Рекомбинантная экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидным мостиком - RU2007127624A

Реферат

1. Способ получения полипептидов или белков в двухцепочечной форме, где эти две цепи связаны дисульфидным мостиком, путем рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах E.coli, где

1) полипептид или белок проявляет свою биологическую активность в виде двухцепочечного полипептида или белка с дисульфидным мостиком,

2) С-концевой аминокислотный остаток первой цепи представляет собой остаток Arg или остаток Lys,

3) вторая цепь белка/полипептида имеет на N-конце от 1 до 20 аминокислотных остатков и пентапептидную последовательность VPXGS, называемую PRS, где Х представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, где V представляет собой Val, Leu, IIe, Ala, Phe, Pro или Gly, где P представляет собой Pro, Leu, IIe, Ala, Phe, Val или Gly, где G представляет собой Gly, Leu, IIe, Ala, Pro, Phe или Val, и где S представляет собой Ser, Tyr, Trp или Thr; и

4) способ включает следующие стадии:

а) модификацию полипептида или белка на уровне нуклеиновой кислоты таким образом, что этот полипептид или белок в его модифицированной форме в его области петли имеет последовательность VPXGS, где X, V, P, G и S являются такими, как определено выше;

б) введение конструкции, модифицированной на уровне нуклеиновой кислоты, в клетки E. coli;

в) культивирование и последующий лизис клеток-хозяев, и

г) выделение двухцепочечного полипептида или белка с дисульфидным мостиком.

2. Способ по п.1, где первая цепь полипептида/белка представляет собой более легкую цепь указанного полипептида/белка, а вторая цепь представляет собой более тяжелую цепь указанного полипептида/белка, в частности, где белок представляет собой гибридный белок.

3. Способ по п.1, где полипептид или белок представляет собой ботулинический нейротоксин, в частности ботулинический нейротоксин серотипа A (BoNT(A)), и в частности фрагмент LH_N BoNT(A).

4. Способ по п.3, где PRS-последовательность VPXGS встроена между аминокислотами Leu₄₄₂ и Lys₄₄₈ BoNT(A) с делецией аминокислот 443-447, в частности, где встроена PRS-последовательность VPRGS, VPYGS, VPHGS или VPQGS.

5. Способ по п.1, где PRS-последовательность VPXGS встроена в октапептид Lys₄₃₈-IIe₄₄₅ BoNT(B), в 15-мер HiS₄₃₈-Asp₄₅₂ BoNT(C1) или в 13-мер Lys₄₁₃-IIe₄₂₅ BoNT(E) с делецией по меньшей мере одной аминокислоты, в частности, где PRS-последовательность VPXGS встроена в форме 17-мера GIITSKTKSLVPRGSKA или 18-мера RGIITSKTKSLVPRGSKA.

6. Способ по п.2, где гибридный белок имеет следующие компоненты А, В и С:

эффекторный домен, который посредством своей ферментативной активности способен ингибировать секрецию в клетках-мишенях или уничтожать их, либо домен токсина (компонент А);

последовательность петли, которая содержит последовательность VPXGS (компонент В); а также

домен, связывающий клетку, который придает клеточную специфичность слитому белку или гибридному белку (компонент С),

и возможный компонент D:

домен транслокации.

7. Способ по п.6, где домен токсина (А) представляет собой домен дифтерийного токсина, псевдомонадного экзотоксина или рицина, в частности, где домен токсина (А) представляет собой фрагмент РЕ40 (домен III, домен II и домен Ib) или фрагмент РЕЗВ (домен III и домен II) псевдомонадного экзотоксина или А-цепь рицина.

8. Способ по п.6, где домен, связывающий клетку (С), представляет собой моноклональное антитело, аффилин, белок с анкириновыми повторами, антикалин, ростовой фактор, такой как фактор роста Т-клеток альфа (TGF-альфа), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) или инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) или цитокин, такой как интерлейкин IL2, IL4 или IL6.

9. Способ по п.2, где гибридный белок имеет следующие компоненты А, В и С:

белок или олигопептид, который придает слитому белку лучшую растворимость, способствует более высокой скорости экспрессии и/или обеспечивает аффинную очистку (компонент А);

последовательность петли, содержащая последовательность VPXGS (компонент В); а также

любой тип полипептида (компонент С).

10. Способ по п.9, где компонент А представляет собой глутатион-S-трансферазу (GST), белок, связывающий мальтозу (МВР), метку His, метку Strep или метку FLAG.

