Вакцина против вируса западно-нильской лихорадки - RU2283138C2

Описание

Настоящее изобретение относится к векторам экспрессии in vivo и in vitro, содержащим и экспрессирующим, по меньшей мере, один полинуклеотид вируса западно-нильской лихорадки, а также к иммуногенным композициям и вакцинам против западно-нильской лихорадки. Также изобретение относится к методам иммунизации и вакцинации против указанного вируса.

Уровень техники

Впервые вирус западно-нильской лихорадки (West Nile Virus или WNV - вирус Западного Нила) был идентифицирован в 1937 году у жителя Уганды из провинции Западный Нил (Zeiler H.G., Med. Trop., 1999 г. №59, стр.490-494).

Будучи широко распространенным в Африке и встречающимся в Индии, Пакистане и средиземноморском регионе, этот вирус в США впервые был идентифицирован в Нью-Йорке в 1999 году (Anderson J.F. и др. Science, 1999 г., №286, стр.2331-2333).

Вирус западно-нильской лихорадки поражает как птиц, так и млекопитающих и человека.

У птиц болезнь носит характер поражения центральной нервной системы с последующей гибелью. Поражения проявляются в виде энцефалитов, кровоизлияний в миокарде, а также кровоизлияний и некрозов кишечного тракта.

У цыплят экспериментальные инфицирования посредством подкожных инокуляций выделенных из ворон вирусов западно-нильской лихорадки приводили к некрозам миокарда, нефритам и пневмонии через 5-10 суток после инокуляции, энцефалитам от средней до большой тяжести через 21 сутки после инокуляции (Senne D.A. и др., Avian Disease, 2000 г., №44, стр.642-649).

Также вирус западно-нильской лихорадки поражает лошадей, в частности, в Северной Африке и Европе (Cantile С. и др., Equine Vet. J., 2000 г., №32(1), стр.31-35). У таких лошадей отмечаются признаки атаксии, слабости задних конечностей, пареза, развивающегося в тетраплегию, с последующей гибелью. Лошади и верблюды являются основными видами животных, демонстрирующих клинические признаки в виде энцефалитов.

Антитела к вирусу западно-нильской лихорадки были обнаружены у некоторых видов грызунов и у скота, в частности, коров и овец, у домашних животных, в частности, собак (Zeiler H.G., Med. Trop., 1999 г., №59, стр.490-494; Lundstrom J. O., Journal of Vector Ecology, 1999 г., №24(1), стр.1-39).

Не пощадил вирус западно-нильской лихорадки и человека, в котором он проявляется многочиленными сиптомами (Sampson B.A., Human Pathology, 2000 г., №31(5), стр.527-531; Marra C.M., Seminars in Neurology, 2000 г., №20(3), стр.323-327).

Вирус западно-нильской лихорадки передается птицам и млекопитающим через укусы некоторых видов комаров (например, Culex, Aedes, Anopheles) и клещей.

Дикие и домашние птицы служат резервуаром вируса западно-нильской лихорадки и его распространителями вследствие миграций.

Вирионы вируса западно-нильской лихорадки представляют собой сферические частицы диаметром 50 нм, состоящие из липопротеиновой оболочки вокруг нуклеокапсида в форме двадцатигранника, содержащего РНК с одной нитью положительной полярности.

Единственная открытая рамка считывания (ORF) кодирует совокупность вирусных белков в виде полипротеина. Расщепление и созревание этого полипротеина приводит к образованию десятка разных вирусных белков. Структурные белки кодируются 5′ -областью генома и соответствуют нуклеокапсиду С (14 кДа), гликопротеину оболочки Е (50 кДа), белку предмембраны prM (23 кДа) и белку мембраны М (7 кДа). Неструктурные белки кодируются 3′ -областью генома и соответствуют белкам NS1 (40 кДа), NS2A (19 кДа), NS2B (14 кДа), NS3 (74 кДа), NS4A (15 кДа), NS4B (29 кДа), NS5 (97 кДа).

Parrish C.R. и др. (J.Gen. ViroL, 1991 г., №72, стр.1645-1653), Kulkarni A.B. и др. (J.Virol, 1992 г., №66(6), стр.3583-3592) и Hill A.B. и др. (J.Gen. Virol, 1992 г., №73, стр.1115-1123) создали на основе вируса коровьей оспы векторы экспрессии in vivo, содержащие различные вставки, соответствующие последовательностям нуклеотидов, кодирующим неструктурные белки вируса Кунджин, ассоциированные при необходимости со структурными белками. Такие векторы вводились в мышь для определения клеточной иммунной реакции. Авторы настаивают на значимости клеточной реакции, существенно стимулированной неструктурными белками, в частности, такими, как NS3, NS4A, NS4B. Указанные статьи свидетельствуют о трудности создания эффективной стратегии вакцинации против западно-нильской лихорадки.

До сегодняшнего дня не имеется вакцины для предупреждения инфекции вирусом западно-нильской лихорадки.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является создание средства для профилактики и/или борьбы против болезней, вызываемых вирусом западно-нильской лихорадки.

