять собой целый организм – живой, ослабленный или убитый; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; участок или фрагмент ДНК, который, будучи предъявлен животному-хозяину, способен вызывать у него иммунный ответ; полипептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Или же иммуноген или антиген представляют собой токсин или антитоксин.

Термин «иммуногенный белок, полипептид или пептид» в настоящем документе включает полипептиды, являющимися иммунологически активными в том смысле, что, будучи введены в организм животного-хозяина, способны вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ, направленный против данного белка, полипептида или пептида. Предпочтительно фрагмент белка является таким, что обладает в основном той же иммунологической активностью, что и полноразмерный белок. Таким образом, фрагмент белка по данному изобретению содержит по меньшей мере один эпитоп, или антигенную детерминанту либо состоит по меньшей мере из одного эпитопа, или антигенной детерминанты. Термин «иммуногенный» белок или полипептид в настоящем документе включает полноразмерную аминокислотную последовательность данного белка, ее аналоги или иммуногенные фрагменты. Термин «иммуногенный фрагмент» означает фрагмент белка, включающий один или более эпитопов и потому вызывающий иммунологическую реакцию, описанную выше. Такие фрагменты можно идентифицировать с помощью хорошо известных в данной области техники методов картирования множества эпитопов; см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Линейные эпитопы можно определить, например, синтезировав на твердой подложке множество пептидов, которые соответствуют участкам белковой молекулы, и изучив взаимодействие этих пептидов, иммобилизованных на подложке, с антителами. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 4,708,871 и в работах Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. Аналогично, конформационные эпитопы нетрудно идентифицировать путем определения пространственного расположения аминокислотных остатков, составляющих данный белок, например, с помощью методов рентгеновской кристаллографии и двумерной ЯМР-спектроскопии; см., например, указанную выше работу Epitope Mapping Protocols, supra.

Как говорилось, данное изобретение охватывает активные фрагменты и варианты антигенного полипептида. Таким образом, термин «иммуногенный белок, полипептид или пептид» также охватывает делеции, вставки и замены в аминокислотной последовательности до тех пор, пока при этих изменениях данный полипептид сохраняет способность вызывать иммунологическую реакцию, как это определено в настоящем документе. Термин «консервативная замена (вариация)» означает, что в аминокислотной последовательности белка тот или иной аминокислотный остаток заменен на другой, но близкий по биологическим свойствам, или в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты некоторый нуклеотид заменен на такой, что кодируемой аминокислотный остаток остается прежним или представляет собой биологически схожий остаток. В этой связи особенно предпочтительными заменами являются в целом консервативными в природе, то есть те замены, которые имеют место в пределах семейства аминокислот. Аминокислоты обычно разделяют на четыре группы: (1) кислотные (аспарагиновая и глутаминовая кислоты); 2) основные (лизин, аргинин, гистидин); (3) неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и (4) незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин). Иногда фенилаланин, триптофан и тирозин выделяют в группу ароматических аминокислот. Примеры консервативных замен включают замену одного гидрофобного остатка, например изолейцина, валина, лейцина или метионина, на другой тоже гидрофобный остаток, или замену одного полярного остатка на другой полярный, например аргинин на лизин, глутамат на аспартат, или глутамин на аспарагин и т.п.; или похожую консервативную замену аминокислотного остатка на структурно родственный аминокислотный остаток, что не влияет существенно на биологическую активность. Термин «референсный полипептид», таким образом, охватывает белки, аминокислотные последовательности которых в основном такие же, как у референсной белковой молекулы, но содержат небольшие аминокислотные замены, не влияющие существенно на иммуногенность белка. В настоящий документ включаются все полипептиды, полученные путем таких модификаций. Термин «консервативная замена» также охватывает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной родительской аминокислоты, при условии, что антитела, индуцированные полипептидом с заменами, имеют иммунологическую реактивность с полипептидом без аминокислотных замен.

Термин «эпитоп» относится к тому участку антигена или гаптена, на который специфично реагируют В- и/или Т-лимфоциты. Этот термин употребляется взаимозаменяемо с термином «антигенная детерминанта» или «антигенный сайт». Антитела, узнающие один и тот же эпитоп, можно идентифицировать путем несложного иммунологического анализа, демонстрирующего способность одних антител блокировать связывание других антител с антигеном-мишенью.

Иммунологическая реакция организма-хозяина на вакцину или композицию – это развитие клеточного и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на вакцину или композицию, представляющую интерес. Как правило, «иммунологическая реакция» включает (но не ограничивается перечисленным здесь) следующие феномены: образование антител, В-лимфоцитов, хелперных Т-лимфоцитов и/или цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных в отношении антигена или антигенов, входящих в состав вакцины или композиции, представляющей интерес. Предпочтительно в организме-хозяине развивается терапевтическая или защитная иммунологическая реакция, так что усиливается сопротивление новому заражению и/или снижается степень тяжести клинических симптомов заболевания. Такая защита проявляется ослаблением или отсутствием симптомов, обычно возникающих при данной инфекции, более быстрым выздоровлением и/или пониженным титром вируса в тканях организма-хозяина.

В приведенное выше определение эпитопа входят также синтетические антигены, например, полиэпитопы, эпитопы, фланкирующие определенные аминокислотные последовательности, и другие полученные синтетическим или рекомбинантным путем антигены. Для целей данного изобретения иммуногенные фрагменты антигенной молекулы обычно включают по меньшей мере около трех аминокислотных остатков, по меньшей мере около пяти аминокислотных остатков, по меньшей мере около 10-15 аминокислотных остатков или около 15-25 или более аминокислотных остатков. Верхняя граница длины фрагмента не является критичной, так что фрагмент может представлять собой почти полноразмерную аминокислотную последовательность антигенного белка или даже слитый белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп данного белка.

Соответственно, минимальная структура полинуклеотида, нужного для экспрессии эпитопа, содержит нуклеотиды, последовательность которых кодирует эпитоп, или антигенную детерминанту полипептида FMDV (или состоит из этих нуклеотидов, или в основном состоит из них). Полинуклеотид, кодирующий фрагмент полипептида FMDV, содержит или состоит из по меньшей мере 15, около 30-45, около 45-75 или по меньшей мере 57, 87 или 150 последовательно и непрерывно расположенных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, кодирующей данный полипептид.

Термин «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотид» относится к линейным или разветвленным, одноцепочечным или двухцепочечным, или к гибридным молекулам рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Этот термин также охватывает гибридные молекулы РНК/ДНК. Примеры полинуклеотидов (не ограничивающиеся перечисленным здесь) включают ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), рибосомную РНК (рРНК), рибозимы, комплементарную ДНК (кДНК), рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенную ДНК с любой последовательностью, выделенную РНК с любой последовательностью, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, например метилированные нуклеотиды, или аналоги нуклеотидов, урацил, другие сахара или связующие группы, например фторрибозу и тиолат, и разветвления нуклеотидной цепи. Нуклеотидная последовательность после полимеризации может быть модифицирована далее, например, путем конъюгации с компонентом-меткой. Другие варианты модификации включают кэпирование, замену одного или более природных нуклеотидов на аналог, введение средств для присоединения полинуклеотида к белкам, ионам металлов, метящим компонентам, другим полинуклеотидам или к твердой подложке. Полинуклеотиды можно получить путем химического синтеза или выделить из микроорганизмов.

Термин «ген» употребляется в весьма широком смысле в отношении любой части полинуклеотида, связанной с какой-либо биологической функцией. Таким образом, в понятие «ген» входят интроны и экзоны как в составе геномной последовательности, так и как обычные кодирующие последовательности в кДНК и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, термин «ген» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональные РНК, или который кодирует определенный белок, и который включает регуляторные последовательности.

Термины «белок», «пептид», «полипептид» и «фрагмент полипептида» в настоящем документе употребляются взаимозаменяемо, относясь к полимерам любой длины, состоящим из остатков аминокислот. Такой полимер может быть линейным или разветвленным, может содержать модифицированные аминокислотные остатки или аналоги аминокислот, и в полимерной цепи могут быть мономеры, отличные от аминокислот. Указанные термины охватывают полимеры из аминокислот, модифицированные естественным образом или искусственно; например, модификация может состоять в образовании дисульфидной связи, гликозилировании, липидировании, ацетилировании, фосфорилировании или в иных изменениях, в том числе, в конъюгировании с меткой или биологически активным компонентом.

Термин «слитый белок» или «химерный белок» в настоящем документе относится к любому белку, полученному рекомбинантным путем таким образом, что в нем соединены продукты двух или более гетерологичных генов. В результате экспрессии этих гетерологичных генов образуется один полипептид, обладающий функциональными свойствами каждого из исходных белков.

Термин «выделенный» применительно к биологическому компоненту (например, к нуклеиновой кислоте, к белку или к клеточной органелле) относится к компоненту живого организма, отделенному или очищенному от других биологических компонентов клетки организма, в которой данный компонент содержится в природе, например, от хромосом, других хромосомных и внехромосомных ДНК и РНК, белков и органелл. Выделенные полинуклеотиды и белки включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные стандартными методами очистки. Этот термин также включает нуклеиновые кислоты и белки, полученные рекомбинантным путем или путем химического синтеза.

Термин «очищенный» в настоящем документе не подразумевает абсолютной чистоты, это, скорее, относительный термин. Так, например, препарат очищенного полипептида – это такой препарат, в котором данный полипептид содержится в большем относительном количестве, нежели в своем природном окружении. Иными словами, данный полипептид отделен от клеточных компонентов. Формулировка «в основном очищенный» полипептид в некоторых воплощениях данного изобретения означает, что по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% или больше клеточных компонентов или субстанций удалено. Аналогичное понятие «частично очищенный» подразумевает, что удалено менее чем 60% клеточных компонентов или субстанций. То же касается полинуклеотидов. Полипептиды, описанные в настоящем документе, можно очистить любыми известными в данной области техники методами.

Как говорилось выше, в настоящем документе под антигенными полипептидами, или их фрагментами, или вариантами имеются в виду антигенные полипептиды FMDV, полученные в виде слитых белков. Данным изобретением также охватываются фрагменты и варианты описанных в настоящем документе полинуклеотидов и кодируемых ими полипептидов. Под «фрагментом» подразумевается часть полинуклеотида или часть кодируемой им антигенной аминокислотной последовательности. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать фрагменты белка, сохраняющие биологическую активность нативного белка и, следовательно, является иммунологически активными, как отмечалось в настоящем документе. Фрагменты аминокислотной последовательности полипептида сохраняют способность индуцировать защитный иммунный ответ у животного.

Термин «варианты» означает по существу сходные последовательности. В случае полинуклеотидов варианты включают нуклеотидные последовательности с делециями и/или вставками одного или более нуклеотидов в одной или более позиций исходного полинуклеотида и/или с заменой одного или более нуклеотидов в одной или более позиций исходного полинуклеотида. В настоящем документе термин «нативный» полинуклеотид или полипептиды включает существующие в природе нуклеотидную или аминокислотную последовательность, соответственно. Варианты конкретного полинуклеотида по изобретению (то есть референсного полинуклеотида) можно определять путем сравнения степени (в процентах) идентичности последовательности полипептида, кодируемого вариантным полинуклеотидом, и полипептида, кодируемого референсным полинуклеотидом. «Вариант» в случае белка означает белок, полученный из нативного белка в результате делеции или вставки одного или более аминокислотных остатков в одной или более позициях нативного белка и/или замен одного или более аминокислотных остатков в одной или более позициях нативного белка. Варианты белков по данному изобретению являются биологически активными, то сеть они способны вызывать иммунный ответ.

В одном из аспектов данного изобретения предлагаются полипептиды FMDV, источником которых являлись овцы, крупный рогатый скот, козы или свиньи. В другом аспекте данного изобретения предлагаются полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, представленную в настоящем документе как SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14, или ее фрагмент, или вариант.

