Способ нокаутирования гена-мишени в t-клетке in vitro и crrna, применяемая в данном способе - RU2020100919A
Код документа: RU2020100919A
Формула
1. Способ нокаутирования одного или более генов-мишеней в T-клетках in vitro, включающий стадии:
1) приведения в контакт sgRNA (одиночная направляющая РНК), нацеленных на один или более генов-мишеней в T-клетках, с белком Cas9 (CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)-ассоциированный белок), соответственно, с образованием комплекса белок-РНК;
2) смешивания комплекса белок-РНК с олигодезоксирибонуклеиновой кислотой или фрагментом ДНК молоки, и преобразование полученной смеси в T-клетки, где sgRNA направляют белок Cas9 на соответствующую последовательность-мишень гена-мишени и на гибридизацию с последовательностью-мишенью, вследствие чего ген-мишень расщепляется, и эффективность расщепления гена-мишени составляет более 75 %.
2. Способ нокаутирования одного или более генов-мишеней в T-клетках in vitro по п. 1, где ген-мишень представляет собой один или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов TRAC, TRBC, B2M и PD1, и sgRNA нацелена на кодирующую последовательность гена-мишени или регуляторную последовательность для экспрессии гена-мишени.
3. Способ нокаутирования одного или более генов-мишеней в T-клетках in vitro по п. 1 или 2, где sgRNA состоит из, от 5' к 3', crRNA (CRISPR-полученная РНК), нацеленной на ген-мишень длиной от 17 до 20 нт (нуклеотидов), связанной с tracrRNA (транс-активирующая РНК), соответствующей белку Cas9.
4. Способ нокаутирования одного или более генов-мишеней в T-клетках in vitro по любому из пп. 1-3, где олигодезоксирибонуклеиновая кислота представляет собой двухцепочечную ДНК длиной от 100 до 250 пн (пар нуклеотидов) или одноцепочечную ДНК длиной от 100 до 250 нт.
5. Способ нокаутирования одного или более генов-мишеней в T-клетках in vitro по любому из пп. 1-4, где:
crRNA, нацеленная на ген TRAC, представляет собой одну или более crRNA, выбранных из группы, состоящей из crRNA, как показано в SEQ ID NO: 1-12,
crRNA, нацеленная на ген B2M, показана в SEQ ID NO: 13, и
crRNA, нацеленная на ген PD1, представляет собой одну или более crRNA, выбранных из группы, состоящей из crRNA, как показано в SEQ ID NO: 14-16.
6. Способ нокаутирования одного или более генов-мишеней в T-клетках in vitro по любому из пп. 1-5, где белок Cas9 представляет собой белок Cas9, полученный из Streptococcus pyogenes, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18.
7. Способ нокаутирования одного или более генов-мишеней в T-клетках in vitro по любому из пп. 1-6, где последовательность tracrRNA, соответствующая белку Cas9, показана в SEQ ID NO: 17.
8. Способ нокаутирования одного или более генов-мишеней в T-клетках in vitro по любому из пп. 1-7, где T-клетка выбрана из группы, состоящей из T-клетки-хелпера, цитотоксической T-клетки, T-клетки памяти, регуляторной T-клетки, натуральной киллерной T-клетки, γδT-клеток, CAR (химерный антигенный рецептор)-T-клетки и TCR (Т-клеточный рецептор)-T-клетки.
9. T-клетки с нокаутом гена-мишени, где T-клетки получают способом по любому из пп. 1-8.
10. CrRNA для применения в нокауте гена-мишени, где crRNA включает одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16.
11. CrRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 10, где ген-мишень представляет собой один или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов TRAC, TRBC, B2M и PD1.
12. CrRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 10 или 11, где ген-мишень представляет собой ген TRAC, и crRNA представляет собой одну или более crRNA, выбранных из группы, состоящей из тех, которые показаны в SEQ ID NO: 1-12.
13. CrRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 10 или 11, где ген-мишень представляет собой ген B2M, и последовательность crRNA показана в SEQ ID NO: 13.
14. CrRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 10 или 11, где ген-мишень представляет собой ген PD1, и crRNA представляет собой одну или более crRNA, выбранных из группы, состоящей из тех, которые показаны в SEQ ID NO: 14-16.
15. SgRNA для применения в нокауте гена-мишени, где sgRNA состоит из crRNA, связанной с tracrRNA, соответствующей белку Cas9, и где crRNA включает одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16.
16. SgRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 15, где ген-мишень представляет собой один или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов TRAC, TRBC, B2M и PD1.
17. SgRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 15 или 16, где ген-мишень представляет собой ген TRAC, и crRNA представляет собой одну или более crRNA, выбранных из группы, состоящей из тех, которые показаны в SEQ ID NO: 1-12.
18. SgRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 15 или 16, где ген-мишень представляет собой ген B2M, и crRNA показана в SEQ ID NO: 13.
19. SgRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 15 или 16, где ген-мишень представляет собой ген PD1, и crRNA представляет собой одну или более crRNA, выбранных из группы, состоящей из тех, которые показаны в SEQ ID NO: 14-16.
20. SgRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 15, где белок Cas9 представляет собой белок Cas9, полученный из Streptococcus pyogenes, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18.
21. SgRNA для применения в нокауте гена-мишени по п. 15, где последовательность tracrRNA, соответствующей белку Cas9, показана в SEQ ID NO: 17.
22. Набор для применения в нокауте гена, содержащий:
a: одну или более crRNA по любому из пп. 9-14 или одну или более sgRNA по любому из пп. 15-21;
b: белок Cas9;
c: олигодезоксирибонуклеиновую кислоту или фрагмент ДНК молоки.
23. Набор для применения в нокауте гена по п. 22, где олигодезоксирибонуклеиновая кислота представляет собой двухцепочечную ДНК длиной от 100 до 250 пн или одноцепочечную ДНК длиной от 100 до 250 нт.
24. Набор для применения в нокауте гена по п. 22, где белок Cas9 представляет собой белок Cas9, полученный из Streptococcus pyogenes, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18.
25. Применение T-клеток с нокаутом гена-мишени по п. 9 для получения противоопухолевых лекарственных средств.
26. Применение T-клеток с нокаутом гена-мишени по п. 9 для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения инфекционных заболеваний, вызванных вирусом или бактериями.