Другой целью изобретения является создание такого средства, которое могло бы применяться для разных видов животных, восприимчивых к болезни, вызываемой указанным вирусом, в частности, для лошадей и птиц.

Еще одной целью изобретения является создание способов иммунизации и вакцинации целевых животных.

Следующей целью изобретения является создание таких средств и способов, которые обеспечивают дифференциальную диагностику.

Следовательно, первой целью изобретения являются векторы экспрессии in vitro и/или in vivo, содержащие полинуклеодид, кодирующий белок оболочки Е вируса западно-нильской лихорадки. Кроме того, такие векторы содержат элементы, которые необходимы для экспрессии полинуклеотида в клетке хозяина.

Помимо полинуклеотида, кодирующего белок Е, векторы экспрессии согласно изобретению могут содержать один или несколько других полинуклеотидов, кодирующих другие белки вируса западно-нильской лихорадки, предпочтительно структурные белки вируса западно-нильской лихорадки, причем эти последовательности выбираются предпочтительно из последовательностей, кодирующих белок предмембраны prM и белок мембраны М.

Вектор содержит преимущественно полинуклеотид, образующий единую кодирующую рамку, соответствующую, например, prM-E, M-E, в особенности, prM-М-Е. Вектор, содержащий несколько отдельных полинуклеотидов, кодирующих разные белки (например, prM и/или М и Е), также входит в состав настоящего изобретения. Вектор, в частности, in vivo, также может содержать полинуклеотиды, соответствующие более чем одному штамму вируса западно-нильской лихорадки, в частности, двум или более полинуклеотидам, кодирующим Е или prM-М-Е разных штаммов. Как будет показано ниже, вектор, в частности, in vivo, также может содержать одну или несколько последовательностей нуклеотидов, кодирующих иммуногены других патогенных возбудителей и/или цитокины.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения вектор экспрессии содержит в себе полинуклеотид, кодирующий prM-М-Е, причем предпочтительно в единой фазе считывания.

Под полинуклеотидом, кодирующим белок вируса западно-нильской лихорадки, понимается в принципе фрагмент ДНК, кодирующий этот белок, или комплементарная нить этого фрагмента ДНК. РНК также не исключена.

В смысле настоящего изобретения термин "белок" охватывает фрагменты, в том числе пептиды и полипептиды. По определению белковый фрагмент является иммунологически активным в том смысле, что, будучи введенным в хозяина, он сохраняет способность вызывать иммунную реакцию гуморального и/или клеточного типа, направленную против белка. Предпочтительно, чтобы фрагмент белка обладал по существу одинаковой иммунологической активностью с целым белком. Фрагмент белка согласно изобретению содержит, следовательно, по меньшей мере, один эпитоп или антигенную детерминанту. Термин "эпитоп" относится к участку белка, способного вызывать иммунную реакцию гуморального (В-клетки) и/или клеточного типа (Т-клетки).

Следовательно, минимальной структурой полинуклеотида является структура, которая кодирует эпитоп или антигенную детерминанту рассматриваемого белка. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент целого белка, содержит, в частности, не менее 21 нуклеотида, а именно, по меньшей мере, 42 нуклеотида, предпочтительно, по меньшей мере, 57, 87 или 150 расположенных один за другим нуклеотидов последовательности, из которой он происходит. Способы определения эпитопов среднему специалисту хорошо известны, можно пользоваться, в частности, банками перекрывающихся пептидов (Hemmer В. и др. Immunology Today, 1998 г., №19(4), стр.163-168, Pepscan (Geysen H.M. и др., Proc. Nat. Acad. Sci., США, 1984 г., №81(13), стр.3998-4002; Geysen H.M. и др., Proc. Nat. Acad. Sci., США, 1985 г., №82(1), стр.178-182; Van der Zee R. и др., Eur. J. Immunol., 1989 г., №19(1), стр.43-47; Geysen H.M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990 г., №21(4), стр.523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмами (De Groot А. и др., Nature Biotechnology, 1999 г., №17, стр.533-561).

В частности, полинуклеотиды согласно изобретению содержат в себе нуклеотидную последовательность, кодирующую один или два трансмембранных домена, предпочтительно два, расположенных в С-концевой области белка Е. Для штамма вируса западно-нильской лихорадки NY99 эти домены соответствуют последовательностям аминокислот от 742 до 766 и от 770 до 791 банка GenBank AF196835.

Элементы для экспрессии полинуклеотида или полинуклеотидов должны присутствовать. Имеются в виду, по меньшей мере, инициирующий кодон (ATG), терминирующий кодон и промотор, а также последовательность полиаденирования в случае плазмид и вирусных векторов, иных нежели поксвирусы. В том случае, когда полинуклеотид кодирует фрагмент полипротеина, например, prM-E, M-E, prM-М-Е, инициирующий кодон ATG располагается в 5′-положении рамки считывания, а терминирующий кодон - в 3′-положении. Как будет пояснено ниже, могут присутствовать и другие элементы, обеспечивающие контроль экспрессии, такие, как активаторные (энхансер), стабилизирующие и сигнальные последовательности, обеспечивающие секрецию белка.