Более того, в объем данного изобретения входят также гомологи полипептидов FMDV, источником которых являлись овцы, крупный рогатый скот, козы или свиньи. В настоящем документе термин «гомологи» включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин «аналоги» относится к полинуклеотидам или полипептидам, выполняющим одинаковые или сходные функции, но возникшие в ходе эволюции независимо у неродственных организмов. Термин «ортологи» относится к полинуклеотидам или полипептидам из разных видов организмов, но произошедших в ходе эволюции от общего предкового гена/белка в результате видообразования. Обычно полинуклеотиды-ортологи кодируют полипептиды, выполняющие одинаковые или сходные функции. Термин «паралоги» относится к полинуклеотидам или полипептидам, возникшим в результате дупликации внутри генома. Паралоги обычно имеют разные функции, которые, однако, могут быть связаны. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида FMDV дикого типа могут отличаться от полипептида FMDV дикого типа как по аминокислотной последовательности, так и в результате посттрансляционных модификаций, или и того, и другого. В частности, у гомологов по данному изобретению аминокислотная (нуклеотидная) последовательность, как правило, идентична всей или части соответствующей последовательности FMDV дикого типа по меньшей мере на 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, и их функции сходны. Варианты включают аллельные варианты. Термин «аллельные варианты» относится к существующим в природной популяции (например, внутри вида или разновидности вируса) полинуклеотидам или полипептидам, в которых имеются полиморфизмы, вследствие чего аминокислотная последовательность белка изменена. В природных аллельных вариантах обычно различаются 1-5% последовательности полинуклеотида или полипептида. Аллельные варианты можно идентифицировать путем секвенирования представляющей интерес нуклеотидной последовательности у ряда различных видов, что нетрудно осуществить, используя гибридизационные зонды, с помощью которых у этих видов выявляют нужный генный локус в геноме. В объем данного изобретения входят все и всякие подобные вариации нуклеотидных последовательностей и являющийся их следствием полиморфизм аминокислотных последовательностей или варианты, являющиеся результатом природной аллельной вариабельности при неизменности функциональной активности данного гена.

В другом аспекте данного изобретения антиген FMDV слит с E2 Geobacillus stearothermophilus.

В настоящем документе термин «производное», или «вариант» относится к полипептиду, в котором имеется одна (или более) консервативная аминокислотная замена или другие небольшие модификации, или к кодирующим их полинуклеотидам, так что (1) эти полипептиды обладают в основном эквивалентной функцией по сравнению с полипептидом дикого типа или (2) антитела, индуцируемые этими полипептидами, обладают иммунореактивностью по отношению к полипептиду дикого типа. Эти варианты или производные включают полипептиды с небольшими модификациями по сравнению с изначальными аминокислотными последовательностями полипептидов FMDV, обладающие в основном эквивалентной активностью по сравнению с соответствующими не модифицированными полипептидами. Такие модификации могут быть намеренными, например возникшими путем сайт-направленного мутагенеза, или же спонтанными. Термин «вариант» также включает аминокислотные последовательности с делециями, вставками и заменами, коль скоро полипептиды с этими аминокислотными последовательностями способны вызывать иммунологическую реакцию, определенную в настоящем документе.

Термин «консервативная замена» означает замену аминокислотного остатка в полипептиде на другой, биологически сходный, или замену нуклеотида в полинуклеотиде, не влияющую на то, какая аминокислота стоит в соответствующей позиции полипептида, кодируемого данным полинуклеотидом, или же вызывающую замену аминокислотного остатка в этой позиции на биологически сходный. В этой связи особенно предпочтительными заменами по данному изобретению являются консервативные замены, определенные выше.

Полинуклеотиды по данному изобретению включают вырожденные вследствие вырожденности генетического кода нуклеотидные последовательности, например оптимизированные по кодонам, предпочтительным у данного организма-хозяина. В настоящем документе термин «оптимизированная нуклеотидная последовательность» относится к полинуклеотидам, которые генно-инженерным путем изменены таким образом, чтобы усилилась их экспрессия у определенного вида живых организмов. Для оптимизации полинуклеотидов, кодирующих полипептиды FMDV, последовательности ДНК гена белка FMDV можно модифицировать так, чтобы 1) они содержали кодоны, предпочтительные для высокого уровня генной экспрессии у данного вида; 2) содержание пар A+T или G+C в нуклеотидном составе соответствовало в основном типичному для данного вида; 3) образовалась инициирующая нуклеотидная последовательность, свойственная данному виду; или 4) исключить последовательности, обусловливающие дестабилизацию, неадекватное полиаденилирование, деградацию или терминацию синтеза РНК, или формирующие вторичные структуры типа шпилек или сайты сплайсинга РНК. Повышенный уровень экспрессии белка FMDV у данного вида достигается путем учета частоты распределения использования кодонов у эукариот и прокариот или у данного вида. Термин «частота использования предпочтительных кодонов» относится к феномену предпочтения, демонстрируемого конкретной клеткой-хозяином в отношении использования нуклеотидных кодонов для кодирования данной аминокислоты. Природных аминокислот насчитывается 20, и большинство из них кодируются более чем одним кодоном. Таким образом, все вырожденные нуклеотидные последовательности включаются в настоящее описание, коль скоро аминокислотная последовательности полипептида FMDV, кодируемого этими нуклеотидными последовательностями, остается функционально неизменной.

Степень идентичности двух последовательностей устанавливают с помощью попарного сравнения с помощью BLAST и матрицы BLOSUM 62 Национального центра биотехнологической информации США (NCBI; Бетезда, шт. Мэриленд, США), используя стандартные параметры (см., например алгоритмы BLAST или BLASTX доступные на сервере NCBI, а также работу Altschul et al.; в настоящем документе использование алгоритма, или BLAST, или BLASTX и матрицы BLOSUM62 обозначается термином «blasts»).

Понятие «идентичность» применительно к двум последовательностям относится к числу позиций, в которых находятся одинаковые нуклеотиды или аминокислотные остатки, разделенных на количество нуклеотидов или аминокислотных остатков в наиболее короткой из сравниваемых последовательностей, выравнивание которых проводится на компьютере с помощью алгоритма Уилбура-Липмана (Wilbur, Lipman), например, используя размер окна в 20 нуклеотидов, длину слова 4 нуклеотида и штраф за внесение делеции 4; и осуществляемый с помощью компьютера анализ, и интерпретация данных проводятся с использованием имеющихся в продаже программ (например, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Когда говорят, что последовательность РНК имеет такую-то степень идентичности или гомологии с последовательностями ДНК, тимидин (Т) в ДНК считается эквивалентным урацилу (U) в РНК. Таким образом, в объем данного изобретения входят последовательности РНК, и их можно установить по соответствующим последовательностям ДНК с учетом замены тимидина ДНК на урацил для РНК.

Степень идентичности или сходства двух аминокислотных последовательностей или степень идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить с помощью пакета программ Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Карлсбад, шт. Калифорния, США).

Реакцию гибридизации нуклеиновых кислот можно проводить в условиях разной жесткости. Способы увеличить жесткость условий гибридизации хорошо известны; см., например, руководство “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (второе издание, Sambrook et al., 2014).

Данное изобретение также охватывает полинуклеотиды FMDV, входящие в состав векторных молекул или экспрессионных векторов и функционально связанные с промоторами и при необходимости с энхансерами.

Термин «вектор» относится к рекомбинантным ДНК- или РНК-плазмидам или вирусам, содержащим гетерологичный полинуклеотид, предназначенный для доставки в клетку-мишень in vitro или in vivo. Этот гетерологичный полинуклеотид может содержать представляющую интерес последовательность, нужную для профилактики или терапии, и при необходимости они могут быть представлены экспрессионной кассетой. По данному изобретению нет необходимости в том, чтобы вектор был способен реплицироваться в конечной клетке-мишени или в организме индивида, подлежащего лечебному мероприятию. Термин «вектор» в настоящем документе включает вирусные векторы и векторы для клонирования.

Термин «рекомбинантный» применительно к полинуклеотиду означает, что он получен синтетическим или полусинтетическим путем и не существует в природе или соединен с другим полинуклеотидом не природным образом.

Термин «гетерологичный» означает произошедший из генетически отдельной сущности в отличие от остальной сущности, с которой сравнивают что данная структура. Например, полинуклеотид может быть генно-инженерным путем включен в состав плазмиды или вектора, происходящих из иного источника, нежели сам гетерологичный полинуклеотид. Промотор, отделенный от регулируемой им природной кодирующей нуклеотидной последовательности и функционально соединенный с другой кодирующей последовательностью, является гетерологичным промотором.

Данное изобретение относится к вакцинам для овец, крупного рогатого скота, коз и свиней или к фармацевтическим или иммунологическим композициям, содержащим эффективное количество антигенов FMDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемые носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду.

Описанный в настоящем документе объект данного изобретения касается частично композиций и способов, в которых используется антиген FMDV, полученный в виде слитого или химерного белка с высокой иммуногенностью, который защищает животных от заражения гомологичными и гетерологичными штаммами FMDV.

Композиции

Данное изобретение относится к вакцинам против FMDV или к композициям, содержащим эффективное количество антигена FMDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду. В одном из воплощений данного изобретения антиген FMDV представлен слитым или химерным белком, содержащим E2 из Geobacillus stearothermophilus.

В одном из воплощений данного изобретения описанный в настоящем документе объект изобретения касается слитого или химерного белка, содержащего антиген FMDV.

В одном из воплощений данного изобретения описанный в настоящем документе объект изобретения касается вакцины или композиции, содержащей антиген FMDV, слитый с белком E2 Geobacillus stearothermophilus.

В одном из воплощений данного изобретения описанный в настоящем документе объект изобретения касается вакцины или композиции, содержащей слитый или химерный белок FMDV и Е2, продуцированный в прокариотах или эукариотах. Данное изобретение охватывает полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, вызывающие иммунологическую реакцию у животного, например у овцы, крупного рогатого скота, козы и свиньи. Таким полипептидом, антигеном, эпитопом или иммуногеном FMDV может быть любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, например, (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера) белок, пептид или их фрагмент, который вызывает, индуцирует или стимулирует ответ у животного, например, у овцы, крупного рогатого скота, козы и свиньи.

В одном из воплощений данного изобретения антиген FMDV может быть синтетическим антигеном, разработанным с использованием выравнивания последовательностей. Для капсидного белка VP1 описаны множественные эпитопы для Т- и В-лимфоцитов. Показано, что синтетический полипептид, соответствующий одному Т-клеточному и двум В-клеточным азиатского серотипа FMDV, индуцирует защитный ответ (Ren et al., Vaccine 2011). На основании результатов выравнивания последовательностей можно определить эквивалентный полипептид для всех других серотипов. В другом воплощении данного изобретения антиген FMDV может быть полипептидом VP1. В еще одном воплощении данного изобретения антиген FMDV может быть полипептидом P1-3C. В другом воплощении данного изобретения антиген FMDV может быть только одним P1 или P1-2A/2B1. В еще одном воплощении данного изобретения антиген FMDV может быть VP0-VP3. В другом воплощении данного изобретения антиген FMDV может быть VP4-VP2. В еще одном воплощении данного изобретения антиген FMDV может быть 3C.

В другом воплощении данного изобретения антиген, или полипептид, или белок FMDV может быть слитым или химерным белком. В еще одном воплощении данного изобретения антиген, или полипептид, или белок FMDV слит с коровым С-концевым каталитическим доменом E2 из Geobacillus stearothermophilus.

В другом воплощении данного изобретения антиген FMDV происходит из штаммов FMDV O1 Manisa, O1 BFS или Campos, A24 Cruzeiro, Asia 1 Shamir, A Iran’96, A22 Iraq, SAT2 Saudi Arabia.

Данное изобретение относится к вакцинам против FMDV, содержащим эффективное количество рекомбинантного, или слитого, или химерного антигена или белка FMDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду.