11. Способ по любому из пп.1-10, где клетки E.coli представляют собой клетки E. coli К12, в частности клетки Е.coli К12 штаммов M15[pREP4], XL1-BLUE или UT5600.

12. Полипептид или белок, представленный в виде двухцепочечного полипептида/белка с дисульфидным мостиком и являющийся биологически активным, характеризующийся тем, что С-конец первой цепи полипептида/белка представляет собой остаток Arg или остаток Lys, и вторая цепь полипептида/белка содержит на М-конце от 1 до 20 аминокислотных остатков и пентапептидную последовательность VPXGS, называемую PRS, где Х представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, где V представляет собой Val, Leu, IIe, Ala, Phe, Pro или Gly, где Р представляет собой Pro, Leu, IIe, Ala, Phe, Val или Gly, где G представляет собой Gly, Leu, IIe, Ala, Pro, Phe или Val, и где S представляет собой Ser, Tyr, Trp или Thr.

13. Полипептид или белок по п.12, где первая цепь полипептида/белка представляет собой более легкую цепь указанного полипептида/белка, а вторая цепь представляет собой более тяжелую цепь указанного полипептида/белка, в частности, где С-конец первой цепи представляет собой остаток Lys.

14. Полипептид или белок по п.12 или 13, где вторая цепь имеет на N-конце пентапептидную последовательность VPXGS, гексапептидную последовательность XVPXGS или гептапептидную последовательность XXVPXGS.

15. Полипептид или белок по п.12 или 13, где этот полипептид/белок содержит ботулинический нейротоксин, производное или фрагмент ботулинического нейротоксина, в частности фрагмент LH_N, или обладает биологической активностью ботулинического нейротоксина, в частности, где этот полипептид/белок содержит ботулинический нейротоксин серотипа А (ВоМТ(А)) или обладает биологической активностью BoNT(A), в частности, где этот полипептид или белок представляет собой фрагмент LH_N ВоМТ(А) или обладает биологической активностью BoNT(A).

16. Полипептид или белок по п.12 или 13, где вторая цепь имеет на N-конце гептапептидную последовательность SLVPXGS, в частности, где Х представляет собой R, Y, Н или Q.

17. Полипептид или белок по п.12 или 13, где белок представляет собой гибридный белок, в частности, где гибридный белок имеет следующие компоненты А, В и С:

эффекторный домен, который посредством своей ферментативной активности способен ингибировать секрецию в клетках-мишенях или уничтожать их, либо домен токсина (компонент А);

последовательность петли, которая содержит последовательность VPXGS (компонент В); а также

домен, связывающий клетку, который придает клеточную специфичность слитому белку или гибридному белку (компонент С);

и возможный компонент:

домен транслокации в качестве компонента D.

18. Полипептид или белок по п.17, где домен токсина (А) представляет собой домен дифтерийного токсина, псевдомонадного экзотоксина или рицина, в частности, где домен токсина (А) представляет собой фрагмент РЕ40 (домен III, домен II и домен Ib) или фрагмент РЕ38 (домен III и домен II) псевдомонадного экзотоксина или А-цепь рицина.

19. Полипептид или белок по п.17, где домен, связывающий клетку (С), представляет собой моноклональное антитело, аффилин, белок с анкириновыми повторами, антикалин, ростовой фактор, такой как TGF-альфа, FGF, VEGF или IGF-1 или цитокин, такой как IL2, IL4 или IL6.

20. Полипептид или белок по п.17, где гибридный белок имеет следующие компоненты А, В и С:

белок или олигопептид, который придает слитому белку лучшую растворимость, способствует более высокой скорости экспрессии и/или обеспечивает аффинную очистку (компонент А);

последовательность петли, содержащая последовательность VPXGS (компонент В); а также

любой тип полипептида (компонент С),

в частности, где компонент А представляет собой глутатион-S-трансферазу (GST), белок, связывающий мальтозу (МВР), метку His, метку Strep или метку FLAG.

21. Нуклеиновая кислота, в частности ДНК, кодирующая полипептид или белок по любому из пп.12-20.

22. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.21.

23. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.22.

24. Клетка-хозяин по п.23, где эта клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку, в частности клетку E.coli, особенно клетку E.coli К12, в частности, где эта клетка-хозяин представляет собой M15[pREP4], и где вектор представляет собой плазмиду серии pQE.

25. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид или белок по любому из пп.12-20.