Объектом настоящего изобретения являются также препараты, содержащие упомянутые экспрессионные векторы. В частности, изобретение касается препаратов, содержащих один или несколько векторов экспрессии in vivo, содержащих и экспрессирующих один или несколько из указанных выше полинуклеотидов, в том числе и кодирующий Е полинуклеотид, в фармацевтически приемлемом носителе или индифферентном инертном веществе.

Согласно первому варианту осуществления изобретения другой или другие содержащиеся в препарате векторы содержат и экспрессируют один или несколько других белков вируса западно-нильской лихорадки, например, prM, M, prM-М.

Согласно второму варианту осуществления изобретения другой или другие содержащиеся в препарате векторы содержат и экспрессируют один или несколько белков другого или других штаммов вируса западно-нильской лихорадки. В частности, препарат содержит, по меньшей мере, два вектора экспрессии, в частности, in vivo полинуклеотидов разных штаммов вируса западно-нильской лихорадки, которые кодируют одинаковые и/или разные белки, предпочтительно, одинаковые. Речь идет преимущественно о векторах экспрессии in vivo E или prM-М-Е двух, трех или более разных штаммов вируса западно-нильской лихорадки. Целью изобретения являются кроме того смеси векторов экспрессии prM, M, Е, prM-М, prM-E или M-E разных штаммов.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, о котором подробнее речь пойдет ниже, другой или другие, присутствующие в препарате векторы содержат и экспрессируют один или несколько цитокинов и/или один или несколько иммуногенов другого или других патогенных возбудителей.

Целью изобретения являются также комбинации указанных разных вариантов осуществления.

Препараты, содержащие вектор экспрессии in vitro или in vivo, содержащий и экспрессирующий полинуклеотид, кодирующий prM-М-Е, являются предпочтительным вариантом осуществления изобретения.

Согласно особому варианту осуществления изобретения векторы экспрессии in vitro или in vivo содержат в качестве единственного (единственных) полинуклеотида (полинуклеотидов) вируса западно-нильской лихорадки полинуклеотид, кодирующий белок Е, при необходимости в ассоциации с prM и/или М, предпочтительно кодирующий prM-М-Е, и при необходимости сигнальную последовательность вируса лихорадки Западного Нила.

Согласно особому варианту осуществления изобретения один или несколько неструктурных белков NS2A, NS2B и NS3 экспрессируются вместе со структурными белками согласно изобретению либо посредством того же экспрессионного вектора, либо посредством отдельного экспрессионного вектора. Предпочтительно, чтобы их экспрессия происходила совместно на основе единого полинуклеотида.

Также объектом изобретения является вектор экспрессии in vitro или in vivo, содержащий полинуклеотид, кодирующий NS2A, NS2B, NS3, их комбинации, предпочтительно кодирующий NS2A-NS2B-NS3. В сущности данный вектор может быть одним из описанных выше векторов, содержать полинуклеотид, кодирующий структурный или структурные белки, в частности, Е или prM-М-Е. В одном из вариантов изобретение касается препарата, такого, как описанный выше, содержащего дополнительно, по меньшей мере, один из указанных векторов, экспрессирующих неструктурный белок, и при необходимости фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество.

Осуществление изобретения

Для получения экспрессионных векторов согласно изобретению средний специалист располагает разными штаммами вируса западно-нильской лихорадки и описанием нуклеотидной последовательности их генома. См., в частности. Savage H.M. и др., (Am.J.Trop. Med. Hyg., 1999 г., №61(4), стр.600-611), таблица 2, в которой приведены 24 штамма вируса западно-нильской лихорадки и инвентарные номера полинуклеотидных последовательностей в банке GenBank.

Например, можно отослать к штамму NY99 (GenBank AF 196835). В этом банке для каждого белка имеется точная соответствующая последовательность ДНК (нуклеотиды 466-741 для prM, 742-966 для М, 967-2469 для Е, т.е. 466-2469 для prM-М-Е, 3526-4218 для NS2A, 4219-4611 для NS2B и 4612-6468 для NS3, т.е. 3526-6468 для NS2A-NS2B-NS3). В результате сравнения и выравнивания последовательностей сразу определяется полинуклеотид, кодирующий такой белок в другом штамме вируса западно-нильской лихорадки.

Выше речь уже шла о том, что под полинуклеотидом понимается последовательность, которая кодирует белок, или фрагмент, или эпитоп, специфичный для вируса западно-нильской лихорадки. Кроме того, вследствие эквивалентности термином "полинуклеотид" охватываются также соответствующие нуклеотидные последовательности разных штаммов вируса западно-нильской лихорадки, а также последовательности нуклеотидов, которые различаются из-за вырожденности кода.