В другом воплощении данного изобретения антиген FMDV представляет собой слитый или химерный белок FMDV и E2. Слитый или химерный белок FMDV-E2 может быть получен в прокариотах или эукариотах. В другом воплощении данного изобретения фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, адъювант, эксципиент или несущая среда представляют собой эмульсию типа «вода в масле». В другом воплощении данного изобретения фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, адъювант, эксципиент или несущая среда представляют собой эмульсию типа «масло в воде». В еще одном воплощении данного изобретения указанная эмульсия типа «вода в масле» является тройной эмульсией вода/масло/вода (W/O/W).

Данное изобретение также охватывает полинуклеотиды FMDV, содержащиеся в векторной молекуле или в экспрессионном векторе и функционально связанные с регуляторными элементами – промотором и при необходимости энхансером.

В одном из аспектов данного изобретения предлагаются полипептиды FMDV, в частности, вирусов, источником которых являются овца, бык, коза или свинья и которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в настоящем документе как SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 14, и их фрагменты или варианты.

В другом аспекте данного изобретения предлагаются полипептиды, аминокислотная последовательность которых идентична последовательности антигенного полипептида по данному изобретению по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, в частности полипептида, представленного здесь как SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 14.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагаются фрагменты и варианты полипептидов FMDV, указанных выше (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14), которые без особого труда могут быть получены специалистом в данной области техники с помощью хорошо известных молекулярно-биологических методов.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается слитый или химерный белок, содержащий антиген FMDV и домен E2 из Geobacillus stearothermophilus. Слитый или химерный белок FMDV-E2 может содержать полипептид, аминокислотная последовательность которого идентична таковой полипептида, представленного здесь как SEQ ID NO: 6, 10 или 14, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Варианты представляют собой гомологичные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая идентична последовательностям SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14 по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%.

Иммуногенный фрагмент полипептида FMDV включает по меньшей мере 8, 10, 15 или 20 расположенных подряд аминокислотных остатков, по меньшей мере 21 аминокислотный остаток, по меньшей мере 23 аминокислотных остатка, по меньшей мере 25 аминокислотных остатков или по меньшей мере 30 аминокислотных остатков из последовательности полипептида FMDV, аминокислотная последовательность которого представлена здесь как SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14, или их вариантов. В другом воплощении данного изобретения фрагмент полипептида FMDV включает специфичный эпитоп, имеющийся в полипептиде FMDV.

В другом аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий полипептид FMDV, например, полинуклеотид, кодирующий полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной здесь как SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14. В еще одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в настоящем документе как SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14, или ее консервативному варианту, аллельному варианту, гомологу или иммуногенному фрагменту, содержащему по меньшей мере 8 или по меньшей мерей 10 аминокислотных остатков, расположенных подряд в одном из этих полипептидов, или комбинацию этих полипептидов.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий слитый или химерный белок FMDV-E2, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности полипептида, представленной здесь как SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14.

В другом аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную здесь как SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, и 13, или ее вариант. В еще одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полинуклеотида, представленной здесь как SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13, или ее варианту.

В еще одном аспекте данного изобретения предлагаются последовательности белка E2 (SEQ ID NO:4) и соответствующей ДНК (SEQ ID NO:3) и линкерная последовательность для E2 (SEQ ID NO:15).

Полинуклеотиды по данному изобретению могут содержать дополнительные последовательности, например дополнительные кодирующие последовательности в пределах той же единицы транскрипции, регуляторные элементы, например, промоторы, сайты связывания рибосомы, не кодирующие области 5’UTR, 3’UTR, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования, дополнительные единицы транскрипции, регулируемые тем же или другим промотором, последовательности для клонирования, экспрессии, гомологической рекомбинации и трансформации клеток-хозяев и любые такие конструкции, которые могут понадобиться для осуществления воплощений данного изобретения.

Элементы, необходимые для экспрессии полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена FMDV, предпочтительно входят в состав вектора по данному изобретению. Такой вектор содержит, или состоит из, или по существу состоит из, как минимум, кодона инициации транскрипции (ATG), кодона терминации транскрипции и промотора, а при необходимости также последовательности полиаденилирования в случае определенных векторов, например, плазмид и некоторых вирусных векторов, например, отличных от поксвирусов. В тех случаях, когда полинуклеотид по данному изобретению кодирует фрагмент белка, например, пептид FMDV, в векторе предпочтительно кодон ATG располагается на 5'-конце рамки считывания. а кодон терминации – на ее 3'-конце. В векторе могут присутствовать другие элементы для регуляции экспрессии, например, энхансеры, стабилизирующие последовательности, например интроны, и сигнальные последовательности, обеспечивающие секрецию белка.

Данное изобретение относится также к композициям, содержащим векторы, например, экспрессионные векторы, например, к терапевтическим композициям. Такая композиция может содержать один или более векторов, например, экспрессионных векторов, например, векторов для экспрессии in vivо, содержащих нуклеотидные последовательности, обеспечивающие экспрессию одного или более полипептидов, антигенов, эпитопов или иммуногенов FMDV. В одном из воплощений данного изобретения вектор содержит и экспрессирует полинуклеотид, включающий, состоящий из или по существу состоящий из нуклеотидной последовательности, кодирующей (и предпочтительно экспрессирующей) антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, в фармацевтически или ветеринарно приемлемом носителе, эксципиенте, адъюванте или несущей среде. Так, по одному из воплощений данного изобретения другой вектор или другие векторы в составе композиции содержат, состоят из или по существу состоят из полинуклеотида, кодирующего один или более других белков FMDV из антигенов, эпитопов или иммуногенов FMDV или их фрагментов, и в подходящих условиях вектор экспрессирует один или более других белков FMDV из числа полипептидов, антигенов, эпитопов или иммуногенов FMDV или их фрагментов.

В еще одном воплощении данного изобретения вектор или векторы содержат, состоят из или по существу состоят из полинуклеотиде (один или более), кодирующего белок E2 из Geobacillus stearothermophilus.

В еще одном воплощении данного изобретения экспрессионный вектор является плазмидным вектором или плазмидной ДНК, в частности, вектором для экспрессии in vivo в прокариотах или эукариотах. В одном из конкретных примеров, не имеющем ограничительного характера, в качестве вектора для включения нуклеотидной последовательности используются плазмиды pET30a, pET30b и pET30c (Novagen). Векторы pET-30a-c содержат промотор бактериофага T7 и на N-конце комбинацию His•Tag/тромбин/S•Tag/ энтерокиназа совместно, но необязательно, с последовательностью Hiы•Tag на C-конце. В другом неограничивающем примере в качестве вектора для включения нуклеотидной последовательности используются плазмиды pVR1020 или 1012 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, см., например, патенты США №№ 5,846,946 и 6,451,769). Плазмида pVR1020 является производной от плазмиды pVR1012 и содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид человеческого тканевого активатора плазминогена (tPА). В одном из воплощений данного изобретения человеческий сигнальный пептид tPA содержит аминокислотные остатки от M(1) до S(23) последовательности по базе данных Genbank с идентификационным номером HUMTPA14. В другом конкретном примере, не имеющем ограничительного характера, плазмида, используемая в качестве вектора для включения нуклеотидной последовательности, содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид лошадиного инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1) начиная с аминокислотного остатка М(24) и до остатка A(48) согласно последовательности по базе данных Genbank с идентификационным номером U28070. Дополнительную информацию о плазмидных ДНК, которую можно использовать теоретически или на практике, можно найти, например, в патентах США №№ 6,852,705; 6,818,628; 6,586,412; 6,576,243; 6,558,674; 6,464,984; 6,451,770; 6,376,473 и 6,221,362.

Термин «плазмида» охватывает любую транскрипционную единицу ДНК, содержащую полинуклеотид по данному изобретению и элементы, необходимые для его экспрессии in vivo в клетке или клетках желаемого хозяина или мишени; и в этой связи можно отметить, что в объем данного изобретения входят как кольцевые, так и линейные плазмиды, как суперскрученные, так и не суперскрученные.

Плазмида по данному изобретению содержит, или состоит из, или по существу состоит из дополнительно к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген FMDV, при необходимости слитый с гетерологичной пептидной последовательностью, вариантом, аналогом или фрагментом, функционально связанный с промотор, или указанный полинуклеотид находится под контролем промотора, или зависит от него. В целом, выгодно использовать сильный промоторный функционал в эукариотических клетках. При этом сильным промотором могут служить (не ограничиваясь перечисленным здесь) промотор немедленных ранних генов цитомегаловируса (CMV-IE) человеческого или мышиного происхождения или при необходимости иного происхождения, например, крысы или морской свинки; суперпромотор (Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995.). Промотор CMV-IE содержит собственно промоторную часть, связанную или не связанную с энхансерной частью. В этой связи можно сослаться на Европейские патенты A-260 148, A-323 597, патенты США №№ 5,168,062, 5,385,839 и 4,968,615, а также на международную заявку по PCT WO87/03905. Предпочтительно промотор CMV-IE является человеческим (Boshart et al., 1985, Cell 41(2): 521-30) или мышиным.

В более общем случае источником промотора является вирус, растение или клетка. Помимо промотора CMV-IE по данному изобретению можно использовать другие сильные промоторы: промотор ранних/поздних генов вируса SV40 или промотор LTR вируса саркомы Рауса. Сильными промоторами клеточного происхождения, пригодными для осуществления данного изобретения, являются промоторы генов цитоскелета, например, промотор десмина (Kwissa et al., 2000, Vaccine 18(22): 2337-44) или промотор актина (Miyazaki et al., 1989, Gene 79(2): 269-77).

Что касается сайта полиаденилирования (polyA) для плазмидных и вирусных векторов, отличных от поксвирусных, можно использовать сигнал poly(A) бычьего гормона роста (bGH) (см. патент США № 5,122,458), или сигнал poly(A) кроличьего β-глобина, или сигнал poly(A) вируса SV40.

Термин «клетка-хозяин» означает прокариотическую или эукариотическую клетку, подвергнутую генетическому изменению, или способную к генетическому изменению путем введения экзогенного полинуклеотида, например, рекомбинантной плазмиды или вектора. Применительно к генетически измененным клеткам этот термин относится как к первоначальной измененной клетке, так и к ее потомству.

Прокариотические организмы, используемые по данному изобретению, включают Avibacterium, Brucella, Escherichia coli, Haemophilus (например, Haemophilus suis), Salmonella (например, Salmonella enteridis, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis), Lactococcus lactis, Lactobacillus, Shigella, Pasteurella и Rimeirella.

Для прокариотических систем можно выбрать ряд экспрессионных векторов. Такие векторы включают, не ограничиваясь перечисленным здесь, многофункциональные векторы для клонирования и экспрессии в клетках E. coli, например, векторы PBLUESCRIPT (Stratagene) и pET (Novagen); piN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chern. 264:5503-5509 (1989)) и т.п.; векторы PGEX (Promega, Мадисон, шт. Висконсин, США). Для эукариотических систем используют клеточные линии Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, клетки для бакуловирусных систем экспрессии, клетки млекопитающих, растительные клетки. Экспрессионные векторы для эукариотических систем включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) векторы pVR1020 или pVT1012 (Vical Inc., Сан-Диего, шт. Калифорния, США), вектор PichiaPink (Invitrogen, шт. Калифорния, США), вектор pFasBac TOPO (Invitrogen).

Способы применения и способы получения

В одном из воплощений данного изобретения его объектом, описанным в настоящем документе, является способ получения или создания антигенного полипептида или антигена. Этот способ включает следующие этапы: i) соединение полинуклеотида, кодирующего антиген, с полинуклеотидом, кодирующим белок Е2; ii) экспрессию слитого белка в хозяине; iii) выделение слитого белка из хозяина. В одном из воплощений данного изобретения антиген присоединяют к N-концу E2. В другом воплощении данного изобретения источником белка E2 является Geobacillus stearothermophilus.

В другом воплощении данного изобретения его объектом, описанным в настоящем документе, является способ вакцинации овец, крупного рогатого скота, коз или свиней, включающий введение животному эффективного количества вакцины, которая может содержать эффективное количество рекомбинантного, или слитого, или химерного антигена или белка FMDV и фармацевтически или ветеринарно приемлемые носитель, эксципиент, адъювант или несущую среду.