В семействе вирусов западно-нильской лихорадки идентичность между аминокислотными последовательностями prM-М-Е и таковой для NY99 достигает 90% и более. Следовательно, изобретение охватывает и полинуклеотиды, кодирующие аминокислотную последовательность, идентичность которой с природной аминокислотной последовательностью составляет 90% или более, в частности, 92%, предпочтительно 95%, более предпочтительно 98%. В качестве эквивалентов могут рассматриваться также фрагменты таких гомологичных полинуклеотидов, являющиеся специфичными для вирусов западно-нильской лихорадки.

Кроме того, в том случае, когда речь идет о полинуклеотиде вируса лихорадки Западного Нила, данный термин включает в себя и последовательности, эквивалентные в смысле настоящего изобретения.

Уже было сказано, что термином "белок" обозначаются иммунологически активные полипептиды и пептиды. Применительно к изобретению этот термин охватывает:

а) соответствующие белки разных штаммов вируса западно-нильской лихорадки;

б) белки, которые отличаются между собой, но которые сохраняют по отношению к природному белку вируса западно-нильской лихорадки идентичность, превышающую или равную 90%, в частности, 92%, предпочтительно 95% и особо предпочтительно 98%.

Следовательно, когда речь заходит о белке вируса западно-нильской лихорадки, то этим термином охватываются эквивалентные в смысле настоящего изобретения белки.

Доступ к различным штаммам вируса западно-нильской лихорадки возможен благодаря коллекциям, в частности, American Type Culture Collection (ATCC), например, под номерами доступа VR-82 или VR-1267. Вирус Кунджин (Kunjin) рассматривается в качестве подлинного вируса западно-нильской лихорадки.

Согласно изобретению предпочтительно, чтобы полинуклеотид содержал, кроме того, нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, расположенный перед экспрессируемым белком, для обеспечения его секреции. Следовательно, речь может идти об эндогенной последовательности, т.е. о природной сигнальной последовательности в случае ее существования (происходящей из того же вируса западно-нильской лихорадки или из другого штамма). Так, например, для вируса западно-нильсколй лихорадки NY99 эндогенная сигнальная последовательность Е соответствует нуклеотидам от 922 до 966 последовательности GenBank; для prM речь идет о нуклеотидах от 421 до 465. Также речь может идти о нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный сигнальный пептид, в частности, о последовательности, кодирующей сигнальный пептид тканевого активатора человеческого плазминогена (tPA) (Hartikka J. и др., Human Gene Therapy, 1996 г., №7, стр.1205-1217). Нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, встраивают в фазе и располагают перед последовательностью, кодирующей Е или ее комбинации, например, prM-М-Е.

Согласно первому варианту осуществления изобретения векторы экспрессии in vivo представляют собой вирусные векторы.

Этими экспрессионными векторами являются преимущественно поксвирусы, например, вирус осповакцины, или аттенуированные мутанты вируса осповакцины, например, MVA (штамм Ankara) (Stickl H. и Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr., 1971 г., №113, стр.1149-1153; Sutter G. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992 г., №89, стр.10847-10851; стандартный штамм АТСС VR-1508; MVA получен после более 570 пассажей штамма осповакцины "Ankara" на фибробластах куриных эмбрионов) или NYVAC (его получение описано в патенте US-A-5 494 807, в частности, в примерах 1-6;

в этом патенте описано также введение гетерологичных генов по сайтам рекомбинации и применение адаптированных промоторов; см. также WO-A-96/40241), вирус оспы птиц (в частности, оспа канареек, домашней птицы, голубей, перепелов), вирус оспы свиней, оспы енотов и оспы верблюдов, аденовирусы, такие как аденовирусы птиц, собак, свиней, крупного рогатого скота, людей, и герпесвирусы, такие как вирусы конского герпеса (EHV, серотипы 1 и 4), вирус собачьего герпеса (CHV), вирус кошачьего герпеса (FHV), вирусы герпеса крупного рогатого скота (BHV, серотипы 1 и 4), вирус свиного герпеса (PRV), вирусы болезни Марека (Marek) (MDV, серотипы 1 и 2), вирус герпеса индюшек (HVT или MDV, серотип 3), вирус герпеса уток. В случае применения вируса герпеса при вакцинации птиц предпочтительным является вектор HVT, при вакцинации лошадей предпочтительным является вектор EHV.

Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения поксвирусным эспрессионным вектором является вирус оспы канареек или оспы домашней птицы, эти вирусы оспы могут быть при необходимости аттенюированы. Можно указать на вирус оспы канареек, коммерческий доступ к которому возможен через АТСС под номером доступа VR-111. Аттенюированные вирусы оспы канареек описаны в US-A-5 756 103 и WO-A-01/05934. Также доступны многочисленные вакцинные штаммы вируса оспы домашней птицы, например, вакцина DIFTOSEC СТ®, предлагаемая ф. MERIAL, и вакцина NOBILIS® VARIOLE, предлагаемая ф. Intervet.

За сведениями о поксвирусах специалист может обратиться к WO-A-90/12882, в частности, о вирусе осповакцины - к US-A-4 769330, US-A-4722848, US-A-4603112, US-A-5110587, US-A-5494807, US-A-5762938; об оспе домашней птицы - к US-A-5174993, US-A-5505941, US-A-5766599; об оспе канареек - к US-A-57566103; об оспе свиней - к US-A-5382425; об оспе енотов - к WO-A-00/03030.

В том случае, когда вектор экспрессии является вирусом осповакцины, то инсерционными сайтами для экспрессируемого полинуклеотида (полинуклеотидов) являются, в частности, ген тимидинкиназы (ТК), ген гемагглютинина (НА), область белка включения типа A (ATI). Если речь идет об оспе канареек, то инсерционные сайты располагаются в ORF С3, С5 и С6 или образованы ими. Если в виду имеется оспа домашней птицы, то инсерционные сайты располагаются в ORF F7 и F8 или образованы ими.

Встраивание генов в вирус MVA описано в разных публикациях, в частности, в Caroll M. W. и др., Vaccine, 1997 г., №15(4), стр.387-394; Stittelaar K.J. и др., J. Virol, 2000 г., №74(9), стр.4236-4243; Sutler G. и др., Vaccine, 1994 г., №12(11), стр.1032-1040, к которым специалист может обратиться. Полный геном MVA описан Antoine G., Virology, 1998 г., №244, стр.365-396, что позволяет среднему специалисту использовать другие инсерционные сайты или промоторы.

Предпочтительно, чтобы в том случае, когда вектором экспрессии является поксвирус, экспрессируемый полинуклеотид встраивался под контроль специфичного поксвирусного промотора, в частности, промотора вируса осповакцины 7,5 кДа (Cochran и др., J. Virology, 1985 г., №54, стр.30-35), промотора вируса осповакцины I3L (Riviere и др., J. Virology, 1992 г., №66, стр.3424-3434), промотора вируса осповакцины НА (Shida, Virology, 1986 г., №150, стр.451-457), промотора вируса осповакцины ATI (Funahashi и др., J. Gen. Virol, 1988 г., №69, стр.35-47) или промотора вируса осповакцины Н6 (Taylor J. и др., Vaccine, 1988 г., №6, стр.504-508; Guo P. и др., J. Virol., 1989 г., №63, стр.4189-4198; Perkus M. и др., J. Virol., 1989 г., №63, стр.3829-3836).

Предпочтительно, чтобы при вакцинации млекопитающих экспрессионным вектором служил вирус оспы канареек. Предпочтительно, чтобы при вакцинации птиц, в частности, цыплят, уток, индюшек и гусей экспрессионным вектором служил вирус оспы канареек или оспы домашней птицы.

Если экспрессионным вектором является вирус герпеса HVT, то соответствующие инсерционные сайты располагаются во фрагменте BamHI I или фрагменте BamHI M вируса герпеса HVT. Рестрикционный фрагмент BamHI I вируса герпеса HVT содержит несколько открытых рамок считывания (ORF) и три межгенные области, а также несколько участков, предпочтительных для вставки, а именно три межгенные области 1, 2 и 3, являющиеся предпочтительными, и ORF UL55 (FR-A-2728795, US-A-5980906). Рестрикционный фрагмент BamHI M вируса герпеса HVT содержит ORF UL 43, который также является предпочтительным инсерционным сайтом (FR-A-2728794, US-A-5733554).

Если экспрессионным вектором служит вирус герпеса EHV-1 или EHV-4, то подходящими инсерционными сайтами являются, в частности, ТК, UL 43, UL 45 (ЕР-А-0668355).

Предпочтительно, чтобы в том случае, когда экспрессионным вектором является вирус герпеса, экспрессируемый полинуклеотид вводился под контролем сильного эукариотического промотора, предпочтительно промотора CMV-IE. Такие сильные промоторы описаны ниже, в относящейся к плазмидам части описания.

Согласно второму варианту осуществления изобретения векторами экспрессии in vivo являются плазмидные векторы, так называемые плазмиды.

Термин "плазмида" предполагает любую транскрипционную единицу ДНК в виде последовательности полинуклеотидов, содержащей полинуклеотид согласно изобретению, а также элементы для его экспрессии in vivo. Предпочтительной является кольцевая плазмида, сверхспирализованная или нет. Линейная форма также входит в рамки данного изобретения.

Каждая плазмида содержит промотор, обеспечивающий в клетках-хозяевах экспрессию полинуклеотида, введенного под его контроль. Речь идет, как правило, о сильном эукариотическом промоторе. Предпочтительным сильным эукариотическим промотором является немедленный ранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE) человека или мыши или при необходимости какого-либо другого происхождения, например, крысы, морской свинки. Промотор CMV-IE может содержать собственно промоторную часть, связанную или не связанную с активаторной частью (энхансером).