В одном из воплощений данного изобретения предлагаемый способ вакцинации включает однократное введение вакцинной композиции, составленной в виде эмульсии по данному изобретению. Например, в одном из воплощений данного изобретения иммунологическая или вакцинная композиция содержит антигены FMDV, в том числе, полипептиды и вирусоподобные частицы (VLP), а в другом воплощении данного изобретения предлагается вакцина, содержащая слитые или химерные белки FMDV-E2. По данным электронной микроскопии, слитые или химерные белки FMDV-E2 образуют частицы, сходные с вирионами самого FMDV или с VLР; таким образом, иммунологические или вакцинные композиции по данному изобретению включают композиции, содержащие частицы FMDV-E2.

В одном из воплощений данного изобретения его объектом, описанным в настоящем документе, является способ вакцинации овец, крупного рогатого скота, коз или свиней, включающий введение овце, быку, козе или свинье антигена FMDV овцы, быка, козы или свиньи. В другом воплощении данного изобретения его объектом, описанным в настоящем документе, является способ возбуждения иммунного ответа, включающий введение овце, быку, козе или свинье вакцины, содержащей антиген FMDV овцы, быка, козы или свиньи. В еще одном воплощении данного изобретения его объектом, описанным в настоящем документе, является способ защиты от заболевания и/или его предотвращения у овец, крупного рогатого скота, коз или свиней, включающий введение овце, быку, козе или свинье вакцины, содержащей антиген FMDV овцы, быка, козы или свиньи.

Введение может быть подкожным или внутримышечным. Возможно введение без использования игл (например, Pigjet или Bioject).

В одном из воплощений данного изобретения применяется режим примирования/стимулирования, который включает по меньшей мере одно первичное введение и по меньшей мере одно стимулирующее введение, в которых используется по меньшей мере один общий для этих введений полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген. Как правило, для примирования используют иммунологическую композицию или вакцину, отличающуюся от той, что служит для бустерного введения. Однако отметим, что можно использовать одинаковые композиции и для примирования, и для стимулирования. Этот протокол введения называется "прайм-буст".

Примирование/стимулирование по данному изобретению включает использование рекомбинантного вирусного вектора, который служит для экспрессии кодирующей последовательности FMDV или ее фрагментов, кодирующих антигенный полипептид, или его фрагмент, или его вариант. А именно, указанный вирусный вектор обеспечивает экспрессию гена FMDV, или его фрагмента, или варианта, кодирующих антигенный полипептид. Вирусные векторы по данному изобретению включают, не ограничиваясь перечисленным здесь, поксвирусы [например, вирус осповакцины или ослабленный вирус осповакцины, птичьи поксвирусы или ослабленные птичьи поксвирусы (например, вирусы оспы канареек, кур, голубей, куропаток, ALVAC, TROVAC; см., например, патент США № 5,505,941, US 5,494,8070), вирус оспы североамериканских енотов, вирус оспы свиней и др.], аденовирусы (например, человеческий аденовирус, собачий аденовирус), герпесвирусы [например, герпесвирус собак, герпесвирус индейки, вирус болезни Марека, вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV), кошачий герпесвирус, бычий герпесвирус, свиной герпесвирус], бакуловирусы, ретровирусы и др. В другом воплощении данного изобретения экспрессионный вектор на основе вируса птичьей оспы является вектором на основе вируса оспы канареек, например, ALVAC. В еще одном воплощении данного изобретения экспрессионный вектор на основе вируса птичьей оспы является вектором на основе вируса оспы кур, например TROVAC. Чтобы осуществить экспрессию антигена FMDV по данному изобретению, соответствующий полинуклеотид встраивают в вектор под контроль определенного поксвирусного промотора, например, промотора поксвируса чешуекрылых 42K Amsacta moorei (Barcena, et al. 2000, J Gen Virol 81(Pt 4): 1073-85), промотор вируса осповакцины 7,5 кДa (Cochran et al., 1985, J Virol 54(1): 30-7), промотор I3L вируса осповакцины (Riviere et al., 1992, J Virol 66(6): 3424-34), промотор НА вируса осповакцины (Shida, 1986, Virology 150(2): 451-62), промотор ATI вируса коровьей оспы (Funahashi et al., 1988, J Gen Virol 69 ( Pt 1): 35-47), the промотор Н6 вируса осповакцины (Taylor et al., 1988, Vaccine 6(6): 504-8; Guo et al., 1989, J Virol 63(10): 4189-98; Perkus et al., 1989, J Virol 63(9): 3829-36), inter alia.

В другом воплощении данного изобретения экспрессионный вектор на основе вируса птичьей оспы является вектором на основе вируса оспы канареек, например, ALVAC. Антиген, эпитоп или иммуноген FMDV могут быть FMDV P1-3C. Вирусный вектор для экспрессии антигена FMDV может быть вектором на основе вируса оспы канареек, например, vCP2186, vCP2181 или vCP2176, или на основе вируса оспы кур, например, vFP2215 (см. патент США № 7,527,960) или на основе аденовируса (см. заявку на патент США № 2016/0220659).

При реализации режима вакцинации примирование/стимулирование по данному изобретению может использоваться рекомбинантный антиген или белок FMDV, полученный в растениях или водорослях (см. заявку на патент США №2011/0236416), или в клетках насекомых (см. заявку на патент США №2016/0220659).

В другом варианте режима примирование/стимулирование по данному изобретению вводят композицию, содержащую антиген FMDV по данному изобретению, а потом вакцину или композицию, содержащую рекомбинантный вирусный вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий антиген FMDV и обеспечивающий его экспрессию in vivo, или инактивированную вирусную вакцину или композицию, содержащую антиген FMDV, или вакцину или композицию на основе плазмидной ДНК, содержащую антиген FMDV или обеспечивающую его экспрессию, или рекомбинантный антиген FMDV, полученный в клетках растений, водорослей или насекомых. Или режим примирование/стимулирование по данному изобретению предполагает введение животному вакцины или композиции, содержащей рекомбинантный вирусный вектор, который включает нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген FMDV, и обеспечивает его экспрессию in vivo, или вакцину или композицию на основе инактивированного вируса, содержащую антиген FMDV, или вакцину или композицию на основе плазмидной ДНК, содержащую антиген FMDV или обеспечивающую его экспрессию, или рекомбинантный антиген FMDV, полученный в клетках растений, водорослей или насекомых, с последующим введением композиции, содержащей антиген FMDV по данному изобретению. Отметим также, что как при первичном, так и при вторичном введении может использоваться композиция, содержащая антиген FMDV по данному изобретению.

Режим примирование/стимулирование включает по меньшей мере одно первичное введение и одно стимулирующее, причем используется по меньшей мере один общий для первичного и для вторичного введения полипептид и/или его вариант или фрагмент. Вакцина, используемая для примирования, может отличаться от той, что используется для последующего бустерного введения. Примирование может состоять из одного или более введений. Также стимулирование может включать одно или более введений.

Объем дозы композиции на основе вирусных векторов, например, вирусов, отличных от поксвирусов, для целевых видов млекопитающих, например, овцы, быка, козы или свиньи, составляет, как правило, от около 0,1 мл до около 5,0 мл, от около 0,1 мл до около 3,0 мл и от около 0,5 мл до около 2,5 мл.

Через 2-4 недели после последней иммунизации оценивают эффективность вакцины путем заражения животного, например, овцы, быка, козы или свиньи, вирулентным штаммом FMDV; предпочтительно используют следующие штаммы FMDV: O1 Manisa, O1 BFS или Campos, A24 Cruzeiro, Asia 1 Shamir, A Iran’96, A22 Iraq, SAT2 Saudi Arabia.

Другие пригодные штаммы включают FMDV A10-61, A5, A12, A24/Cruzeiro, C3/Indaial, O1, C1-Santa Pau, C1-C5, A22/550/Azerbaijan/65, SAT1-SAT3, A, A/TNC/71/94, A/IND/2/68, A/IND/3/77, A/IND/5/68, A/IND/7/82, A/IND/16/82, A/IND/17/77, A/IND/17/82, A/IND/19/76, A/IND/20/82, A/IND/22/82, A/IND/25/81, A/IND/26/82, A/IND/54/79, A/IND/57/79, A/IND/73/79, A/IND/85/79, A/IND/86/79, A/APA/25/84, A/APN/41/84, A/APS/44/05, A/APS/50/05, A/APS/55/05, A/APS/66/05, A/APS/68/05, A/BIM/46/95, A/GUM/33/84, A/ORS/66/84, A/ORS/75/88, A/TNAn/60/947/Asia/1, A/IRN/05, Asia/IRN/05, O/HK/2001, O/UKG/3952/2001, O/UKG/4141/2001, O/UKG/7039/2001, O/UKG/9161/2001, O/UKG/7299/2001, O/UKG/4014/2001, O/UKG/4998/2001, O/UKG/9443/2001, O/UKG/5470/2001, O/UKG/5681/2001, O/ES/2001, HKN/2002, O5India, O/BKF/2/92, K/37/84/A, KEN/1/76/A, GAM/51/98/A, A10/Holland, O/KEN/1/91, O/IND49/97, O/IND65/98, O/IND64/98, O/IND48/98, O/IND47/98, O/IND82/97, O/IND81/99, O/IND81/98, O/IND79/97, O/IND78/97, O/IND75/97, O/IND74/97, O/IND70/97, O/IND66/98, O/IND63/97, O/IND61/97, O/IND57/98, O/IND56/98, O/IND55/98, O/IND54/98, O/IND469/98, O/IND465/97, O/IND464/97, O/IND424/97, O/IND423/97, O/IND420/97, O/IND414/97, O/IND411/97, O/IND410/97, O/IND409/97, O/IND407/97, O/IND399/97, O/IND39/97, O/IND391/97, O/IND38/97, O/IND384/97, O/IND380/97, O/IND37/97, O/IND352/97, O/IND33/97, O/IND31/97, O/IND296/97, O/IND23/99, O/IND463/97, O/IND461/97, O/IND427/98, O/IND28/97, O/IND287/99, O/IND285/99, O/IND282/99, O/IND281/97, O/IND27/97, O/IND278/97, O/IND256/99, O/IND249/99, O/IND210/99, O/IND208/99, O/IND207/99, O/IND205/99, O/IND185/99, O/IND175/99, O/IND170/97, O/IND164/99, O/IND160/99, O/IND153/99, O/IND148/99, O/IND146/99, O/SKR/2000, A22/India/17/77.

Дальнейшую информацию о штаммах FMDV можно найти на сайте Европейского института биоинформатики (EMBL-EBI).

Для проверки эффективности вакцин используют как гомологичные, так и гетерологичные штаммы вируса для заражения. Заражение животного может быть интрадермальным, подкожным, путем вдыхания, интраназальным, внутриглазным, интратрахеальным и/или пероральным.

По режиму примирование/стимулирование введение осуществляется предпочтительно с интервалом 1-6 недель. В одном из воплощений данного изобретения предполагается также бустерное введение раз в полгода или раз в год предпочтительно при использовании вакцин на основе вирусных векторов.

Используемые в режиме примирование/стимулирование композиции, включающие рекомбинантные антигенные полипептиды по данному изобретению, содержатся в фармацевтически или ветеринарно приемлемом носителе, разбавителе, адъюванте или эксципиенте. Вакцинация согласно протоколам по данному изобретению защищает животных от FMDV овцы, быки, козы или свиньи, и/или предотвращает прогрессирование заболевания у зараженного животного.

Специалистам в данной области техники понятно, что описание, представленное в настоящем документе, имеет характер примера, и объем данного изобретения им не ограничивается. На основании представленного в настоящем документе описания и собственных знаний опытный специалист в данной области техники может без излишнего экспериментирования определить, сколько раз нужно вводить вакцину, выбрать путь введения и дозу для каждого введения.