Можно отослать к ЕР-А-260 148, ЕР-А-323 597, US-A-5 168 062, US-A-5 385 839, US-A-4 968 615, WO-A-87/03905. Предпочтительным является CMV-IE человека (Boshart M. и др., Cell., 1985 г., №41, стр.521-530) или мыши.

В более широком смысле промотор имеет либо вирусное, либо клеточное происхождение. В качестве сильного вирусного промотора, иного, нежели CMV-IE, можно назвать ранний/поздний промотор вируса SV40 или промотор LTR вируса саркомы Рауса. В качестве сильного клеточного промотора можно указать на промотор гена цитоскелета, такого как, например, промотор десмина (Kwissa M. и др., Vaccine, 2000 г., №18(22), стр.2337-2344) или промотор актина (Miyazaki J. и др., Gene, 1989 г., №79(2), стр.269-277).

Благодаря эквивалентности субфрагменты указанных промоторов, сохраняющие адекватную промоторную активность, включены в состав настоящего изобретения, например, укороченные промоторы CMV-IE согласно WO-A-98/00166. Следовательно, понятие промотора согласно изобретению включает в себя производные и субфрагменты, сохраняющие адекватную промоторную активность, предпочтительно существенно схожую с активностью собственно промотора, из которого они происходят. Применительно к CMV-IE это понятие охватывает собственно промоторную часть и/или активаторную часть и производные и субфрагменты.

Предпочтительно, чтобы плазмиды содержали другие элементы для контроля экспрессии. В частности, целесообразно вводить стабилизирующие последовательности типа интрона, предпочтительно интрон II гена бета-глобина кролика (van Ooyen и др., Science, 1979 г., №206, стр.337-344).

В качестве сигнала полиаденилирования (polyA) для плазмид и вирусных векторов, иных, нежели поксвирусы, можно использовать, в частности, сигнал гена гормона роста быка (bGH) (US-A-5122458), сигнал гена бета-глобина кролика или сигнал вируса SV40.

Также и другие элементы для контроля экспрессии, применимые в плазмидах, могут присутствовать в векторах экспрессии на основе вируса герпеса.

Согласно другому варианту осуществления изобретения экспрессионными векторами являются векторы, используемые для экспрессии белков in vitro в соответствующей клеточной системе. Белки могут быть затем выделены из культуральной жидкости после секреции или при ее отсутствии (при отсутствии секреции проводится лизис клеток), при необходимости проводят концентрирование традиционными способами, в частности, ультрафильтрацией, и/или очищают традиционными средствами, в частности, методами аффинной, ионообменной или гель- фильтрационной хроматографии.

Продукция обеспечивается трансфекцией клеток млекопитающих плазмидами, репликацией вирусных векторов в клетках млекопитающих или птиц или репликацией бакуловируса (US-A-4745051; Vialard J. и др., J. Virol., 1990 г., №64(1), стр.37-50; Verne A., Virology, 1988 г., №167, стр.56-71), например, вируса ядреного полиэдроза Autographa californica AcNPV, в клетках насекомых (например, клетках Sf9 Spodoptera frugiperda, банк АТСС CRL 1711). В качестве клеток млекопитающих могут использоваться, в частности, клетки хомяка (например, СНО или ВНК-21), клетки обезьяны (например, COS или VERO). Таким образом изобретение распространяется и на экспрессионные векторы, содержащие полинуклеотид согласно изобретению, белки вируса западно-нильской лихорадки или продуцированные таким образом фрагменты и препараты, их содержащие.

Объектом настоящего изобретения являются также очищенные и/или концентрированные препараты белков вируса западно-нильской лихорадки. Если полинуклеотид кодирует несколько белков, которые разъединяются, то упомянутые препараты в таком случае содержат в себе разъединенные белки.

Объектом изобретения являются также иммуногенные композиции и вакцины против вируса западно-нильской лихорадки, содержащие, по меньшей мере, один вектор экспрессии in vivo согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество, а также при необходимости адъювант.

Понятие "иммуногенная композиция" включает в себя любую композицию, способную после своего введения в целевое животное вызвать иммунную реакцию, направленную против вируса западно-нильской лихорадки. Под вакциной понимается композиция, способная обеспечить эффективную защиту. Целевыми животными служат семейства лошадиных, псовых, кошачьих, воловьих, свиных и пернатых, предпочтительно, лошадь, собака, кошка, свинья и среди птиц: гуси, индюшки, куры, утки, все то, что по определению включает в себя животных-производителей, несушек, животных мясного направления.

Фармацевтически приемлемые носители или инертные вещества хорошо известны среднему специалисту. В качестве примера можно указать на солевой раствор 0,9% NaCl или фосфатный буферный раствор. Фармацевтически приемлемые носители или инертные вещества включают в себя также любое соединение или комбинацию соединений, упрощающих введение вектора, в частности, трансфекцию, и/или улучшающие сохранность.

Дозы и их объемы будут указаны ниже в общем описании методов иммунизации и вакцинации.

Иммуногенные композиции и вакцины согласно изобретению предпочтительно содержат один или несколько адъювантов, выбираемых, в частности, из обычных адъювантов. В рамках настоящего изобретения особо пригодными являются: (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, полимеры малеинового ангидрида и производного алкилена, (2) иммуностимуляторные последовательности (ISS), в частности, олигодезоксирибонуклеотидные последовательности с одним или несколькими неметилированными мотивами CpG (Klinman D.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996г., №93, стр.2879-2883; WO-A1-98/16247), (3) эмульсия "масло в воде", в частности, эмульсия SPT, описанная на стр.147 "Vaccine Disign, The Subunit and Adjuvant Approach", ред. M.Powell, M.Newman, Plenum Press, 1995 г., и эмульсия MF59, описанная на стр.183 той же публикации, (4) катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония, (5) цитокины или (6) их комбинации или смеси.

Эмульсия "масло в воде" (3), которая особо пригодна для вирусных векторов, может быть приготовлена на основе:

- легкого жидкого парафина (типа, предусмотренного Европейской фармакопеей);

- изопреноидного масла, такого как сквалан, сквален;

- масла, образующегося при олигомеризации алкенов, в частности, изобутена или децена;

- сложных эфиров кислот или спиртов с линейной алкильной группой;

- особенно растительных масел, этилолеата, пропиленгликольдикаприлата /дикапрата, глицерилтрикаприлата/ трикапрата, пропиленгликольдиолеата;

- сложных эфиров кислот или жирных спиртов с разветвленной цепью, в частности, сложных эфиров изостеариновой кислоты.

Для образования эмульсии масло применяется вместе с эмульгаторами. Эмульгаторами служат предпочтительно неионные поверхностно-активные вещества, в частности:

- сложные эфиры, с одной стороны, сорбитана, маннида (например, ангидроманнитололеата), глицерина, полиглицерина или пропиленгликоля и, с другой стороны, олеиновой, изостеариновой, рицинолевой, оксистеариновой кислот, причем указанные сложные эфиры при необходимости являются этоксилированными;

- блоксополимеры полиоксипропилен-полиоксиэтилен, в частности, Pluronic, a именно L121.

Из добавляемых полимеров типа (1) предпочтительными являются сшитые полимеры акриловой или метакриловой кислоты, в частности, сшитые полиалкиленовыми эфирами сахаров или многоатомных спиртов. Такие соединения известны под названием "карбомеры" (Pharmeuropa, т. 8, №2, июнь 1996 г.). Специалист может также обратиться к патенту US-A-2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, сшитые полигидроксилированным соединением, содержащим, по меньшей мере, 3 гидроксильных группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода, по меньшей мере, в трех гидроксилах замещены алифатическими ненасыщенными радикалами, содержащими, по меньшей мере, 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы с 2-4 атомами углерода, например, винилы, аллилы и другие ненасыщенные группы этиленового ряда. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Особо пригодными являются продукты, предлагаемые под названием Carbopol® (BF Goodrich, шт. Огайо, США). Они сшиты, в частности, аллильным производным сахарозы или аллилпентаэритритолом. Из них можно указать, в частности, на Carbopol® 974P, 934Р и 971Р.

Из сополимеров малеинового ангидрида и производного алкилена предпочтительными являются EMA® (Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена, линейные или сшитые, например, сшитые дивиниловым эфиром. Можно отослать к J. Fields и др., Nature, №186, стр.778-780, от 4 июня 1960 г.

В отношении своей структуры полимеры акриловой или метакриловой кислоты и EMA® образованы преимущественно структурными звеньями следующей формулы:

где:

- R₁ и R₂, одинаковые или разные, означают Н или СН₃,

- х=0 или 1, предпочтительно х=1,

- у=1 или 2, при этом х+у=2.

Для EMA® х=0, у=2. Для карбомеров х=у=1.

Эти полимеры растворены в воде или физиологическом растворе (NaCl при концентрации 20 г/л), показатель рН доведен до 7,3-7,4 едким натром для получения раствора адъюванта, в который будут введены экспрессионные векторы.

Концентрация полимера в конечной вакцинной композиции может достигать 0,01-1,5% (вес/объем), в частности, 0,05-1% (вес/объем), предпочтительно 0,1-0,4% (вес/объем).

Катионными липидами (4), содержащими соль четвертичного аммония и являющимися особо, но не исключительно, пригодными для плазмид, служат липиды следующей формулы:

где R₁ означает насыщенный или ненасыщенный линейный алифатический радикал с 12-18 атомами углерода, R_з означает другой алифатический радикал с 2 или 3 атомами углерода, Х - гидроксильная или аминогруппа.

Из катионных липидов предпочтительным является DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропиламмоний, WO-A-96/34109), предпочтительно с нейтральным липидом, предпочтительно с DOPE (диолеоил-фосфатидил-этаноламин; Behr J.P., 1994 г., Bioconjugate Chemistry, №5, стр.382-389), образуя DMRIE-DOPE.