По данному изобретению животному вводится по меньшей мере один раз эффективное количество терапевтической композиции, полученной по данному изобретению. Это животное может быть самцом, самкой, беременной самкой или новорожденным детенышем. Введение указанной композиции может осуществляться различными путями, в том числе, не ограничиваясь перечисленным здесь, путем внутримышечной (IM), внутрикожной (ID) или подкожной (SC) инъекции, или же интраназально, или перорально. Терапевтическую композицию по данному изобретению можно также вводить с помощью безыгольных приспособлений, как, например, Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, шт. Джорджия, США), устройств Vetjet или Vitajet (Вioject, шт. Орегон, США). Другой подход состоит во введении плазмидных композиций путем электропорации (см., например, работы Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; заявка на патент по PCT № WO99/01158).

В одном из воплощений данного изобретения предлагается введение терапевтически эффективного количества препарата для доставки антигена или эпитопа FMDV в клетку-мишень и его экспрессии в ней. Определение терапевтически эффективного количества проводится путем рутинного для специалиста в данной области техники экспериментирования. В одном из воплощений данного изобретения указанный препарат содержит экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид, обеспечивающий экспрессию антигена или эпитопа FMDV, и фармацевтически или ветеринарно приемлемые носитель, несущую среду, адъювант или эксципиент. В другом воплощении данного изобретения фармацевтически или ветеринарно приемлемые носитель, несущая среда, адъювант или эксципиент способствуют трансфекции или иному процессу переноса полинуклеотидов по данному изобретению в организм животного и/или стабильности вектора или соответствующего белка в хозяине.

В одном из воплощений данного изобретения его объектом, описанным в настоящем документе, является способ различения зараженных и вакцинированных животных (DIVA).

В настоящем документе описывается, что применение вакцин или композиций по данному изобретению позволяет выявлять инфекцию FMDV у животных. В настоящем документе описывается, что применение вакцин или композиций по данному изобретению позволяет выявлять инфекцию FMDV у животных путем различения инфицированных и вакцинированных животных (DIVA). В настоящем документе описан способ для диагностирования инфекции FMDV у животных с помощью иммунологического метода детекции иммуногенов FMDV, например, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Изделие

В одном из воплощений данного изобретения его объектом, описанным в настоящем документе, является набор для осуществления способа возбуждения или индуцирования иммунного ответа, включающий любую из вакцин или иммунологических композиций на основе рекомбинантного FMDV, вакцин или иммунологических композиций на основе инактивированного FMDV, вирусных вакцин или композиций на основе рекомбинантного FMDV и инструкции по практическому осуществлению указанного способа.

Другое воплощение данного изобретения – это набор для осуществления способа индуцирования иммунологической или защитной реакции против FMDV у животных, включающий композицию или вакцину, которая содержит антиген FMDV по данному изобретению, и вирусную вакцину или иммунологическую композицию на основе рекомбинантного FMDV, а также инструкции по практическому осуществлению способа доставки эффективного количества указанного препарата для возбуждения иммунного ответа у животного.

Другое воплощение данного изобретения – это набор для осуществления способа индуцирования иммунологической или защитной реакции против FMDV у животных, включающий композицию или вакцину, которая содержит антиген FMDV по данному изобретению, и вакцину или иммунологическую композицию на основе инактивированного FMDV, а также инструкции по практическому осуществлению способа доставки эффективного количества указанного препарата для возбуждения иммунного ответа у животного.

В еще одном своем аспекте данное изобретение относится к набору для вакцинации в режиме примирование/стимулирование по данному изобретению, описанной выше. Этот набор содержит по меньшей мере две емкости: первая емкость заключает в себе вакцину или композицию для примирования по данному изобретению, а вторая емкость заключает в себе вакцину или композицию для стимулирования по данному изобретению. Предпочтительно такой набор включает дополнительные первые и вторые емкости для дополнительной вакцинации – дополнительного примирования или дополнительного стимулирования.

Специалистам в данной области техники хорошо известны фармацевтически приемлемые или ветеринарно носители, или адъюванты, или несущие среды, или эксципиенты. Например, фармацевтически приемлемым или ветеринарно носителем, или несущей средой, или адъювантом, или эксципиентом может служить 0,9%-ный раствор хлорида натрия (например, физиологический раствор) или фосфатный буферный раствор. Другие фармацевтически приемлемые или ветеринарно носители, или несущие среды, или эксципиенты, которые пригодны для использования в способах по данному изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленным здесь, поли-(L-глутаминовую кислоту) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем, или несущей средой, или адъювантом, или эксципиентом может служить любое вещество или комбинация веществ, способствующих введению вектора (или белка, экспрессию которого обеспечивает вектор по данному изобретению in vitro); эти носитель, адъювант, несущая среда или эксципиент могут способствовать трансфекции и/или повышать стабильность вектора (или белка). Дозы и объемы доз обсуждаются в настоящем документе в разделе «Осуществление изобретения»; специалист в данной области техники может определить нужную дозировку на основании настоящего описания в совокупности с собственными знаниями без излишнего экспериментирования.

Для плазмид предпочтительно, но не исключительно, пригодны катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, главным образом те, которые описываются следующей формулой:

где R1 представляет насыщенный или ненасыщенный неразветвленный алифатический радикал, содержащий 12-18 атомов углерода; R2 представляет другой алифатический радикал, содержащий 2 или 3 атома углерода; X представляет аминогруппу или гидроксильную группу, например, используется реагент для трансфекции N-(2-гидроксиэтило)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропан аммоний (DMRIE). В другом воплощении данного изобретения катионные липиды ассоциированы с нейтральными липидами, например диолеоилфосфатидилэтаноламином (DOPE).

Из числа катионных липидов предпочтителен DMRIE (см. публикацию WO96/34109), предпочтительно вместе с DOPE (см. работу Behr J.P., 1994), образуя комплекс DMRIE-DOPE.

Если используется DOPE, то молярное соотношение DMRIE:DOPE составляет от около 95: около 5 до около 5: около 95 или около 1: около 1, например 1:1.

Соотношение адъювант DMRIE или DMRIE-DOPE и плазмиды (масса/масса) составляет от около 50: около 1 до около 1: около 10, например, около 10 : около 1 и около 1: около 5, около 1: около 1 и около 1: около 2, например 1:1 и 1:2.

В другом воплощении данного изобретения фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, адъювант, эксципиент или несущая среда представляет собой эмульсию типа «вода в масле». Примеры пригодных по данному изобретению эмульсий типа «вода в масле» включают вакцинные эмульсии типа «вода в масле» на масляной основе, стабильные и остающиеся жидкими при температуре 4°C, которые содержат от 6% объем/объем дo 50% объем/объем водной фазы, содержащей антиген, предпочтительно 12-25% объем/объем, и от 50% объем/объем до 94% объем/объем масляной фазы, содержащей полностью или частично неметаболизируемое масло (например, минеральное масло, такое как парафиновое масло) и/или метаболизируемое масло (например, растительное масло, или жирные кислоты, или многоатомные спирты, или сложные эфиры спиртов); от 0,2 дo 20 p/v% поверхностно-активных веществ, предпочтительно от 3 до 8 p/v% (полностью или частично), или смесь эфиров полиглицерина (предпочтительно указанные эфиры полиглицерина являются полиглицерин-полирицинолеатами), либо полиоксиэтиленрициновые масла, или гидрогенизированные полиоксиэтиленрициновые масла. Примеры поверхностно-активных веществ, которые можно использовать в эмульсиях типа «вода в масле», включают этоксилированные эфиры сорбитана [например, полиоксиэтилен(20)сорбитан-моноолеат (TWEEN 80®), производства AppliChem, Inc., Чешир, шт. Коннектикут, США] и эфиры сорбитана [например, сорбитан-моноолеат (SPAN 80®), производства Sigma Aldrich, Сент-Луис, шт. Миссури, США]. Об эмульсиях типа «вода в масле» см. также патент США № 6,919,084. В некоторых воплощениях данного изобретения в состав водной фазы, содержащей антиген, входит солевой раствор с одним или более забуферивающими агентами. Пример пригодного по данному изобретению буферного раствора – солевой раствор, забуференный фосфатом. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения эмульсия типа «вода в масле» является тройной – вода/масло/вода (см. патент США № 6,358,500). Примеры других пригодных по данному изобретению эмульсий описаны в патенте США № 7,371,395.

Вакцины или иммунологические композиции по данному изобретению могут содержать один или более адъювантов (или состоять в основном из них). Для практического осуществления данного изобретения пригодны следующие адъюванты: (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, полимеры малеинового ангидрида и алкенильных производных; (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), например, олигодезоксирибонуклеотиды, в которых имеется один или более не метилированных динуклеотидов цитозин-гуанин (5'CpG3') (Klinman et al., 1996; WO98/16247); (3) эмульсия типа «масло в воде», например эмульсия SPT, описанная на стр. 147 работы “Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”, изданной M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, и эмульсия MF59, описанная там же на стр.183; (4) катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, например додециламин (DDA); (5) цитокины; (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия; (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любом из документов, цитируемых в настоящей заявке и включенных в нее путем отсылки, или (9) любые комбинации или смеси указанных здесь субстанций.

Основой эмульсии типа «масло в воде» (3) может служить легкое вазелиновое масло (по Европейской фармакопее), изопреноидное масло, например, сквалан, сквален, масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, например, изобутена или децена; эфиры кислот или спиртов, имеющих неразветвленную алкильную группу, например, растительные масла, этилолеат, пропиленгликоль, ди(каприлат/капрат), глицерол-три(каприлат/капрат) и пропиленгликоль-диолеат или эфиры разветвленных жирных спиртов или кислот, в частности, эфиры изостеариновой кислоты.

Для образования эмульсии масло берут в сочетании с эмульгирующими агентами. Эмульгирующими агентами по данному изобретению могут служить неионные поверхностно-активные вещества, например, эфиры, с одной стороны, сорбитана, производные маннита (например, ангидроманнитолеат), глицерин, полиглицерин или пропиленгликоль, с другой стороны, эфиры олеиновой, изостеариновой, рицинолеиновой или гидроксистеариновой кислот, причем указанные эфиры при необходимости этокислированы, или блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, например, плюроники, например, Pluronic L121. Некоторые из таких эмульсий, например, TS6, TS7, TS8 и TS9, описаны в патентах США №№ 7,608,279 и 7,371,395.

По данному изобретению используются предпочтительно поперечно-сшитые полимеры акриловой или метакриловой кислоты (1), в частности, с полиалкениловыми эфирами сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны под названием карбомеров (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). Специалисты в данной области техники могут также обратиться к патенту США № 2,909,462, в котором предлагаются такие акриловые полимеры с поперечной сшивкой полигидроксисоединениями, содержащими по меньшей мере три гидроксильные группы, предпочтительно не больше восьми гидроксильных групп, причем по меньшей мере в трех из них атомы водорода заменены ненасыщенными алифатическими радикалами, содержащими по меньшей мере два атома углерода. Предпочтительно указанные радикалы содержат 2-4 атома углерода, например, винил, аллилы и другие ненасыщенные радикалы, содержащие этиленовую группу. Эти ненасыщенные радикалы могут также содержать другие заместители, например метил. Особенно пригодны по данному изобретению продукты, имеющиеся в продаже под названием «карбопол» (Carbopol; BF Goodrich, Огайо, США). В них имеются поперечные сшивки аллисахарозой или аллилпентаэритритолом. В числе этих соединений упомянем Carbopol 974P, 934P и 971P.

Среди сополимеров малеинового ангидрида и алкенильных производных предпочтительны сополимеры, обозначаемые EMA™ (Monsanto), которые представляют собой линейные или поперечно-сшитые (например, дивиниловым эфиром) сополимеры малеинового ангидрида и этилена.

Эффективное содержание адъюванта в композиции хорошо известно специалистам в данной области техники. К примеру, концентрация полимеров акриловой или метакриловой кислоты или сополимеров малеинового ангидрида и алкенильных производных в конечной вакцинной композиции должна быть от 0,01% (масса/объем) дo 1,5% (масса/объем), более предпочтительно 0,05-1% (масса/объем), предпочтительно 0,1-0,4% (масса/объем).

В одном из воплощений данного изобретения адъювантом могут быть следующие продукты: TS6 (патент США № 7,371,395), LR2, LR3 и LR4 (патент США № 7,691,368), TSAP (патент США № 20110129494), TRIGEN™ (Newport Labs), синтетические двухцепочечные РНК (например, poly-IC, poly-ICLC [HILTONOL^®]) и MONTANIDE™ (эмульсии типа «вода в масле», «вода/масло/вода», «масло в воде», IMS и Gel; все - производства SEPPIC).

В вакцинной или иммунологической композиции цитокины (5) могут присутствовать в виде белка или же экспрессироваться в организме-хозяине вместе с иммуногеном или эпитопом (эпитопами). Предпочтительна совместная экспрессия цитокина или цитокинов, обеспечиваемая тем же вектором, который обеспечивает экспрессию иммуногена или эпитопа (эпитопов), или же другим вектором.

Данное изобретение включает получение таких комбинированных композиций; например, их получают путем смешивания активных компонентов, предпочтительно вместе с адъювантом, носителем, цитокином и/или разбавителем.

Пригодные по данному изобретению цитокины включают, не ограничиваясь перечисленным здесь, колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF), интерферон α (IFNα), интерферон β (IFNβ), интерферон γ (IFNγ), интерлейкин-1α (IL-1α), интерлейкин-1β (IL-1β), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), фактор некроза опухолей α (TNFα), фактор некроза опухолей β (TNFβ), и трансформирующий фактор роста β (TGFβ). Цитокины можно вводить животному одновременно и/или последовательно с иммунологической или вакцинной композицией по данному изобретению. Так, например, вакцина по данному изобретению может содержать экзогенный полинуклеотид, который обеспечивает экспрессию in vivo подходящего цитокина, например, цитокина, соответствующего организму-хозяину, подлежащему вакцинации или индуцированию иммунологической реакции (например, для введения свинье нужен препарат, содержащий свиной цитокин).

Иммунологические композиции и/или вакцины по данном у изобретению содержат эффективное для возбуждения терапевтической реакции количество одного или более экспрессирующихся in vitro полипептидов, обсуждаемых в настоящем документе, или состоят из тих полипептидов, или в основном состоят из них; это эффективное количество можно определить без излишнего экспериментирования на основании изложенного в настоящем описании, включая те документы, которые входят в него путем отсылки, а также на основании имеющихся в данной области техники знаний.

Композиция или вакцина по данному изобретению может содержать вирусоподобные частицы (VLP), полученные in vitro или in vivo с помощью вирусного вектора, или плазмиды, или бакуловируса, в дозе от около 10² до около 10²⁰, от около 10³ до около 10¹⁸, от около 10⁴ до около 10¹⁶, от около 10⁵до около 10¹². Определять концентрацию вирусного вектора можно любыми методами титрования вирусов, включая, не ограничиваясь перечисленным здесь, флуоресцентный анализ фокусных поражений на клеточном монослое (FFA) и подсчет флуоресцентных фокусных единиц (FFU), определение TCID₅₀ (дозы инфекционного агента, инфицирующей 50% клеточной культуры), подсчет бляшкообразующих единиц (PFU) по лизису клеток и определение FAID₅₀ (50%-ной инфицирующей дозы, определенной с помощью флуоресцентно меченных антител), и вирусоподобные частицы, образовавшиеся in vitro (например, плазмиды или бакуловирусы), можно титровать с помощью методов гемагглютинации, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и электронной микроскопии. В зависимости от характера вирусоподобных частиц применяют и другие методы.

Объем доз может составлять от около 0,1 до около 10 мл, от около 0,2 до около 5 мл.

Далее данное изобретение описывается с помощью примеров, не имеющих ограничительного характера.

Примеры

Вставки ДНК, плазмиды и рекомбинантные вирусные векторы конструировали с помощью стандартных методов молекулярной биологии, описанных в работе J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2014).

Пример 1. Клонирование и экспрессирование слитых белков FMDV-E2

Ген VP1 FMDV серотипа O1 Manisa (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:1, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2) амплифицировали путем полимеразной цепной реакции (PCR) и клонировали в векторе pET30b (Novagen). Полученная плазмида pPX216 содержала слитую нуклеотидную последовательность FMDV-E2, в которой ген VP1 FMDV занимал конец 5`, а ген корового домена E2 (SEQ ID NO:3, кодирующая SEQ ID NO:4) – конец 3`.

Ген VP1 FMDV серотипа А24 (последовательность SEQ ID NO: 7, кодирующая последовательность SEQ ID NO: 8) амплифицировали путем полимеразной цепной реакции (PCR) и клонировали в векторе pET30b (Novagen). Полученная плазмида pPX236 содержала слитую нуклеотидную последовательность FMDV-E2, в которой ген VP1 FMDV занимал конец 5`, а ген корового домена E2 (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 3, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4) – конец 3`.

Ген VP1 FMDV серотипа Asia Shamir (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:13, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14) амплифицировали путем полимеразной цепной реакции (PCR) и клонировали в векторе pET30b (Novagen). Полученная плазмида pPX237 содержала слитую нуклеотидную последовательность FMDV-E2, в которой ген VP1 FMDV занимал конец 5`, а ген корового домена E2 (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:3, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4) – конец 3`.

Сконструированными плазмидами вместе с соответствующим пустым вектором трансформировали химически компетентные клетки E.coli штамма BLR(DE3) (Novagen). Бактерий выращивали согласно инструкциям производителя. Полученные культуры центрифугировали со скоростью 3200 g при температуре 4°C в течение 15 минут. Отделяли супернатант от осадка. Осадок ресуспендировали в буферном растворе следующего состава: 50 мM Tris-HCl pH 8; 300 мM NaCl; 2 мM MgCl₂; 1 мкг/мл леупептин; 1 мкг/мл пепстатин; 0,1 мг/мл лизоцим до конечной оптической плотности при 600 нм (OD_600nm) 8,0. Лизис клеток осуществляли путем трехкратного замораживания-оттаивания. Лизат инкубировали в течение 15 минут при температуре 4°C с бензоназой (Novagen) из расчета 1 мкл ферментного препарата на 1 литр культуры. Для определения уровня экспрессии анализировали по 10 мкл белков лизата путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE)), используя градиентный гель 4-12% и буферный раствор Bis-Тris с последующим окрашиванием кумасси голубым и проведением вестерн-блоттинга. Для каждого варианта (см. фиг. 3) брали два клона.

Слитые белки FMDV-E2 получали в виде нерастворимой фракции без гистидиновой метки (His-Tag) и перед рефолдингом очищали путем ионообменной (IEX) и эксклюзионной (SEC) высокоэффективной жидкостной хроматографии. Далее вестерн-блоттинг и дот-блоттинг (см. фиг. 3) показали, что полученные слитые белки FMDV-E2 имели правильные размеры и экспрессировавшийся FMDV-E2 взаимодействовал с сывороткой свиней, иммунизированных вакцинами против FMDV.

Исследование физических и биохимических свойств наночастиц FMDV-E2 проиллюстрировано на фиг. 4 и 5. Экспрессировавшиеся антигены проверяли на присутствие наночастиц путем электронной микроскопии. На фиг. 4А показаны частицы, образовавшиеся в случае отдельно взятого белка Е2. На фиг. 4В показаны частицы, образовавшиеся в случае слитого белка E2-FMDV-E2. На фиг. 4C показаны частицы, образовавшиеся в случае белка cdE2-FMDV, содержащего смесь одиночного белка E2 и слитого белка FMDV-E2 в соотношении 2:1. Полученные результаты свидетельствуют, что слитый белок FMDV-E2 образует 60-мерные частицы, сходные с частицами, образуемыми коровым доменом E2 дикого типа.

Наночастицы далее проверяли на распознавание с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя три верблюжьих однодоменных антитела (наноантитела) VHH против FMDV, обладающие тремя разными специфичностями в отношении частиц FMDV (полный капсид 146S или денатурированные капсиды - 12S-капсомеры); см. таблицу 1.

Таблица 1. Наноантитела VHH против FMDV

Полученные результаты (см. фиг. 5) показывают, что в случае наноантител VHH M170, специфичных к полному капсиду 146S FMDV O1M, значительный сигнал при анализе путем непрямого ELISA получался только тогда, когда химерный пептид слит с белком E2 и собран в наночастицы. Это говорит о том, что химерный пептид V1 FMDV представлен на наночастицах E2 в той же конформации, что и на вирусных частицах FMDV дикого типа.

Пример 2. Клиническое и серологическое исследование вакцинированных животных

Пример 2.1. Клиническое и серологическое исследование вакцин O1 Manisa

Целью данного исследования была оценка иммуногенности вакцин на основе штамма O1 Manisa вируса ящура для стандартных лабораторных (конвенциональных) свиней. Вакцину испытывали с адъювантом TS6 и с полимером (полиакриловой кислотой). Каждый из этих препаратов вводили животным путем двух инъекций с интервалом три недели (дни D0 – D21; см. таблицу 2). В день D0 возраст подопытных свиней составлял 8-9 недель. Иммуногенность оценивали в серологических тестах и по клеточно-опосредованному иммунитету (CMI) на 27-й и 42-й дни (D27, D42), как указано в таблице 3. Регистрировали следующие данные: массу тела в день D1 для рандомизации и в день D42 перед умерщвлением; серологические показатели в дни D1, D20 и D42; результаты анализа CMI в дни D27 и D42; клинические показатели (общие реакции организма в дни D1-D21 и D21-D23 и местные реакции в месте инъекции в дни D0-D2 и D21-D23).

Таблица 2. Схема иммунизации вакциной FMDV O1 Manisa в два введения в дни D0 и D21

TS6^* - эмульсия TS6, описанная в патентах США №№ 7,608,279 и 7,371,395.

Таблица 2.1. Эмульсия TS6 (см. патенты США №№ 7,608,279 и 7,371,395)

Таблица 3. Клеточный иммунный ответ

Результаты серологического исследования представлены в таблице 4 и на фиг. 11.

Таблица 4. Серонейтрализация FMDV O1 Manisa

* неоднозначные данные

Результаты, представленные в таблице 3 и на фиг. 10, демонстрируют значимую (p=0,001) разницу между группами животных, причем наилучшие результаты оказались в группах G2 и G3.

На фиг. 6 и 7 показано, что специфичные плазматические клетки выявлялись во всех группах, в которых животных иммунизировали FMDV-E2, тогда как в группе G1, в которой свиньи получали только FMDV, реакция была очень слабой. В группе G2 пo сравнению с группами G3 и G4 реакция лучше. В группе G2 наилучшие результаты получились, когда чашки Петри были покрыты FMDV-E2.

На фиг. 8 и 9 показано, что при определении γ-интерферона специфичная реакция имела место во всех группах вакцинированных животных при любой рестимуляции, но наиболее выраженная реакция наблюдалась во всех группах при рестимуляции FMDV-E2.

На фиг. 10 представлены результаты спустя 7 дней рестимуляции белком FMDV-E2 (количество В-клеток памяти, секретирующих антитела). Видно, что специфичные В-лимфоциты выявлялись во всех группах свиней с FMDV-E2, а в группе G1 (с только FMDV) реакция была слабой. В группе G2 наблюдалась более выраженная реакция, чем в группах G3 и G4. Когда чашки покрывали пептидом FMDV и AI O1M, реакция была слабее или отсутствовала. Лучшие результаты были получены в группах G2 и G3 с использованием покрытия FMDV-E2.

Итак, вакцины O1M вызывали выраженный гуморальный и клеточный иммунный ответ, специфичный к серотипу, с нейтрализующими антителами, стабильной выработкой специфического интерферона γ и наличием В-клеток памяти, указывая на хороший уровень защиты против гомологичных и гетерологичных инфекций FMDV. Эффективность испытывавшихся вакцинных продуктов оценивали серологически по серонейтрализации FMDV и иммунологически, определяя показатели клеточного иммунного ответа. Наилучшие результаты были получены с частицами FMDV-E2 и адъювантом TS6.

В области исследований инфекции FMDV известно, что для защиты животных от инфекции требуются вирионы FMDV полноценной структуры или вирусоподобные частицы, представляющие аутентичные конформационные эпитопы FMDV. Результаты, полученные путем твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), свидетельствуют, что полученные частицы из FMDV-E2 сходны по конформации поверхности с вирионами FMDV по сравнению с конструкцией E2+ FMDV-E2 или отдельно взятым пептидом FMDV. Полученные результаты демонстрируют, что из трех изученных кандидатов наилучшим в индукции нейтрализующих антител является FMDV-E2. В совокупности эти результаты показывают, что слитый белок FMDV-E2 способен вызывать иммунный ответ, достаточный для защиты от заражения FMDV.

Пример 2.2. Клиническое и серологическое исследование вакцин на основе штаммов A24 Cruzeiro и Asia1 Shamir FMDV

Целью данного исследования была оценка иммуногенности вакцин на основе штаммов A24 Cruzeiro и Asia1 Shamir FMDV для стандартных лабораторных (конвенциональных) свиней. Эффективность защиты, создаваемой композицией или вакциной по данному изобретению, от патогенного агента (FMDV) определяли путем вакцинации животных. Защитный эффект оценивали путем клинических наблюдений и/или определения вирусной нагрузки по количеству данного патогенного агента в крови и других тканях. У вакцинированных особей на разных стадиях инфекции брали образцы крови, проводили серологический анализ и определяли показатели клеточно-опосредованного иммунитета. Полученные результаты показывают, что композиция или вакцина по данному изобретению обладает иммуногенностью и обеспечивает защиту животных.

* * * * * * * *

Описав подробно некоторые воплощения данного изобретения, отметим, что, будучи изложено приведенными выше параграфами, оно не ограничивается конкретными деталями, содержащимися в настоящем документе, поскольку возможно множество их вариантов без отступления от существа и объёма данного изобретения.

Все документы, цитируемые или упоминаемые в тех документах, которые цитируются в представляемой заявке и в настоящем документе, и все документы, цитируемые или упоминаемые в документах, цитируемых в настоящем документе, а также любые инструкции производителей, описания, спецификации на продукты, технологические карты для любых продуктов, упоминаемых в настоящем документе или в любых документах, включенных в него путем отсылки, также включаются в настоящий документ путем отсылки и могут использоваться при практическом осуществлении данного изобретения.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Merial, Inc.

Audonnet, Jean-Christophe

Reynard , Frederic

Bomchil, Natalia

Sigoillot-Claude , Cecile

<120> FMDV and E2 Fusion Proteins and Uses Thereof

<130> MER 15-283.PCT

<150> 62/259,043

<151> 2015-11-23

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 246

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Polynucleotide encoding synthetic FMDV antigen corresponding to

VP1 of FMDV O1 Manisa strain

<400> 1

atggaaaatt atggtggtga aacccaggtt cagcgtcgtc agcataccga tgttagcttt 60

attctggatc gttttgttaa agtgaccccg tataatggca atagcaaata tggtgatggc 120

accgttgcaa atgttcgtgg tgatctgcag gttctggcac agaaagcagc acgtgcactg 180

ccgaccagtc cggatcaggc acgtcataaa cagaaaattg ttgcaccggt taaacagctg 240

ctgtaa 246

<210> 2

<211> 81

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> synthetic FMDV antigen corresponding to VP1 of FMDV O1 Manisa

strain

<400> 2

Met Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr

1 5 10 15

Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Tyr Asn

20 25 30

Gly Asn Ser Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly Asp

35 40 45

Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Ala Leu Pro Thr Ser Pro

50 55 60

Asp Gln Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu

65 70 75 80

Leu

<210> 3

<211> 768

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Polynucleotide sequence for Linker and Core C terminal catalytic

domain of E2 from Geobacillus stearothermophilus

<400> 3

aagcttgcag cagcagaaga aaaagcagca ccggcagcag caaaaccggc aaccaccgaa 60

ggtgaatttc cggaaacccg tgaaaaaatg agcggtattc gtcgtgcaat tgcaaaagca 120

atggttcata gcaaacatac cgcaccgcat gttaccctga tggatgaagc agatgttacc 180

aaactggttg cccaccgcaa aaaattcaaa gcaattgcag cagagaaagg cattaaactg 240

acctttctgc cgtatgttgt taaagcactg gttagcgcac tgcgtgaata tccggttctg 300

aataccagca ttgatgatga aaccgaagag atcatccaga aacactatta caatattggc 360

attgcagcag ataccgatcg tggtctgctg gttccggtta ttaaacatgc agatcgtaaa 420

ccgatttttg cactggccca agaaattaat gaactggcag aaaaagcacg tgatggtaaa 480

ctgacaccgg gtgaaatgaa aggtgcaagc tgtaccatta caaatattgg tagtgccggt 540

ggtcagtggt ttacaccggt tattaatcat ccggaagttg ccattctggg tattggtcgt 600

attgcagaaa aaccgattgt tcgtgatggt gaaattgttg cagcaccgat gctggcactg 660

agcctgagct ttgatcatcg tatgattgat ggtgcaaccg cacagaaagc actgaatcat 720

attaaacgtc tgctgagcga tccggaactg ctgctgatgg aagcatga 768

<210> 4

<211> 255

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> protein sequence for Linker and Core C terminal catalytic domain

of E2 from Geobacillus stearothermophilus

<400> 4

Lys Leu Ala Ala Ala Glu Glu Lys Ala Ala Pro Ala Ala Ala Lys Pro

1 5 10 15

Ala Thr Thr Glu Gly Glu Phe Pro Glu Thr Arg Glu Lys Met Ser Gly

20 25 30

Ile Arg Arg Ala Ile Ala Lys Ala Met Val His Ser Lys His Thr Ala

35 40 45

Pro His Val Thr Leu Met Asp Glu Ala Asp Val Thr Lys Leu Val Ala

50 55 60

His Arg Lys Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ala Glu Lys Gly Ile Lys Leu

65 70 75 80

Thr Phe Leu Pro Tyr Val Val Lys Ala Leu Val Ser Ala Leu Arg Glu

85 90 95

Tyr Pro Val Leu Asn Thr Ser Ile Asp Asp Glu Thr Glu Glu Ile Ile

100 105 110

Gln Lys His Tyr Tyr Asn Ile Gly Ile Ala Ala Asp Thr Asp Arg Gly

115 120 125

Leu Leu Val Pro Val Ile Lys His Ala Asp Arg Lys Pro Ile Phe Ala

130 135 140

Leu Ala Gln Glu Ile Asn Glu Leu Ala Glu Lys Ala Arg Asp Gly Lys

145 150 155 160

Leu Thr Pro Gly Glu Met Lys Gly Ala Ser Cys Thr Ile Thr Asn Ile

165 170 175

Gly Ser Ala Gly Gly Gln Trp Phe Thr Pro Val Ile Asn His Pro Glu

180 185 190

Val Ala Ile Leu Gly Ile Gly Arg Ile Ala Glu Lys Pro Ile Val Arg

195 200 205

Asp Gly Glu Ile Val Ala Ala Pro Met Leu Ala Leu Ser Leu Ser Phe

210 215 220

Asp His Arg Met Ile Asp Gly Ala Thr Ala Gln Lys Ala Leu Asn His

225 230 235 240

Ile Lys Arg Leu Leu Ser Asp Pro Glu Leu Leu Leu Met Glu Ala

245 250 255

<210> 5

<211> 1011

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Polynucleotide encoding FMDV-E2 fusion protein

<400> 5

atggaaaatt atggtggtga aacccaggtt cagcgtcgtc agcataccga tgttagcttt 60

attctggatc gttttgttaa agtgaccccg tataatggca atagcaaata tggtgatggc 120

accgttgcaa atgttcgtgg tgatctgcag gttctggcac agaaagcagc acgtgcactg 180

ccgaccagtc cggatcaggc acgtcataaa cagaaaattg ttgcaccggt taaacagctg 240

ctgaagcttg cagcagcaga agaaaaagca gcaccggcag cagcaaaacc ggcaaccacc 300

gaaggtgaat ttccggaaac ccgtgaaaaa atgagcggta ttcgtcgtgc aattgcaaaa 360

gcaatggttc atagcaaaca taccgcaccg catgttaccc tgatggatga agcagatgtt 420

accaaactgg ttgcccaccg caaaaaattc aaagcaattg cagcagagaa aggcattaaa 480

ctgacctttc tgccgtatgt tgttaaagca ctggttagcg cactgcgtga atatccggtt 540

ctgaatacca gcattgatga tgaaaccgaa gagatcatcc agaaacacta ttacaatatt 600

ggcattgcag cagataccga tcgtggtctg ctggttccgg ttattaaaca tgcagatcgt 660

aaaccgattt ttgcactggc ccaagaaatt aatgaactgg cagaaaaagc acgtgatggt 720

aaactgacac cgggtgaaat gaaaggtgca agctgtacca ttacaaatat tggtagtgcc 780

ggtggtcagt ggtttacacc ggttattaat catccggaag ttgccattct gggtattggt 840

cgtattgcag aaaaaccgat tgttcgtgat ggtgaaattg ttgcagcacc gatgctggca 900

ctgagcctga gctttgatca tcgtatgatt gatggtgcaa ccgcacagaa agcactgaat 960

catattaaac gtctgctgag cgatccggaa ctgctgctga tggaagcatg a 1011

<210> 6

<211> 336

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> FMDV-E2 fusion protein sequence

<400> 6

Met Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr

1 5 10 15

Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Tyr Asn

20 25 30

Gly Asn Ser Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly Asp

35 40 45

Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Ala Leu Pro Thr Ser Pro

50 55 60

Asp Gln Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ala Ala Ala Glu Glu Lys Ala Ala Pro Ala Ala Ala Lys

85 90 95

Pro Ala Thr Thr Glu Gly Glu Phe Pro Glu Thr Arg Glu Lys Met Ser

100 105 110

Gly Ile Arg Arg Ala Ile Ala Lys Ala Met Val His Ser Lys His Thr

115 120 125

Ala Pro His Val Thr Leu Met Asp Glu Ala Asp Val Thr Lys Leu Val

130 135 140

Ala His Arg Lys Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ala Glu Lys Gly Ile Lys

145 150 155 160

Leu Thr Phe Leu Pro Tyr Val Val Lys Ala Leu Val Ser Ala Leu Arg

165 170 175

Glu Tyr Pro Val Leu Asn Thr Ser Ile Asp Asp Glu Thr Glu Glu Ile

180 185 190

Ile Gln Lys His Tyr Tyr Asn Ile Gly Ile Ala Ala Asp Thr Asp Arg

195 200 205

Gly Leu Leu Val Pro Val Ile Lys His Ala Asp Arg Lys Pro Ile Phe

210 215 220

Ala Leu Ala Gln Glu Ile Asn Glu Leu Ala Glu Lys Ala Arg Asp Gly

225 230 235 240

Lys Leu Thr Pro Gly Glu Met Lys Gly Ala Ser Cys Thr Ile Thr Asn

245 250 255

Ile Gly Ser Ala Gly Gly Gln Trp Phe Thr Pro Val Ile Asn His Pro

260 265 270

Glu Val Ala Ile Leu Gly Ile Gly Arg Ile Ala Glu Lys Pro Ile Val

275 280 285

Arg Asp Gly Glu Ile Val Ala Ala Pro Met Leu Ala Leu Ser Leu Ser

290 295 300

Phe Asp His Arg Met Ile Asp Gly Ala Thr Ala Gln Lys Ala Leu Asn

305 310 315 320

His Ile Lys Arg Leu Leu Ser Asp Pro Glu Leu Leu Leu Met Glu Ala

325 330 335

<210> 7

<211> 246

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Polynucleotide encoding synthetic FMDV antigen corresponding to

VP1 of FMDV A24 strain in pET30b

<400> 7

atggaaaatt atggtggtga aacccagatt cagcgtcgtc atcataccga tattggcttt 60

attatggatc gcttcgtgaa aatccagagc tataatggca ccagcaaata tgcagttggt 120

ggtagcggtc gtcgtggtga tatgggtagc ctggcagcac gtgttgttaa acagctgcct 180

gcaagcgtta gcagccagga tcgtcataaa cagaaaatta tcgcaccggc aaaacaactg 240

ctgtga 246

<210> 8

<211> 81

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> synthetic FMDV antigen corresponding to VP1 of FMDV A24 strain in

pET30b (pPX238)

<400> 8

Met Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg His His Thr

1 5 10 15

Asp Ile Gly Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Gln Ser Tyr Asn

20 25 30

Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly Gly Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met

35 40 45

Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys Gln Leu Pro Ala Ser Val Ser

50 55 60

Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu

65 70 75 80

Leu

<210> 9

<211> 1011

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Polynucleotide encoding FMDV (synthetic VP1 of FMDV A24

strain)-E2 fusion protein in pET30b (pPX236)

<400> 9

atggaaaatt atggtggtga aacccagatt cagcgtcgtc atcataccga tattggcttt 60

attatggatc gcttcgtgaa aatccagagc tataatggca ccagcaaata tgcagttggt 120

ggtagcggtc gtcgtggtga tatgggtagc ctggcagcac gtgttgttaa acagctgcct 180

gcaagcgtta gcagccagga tcgtcataaa cagaaaatta tcgcaccggc aaaacaactg 240

ctgaagcttg cagcagcaga agaaaaagca gcaccggcag cagcaaaacc ggcaaccacc 300

gaaggtgaat ttccggaaac ccgtgaaaaa atgagcggta ttcgtcgtgc aattgcaaaa 360

gcaatggttc atagcaaaca taccgcaccg catgttaccc tgatggatga agcagatgtt 420

accaaactgg ttgcccaccg caaaaaattc aaagcaattg cagcagagaa aggcattaaa 480

ctgacctttc tgccgtatgt tgttaaagca ctggttagcg cactgcgtga atatccggtt 540

ctgaatacca gcattgatga tgaaaccgaa gagatcatcc agaaacacta ttacaatatt 600

ggcattgcag cagataccga tcgtggtctg ctggttccgg ttattaaaca tgcagatcgt 660

aaaccgattt ttgcactggc ccaagaaatt aatgaactgg cagaaaaagc acgtgatggt 720

aaactgacac cgggtgaaat gaaaggtgca agctgtacca ttacaaatat tggtagtgcc 780

ggtggtcagt ggtttacacc ggttattaat catccggaag ttgccattct gggtattggt 840

cgtattgcag aaaaaccgat tgttcgtgat ggtgaaattg ttgcagcacc gatgctggca 900

ctgagcctga gctttgatca tcgtatgatt gatggtgcaa ccgcacagaa agcactgaat 960

catattaaac gtctgctgag cgatccggaa ctgctgctga tggaagcatg a 1011

<210> 10

<211> 336

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> FMDV (synthetic VP1 of FMDV A24 strain )-E2 fusion protein in

pET30b (pPX236)

<400> 10

Met Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg His His Thr

1 5 10 15

Asp Ile Gly Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Lys Ile Gln Ser Tyr Asn

20 25 30

Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Val Gly Gly Ser Gly Arg Arg Gly Asp Met

35 40 45

Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Val Lys Gln Leu Pro Ala Ser Val Ser

50 55 60

Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ala Ala Ala Glu Glu Lys Ala Ala Pro Ala Ala Ala Lys

85 90 95

Pro Ala Thr Thr Glu Gly Glu Phe Pro Glu Thr Arg Glu Lys Met Ser

100 105 110

Gly Ile Arg Arg Ala Ile Ala Lys Ala Met Val His Ser Lys His Thr

115 120 125

Ala Pro His Val Thr Leu Met Asp Glu Ala Asp Val Thr Lys Leu Val

130 135 140

Ala His Arg Lys Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ala Glu Lys Gly Ile Lys

145 150 155 160

Leu Thr Phe Leu Pro Tyr Val Val Lys Ala Leu Val Ser Ala Leu Arg

165 170 175

Glu Tyr Pro Val Leu Asn Thr Ser Ile Asp Asp Glu Thr Glu Glu Ile

180 185 190

Ile Gln Lys His Tyr Tyr Asn Ile Gly Ile Ala Ala Asp Thr Asp Arg

195 200 205

Gly Leu Leu Val Pro Val Ile Lys His Ala Asp Arg Lys Pro Ile Phe

210 215 220

Ala Leu Ala Gln Glu Ile Asn Glu Leu Ala Glu Lys Ala Arg Asp Gly

225 230 235 240

Lys Leu Thr Pro Gly Glu Met Lys Gly Ala Ser Cys Thr Ile Thr Asn

245 250 255

Ile Gly Ser Ala Gly Gly Gln Trp Phe Thr Pro Val Ile Asn His Pro

260 265 270

Glu Val Ala Ile Leu Gly Ile Gly Arg Ile Ala Glu Lys Pro Ile Val

275 280 285

Arg Asp Gly Glu Ile Val Ala Ala Pro Met Leu Ala Leu Ser Leu Ser

290 295 300

Phe Asp His Arg Met Ile Asp Gly Ala Thr Ala Gln Lys Ala Leu Asn

305 310 315 320

His Ile Lys Arg Leu Leu Ser Asp Pro Glu Leu Leu Leu Met Glu Ala

325 330 335

<210> 11

<211> 240

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Polynucleotide encoding synthetic FMDV antigen corresponding to

VP1 of FMDV Asia Shamir strain in pET30b (pPX239)

<400> 11

atggaaaatt atggtggtga aacccagacc gcacgtcgtc tgcataccga tgttgcattt 60

attctggatc gttttgttaa actgaccgcc tataatggta aaaccgccta tggtgaaaca 120

accagccgtc gtggtgatat ggcagcactg gcacagcgtc tgagcgcacg tctgccgacc 180

agcaccaccc aggatcgtcg taaacaagaa attattgcac cggaaaaaca ggtgctgtga 240

<210> 12

<211> 79

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Synthetic FMDV antigen corresponding to VP1 of FMDV Asia Shamir

strain in pET30b (pPX239)

<400> 12

Met Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr

1 5 10 15

Asp Val Ala Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Ala Tyr Asn

20 25 30

Gly Lys Thr Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Ser Arg Arg Gly Asp Met Ala

35 40 45

Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Ala Arg Leu Pro Thr Ser Thr Thr Gln

50 55 60

Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Val Leu

65 70 75

<210> 13

<211> 1005

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Polynucleotide encoding FMDV (synthetic VP1 of FMDV Asia Shamir

strain)-E2 fusion protein in pET30b (pPX237)

<400> 13

atggaaaatt atggtggtga aacccagacc gcacgtcgtc tgcataccga tgttgcattt 60

attctggatc gttttgttaa actgaccgcc tataatggta aaaccgccta tggtgaaaca 120

accagccgtc gtggtgatat ggcagcactg gcacagcgtc tgagcgcacg tctgccgacc 180

agcaccaccc aggatcgtcg taaacaagaa attattgcac cggaaaaaca ggtgctgaag 240

cttgcagcag cagaagaaaa agcagcaccg gcagcagcaa aaccggcaac caccgaaggt 300

gaatttccgg aaacccgtga aaaaatgagc ggtattcgtc gtgcaattgc aaaagcaatg 360

gttcatagca aacataccgc accgcatgtt accctgatgg atgaagcaga tgttaccaaa 420

ctggttgccc accgcaaaaa attcaaagca attgcagcag agaaaggcat taaactgacc 480

tttctgccgt atgttgttaa agcactggtt agcgcactgc gtgaatatcc ggttctgaat 540

accagcattg atgatgaaac cgaagagatc atccagaaac actattacaa tattggcatt 600

gcagcagata ccgatcgtgg tctgctggtt ccggttatta aacatgcaga tcgtaaaccg 660

atttttgcac tggcccaaga aattaatgaa ctggcagaaa aagcacgtga tggtaaactg 720

acaccgggtg aaatgaaagg tgcaagctgt accattacaa atattggtag tgccggtggt 780

cagtggttta caccggttat taatcatccg gaagttgcca ttctgggtat tggtcgtatt 840

gcagaaaaac cgattgttcg tgatggtgaa attgttgcag caccgatgct ggcactgagc 900

ctgagctttg atcatcgtat gattgatggt gcaaccgcac agaaagcact gaatcatatt 960

aaacgtctgc tgagcgatcc ggaactgctg ctgatggaag catga 1005

<210> 14

<211> 334

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> FMDV (synthetic VP1 of FMDV Asia Shamir strain )-E2 fusion

protein in pET30b (pPX237)

<400> 14

Met Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr

1 5 10 15

Asp Val Ala Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Leu Thr Ala Tyr Asn

20 25 30

Gly Lys Thr Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Ser Arg Arg Gly Asp Met Ala

35 40 45

Ala Leu Ala Gln Arg Leu Ser Ala Arg Leu Pro Thr Ser Thr Thr Gln

50 55 60

Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Val Leu Lys

65 70 75 80

Leu Ala Ala Ala Glu Glu Lys Ala Ala Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala

85 90 95

Thr Thr Glu Gly Glu Phe Pro Glu Thr Arg Glu Lys Met Ser Gly Ile

100 105 110

Arg Arg Ala Ile Ala Lys Ala Met Val His Ser Lys His Thr Ala Pro

115 120 125

His Val Thr Leu Met Asp Glu Ala Asp Val Thr Lys Leu Val Ala His

130 135 140

Arg Lys Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ala Glu Lys Gly Ile Lys Leu Thr

145 150 155 160

Phe Leu Pro Tyr Val Val Lys Ala Leu Val Ser Ala Leu Arg Glu Tyr

165 170 175

Pro Val Leu Asn Thr Ser Ile Asp Asp Glu Thr Glu Glu Ile Ile Gln

180 185 190

Lys His Tyr Tyr Asn Ile Gly Ile Ala Ala Asp Thr Asp Arg Gly Leu

195 200 205

Leu Val Pro Val Ile Lys His Ala Asp Arg Lys Pro Ile Phe Ala Leu

210 215 220

Ala Gln Glu Ile Asn Glu Leu Ala Glu Lys Ala Arg Asp Gly Lys Leu

225 230 235 240

Thr Pro Gly Glu Met Lys Gly Ala Ser Cys Thr Ile Thr Asn Ile Gly

245 250 255

Ser Ala Gly Gly Gln Trp Phe Thr Pro Val Ile Asn His Pro Glu Val

260 265 270

Ala Ile Leu Gly Ile Gly Arg Ile Ala Glu Lys Pro Ile Val Arg Asp

275 280 285

Gly Glu Ile Val Ala Ala Pro Met Leu Ala Leu Ser Leu Ser Phe Asp

290 295 300

His Arg Met Ile Asp Gly Ala Thr Ala Gln Lys Ala Leu Asn His Ile

305 310 315 320

Lys Arg Leu Leu Ser Asp Pro Glu Leu Leu Leu Met Glu Ala

325 330

<210> 15

<211> 38

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Linker of E2

<400> 15

Ala Ala Ala Glu Glu Lys Ala Ala Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr

1 5 10 15

Thr Glu Gly Glu Phe Pro Glu Thr Arg Glu Lys Met Ser Gly Ile Arg

20 25 30

Arg Ala Ile Ala Lys Ala

35

<---

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и может быть использовано для получения вакцин против вируса ящура (FMDV). Получена композиция, содержащая антиген FMDV - слитый белок FMDV-дигидролипоил-ацетилтрансферазы (E2). Слитый белок FMDV-E2 способен формировать частицы, имеющие сходство с природными вирионами FMDV или VLP FMDV. Изобретение обеспечивает эффективную противоящурную вакцинацию животного, восприимчивого к FMDV овцы, крупного рогатого скота, козы или свиньи. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 2 пр.

Формула