Предпочтительно приготавливать смесь из плазмиды с указанным адъювантом непосредственно перед использованием, также предпочтительно перед введением смесь выдержать в течение времени, необходимого для образования комплексов, например, в течение 10-60 минут, в частности, около 30 минут.

Если присутствует DOPE, молярное соотношение DMRIE: DOPE составляет предпочтительно 95:5-5:95, в частности, 1:1.

Весовое соотношение между плазмидой и адъювантом DMRIE или DMRIE-DOPE может составлять 50:1-1:10, в частности, 10:1-1:5, предпочтительно 1:1-1:2.

Цитокин или цитокины (5) могут вводиться в композицию или вакцину в виде белка или подвергаться совместной экспрессии в хозяине вместе с иммуногеном или иммуногенами. Предпочтительной является коэкспрессия цитокина или цитокинов либо посредством того же вектора, что и вектор, экспрессирующий иммуноген, либо посредством собственного вектора.

Цитокины могут выбираться, в частности, из интерлейкина 18 (IL-18), интерлейкина 12(IL-12), интерлейкина 15(IL-15), макрофагального воспалительного белка 1α MIP-1α (macrophage inflammatory protein 1α; Marshall E. и др., Br. J. Cancer, 1997 г., №75(12), стр.1715-1720), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor). Можно указать на цитокины птиц, в частности, цыпленка, такие как cIL-18 (Schneider К. и др., J.Interferon Cytokine Res., 2000 г., №20(10), стр.879-883), cIL-15 (Xin K.-Q. и др., Vaccine, 1999 г., №17, стр.858-866), и на цитокины лошади, в частности, конский GM-CSF (WO-A-00/77210). Предпочтительно применять цитокины вакцинируемого вида животного.

В WO-A-00/77210 описаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность, соответствующие конскому GM-CSF, получение GM-CSF in vitro и конструирование векторов (плазмид и вирусных векторов), обеспечивающих экспрессию конского GM-CSF in vivo. Эти белки, плазмиды и вирусные векторы могут найти применение в иммуногенных композициях и конских вакцинах согласно изобретению. В качестве примера можно использовать плазмиду pJP097, которая описана в примере 3 данной, более ранней заявки, или использовать техническое решение этой заявки для получения других векторов или конского GM-CSF in vitro и вводить такие векторы или конский GM-CSF в иммуногенные композиции или конские вакцины согласно изобретению.

Объектом настоящего изобретения являются, кроме того, иммуногенные композиции и так называемые субъединичные вакцины, содержащие белок Е и при необходимости один или несколько других белков вируса западно-нильской лихорадки, в частности, prM или М, предпочтительно полученные экспрессией in vitro, как описано выше, а также фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество.

Фармацевтически приемлемые носители или инертные вещества среднему специалисту хорошо известны. В качестве примера можно привести солевой 0, 9%-ный раствор NaCl или фосфатный буфер.

Иммуногенные композиции и субъединичные вакцины согласно изобретению предпочтительно содержат один или несколько адъювантов, выбранных, в частности, из обычных адъювантов. В рамках настоящего изобретения особо пригодными являются: (1) полимер акриловой или метакриловой кислоты, полимер малеинового ангидрида и производного алкилена, (2) иммуностимуляторная последовательность (ISS), в частности, олигодезоксирибонуклеотидная последовательность, содержащая один или несколько неметилированных мотивов CpG (Klinman D.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996 г., №93, стр.2879-2883; WO-A1-98/16247), (3) эмульсия "масло в воде", в частности, эмульсия SPT, описанная на стр.147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", издано M. Powell, M. Newman, Plenum Press, 1995 г., и эмульсия MF59, описанная на стр.183 той же публикации, (4) эмульсия "вода в масле" (ЕР-А-639071), (5) сапонин, в частности, Quil-A, и (6) гидроксид алюминия или подобное. Разные типы адъювантов, охарактеризованные в пунктах (1), (2), (3), более подробно описаны выше в связи с вакцинами на основе экспрессионных векторов.

Дозы и их объемы приводятся ниже в рамках общего описания методов иммунизации и вакцинации.

Согласно изобретению вакцинация против вируса западно-нильской лихорадки может быть ассоциирована с другими видами вакцинации в рамках программ проведения вакцинации с применением наборов для иммунизации и вакцинации или поливалентных иммуногенных композиций и вакцин, т.е. таких, которые содержат, по меньшей мере, один компонент вакцины против вируса лихорадки Западного Нила и, по меньшей мере, один компонент вакцины против, по меньшей мере, одного другого патогенного возбудителя. Это предусматривает также экспрессию с помощью одного и того же экспрессионного вектора генов, по меньшей мере, двух патогенных вобудителей, включая и вирус западно-нильской лихорадки.

Объектом изобретения является, кроме того, иммуногенная поливалентная композиция или поливалентная вакцина против вируса лихорадки Западного Нила и, по меньшей мере, против одного другого патогена целевого животного с использованием того же вектора экспрессии in vivo, содержащего и экспрессирующего, по меньшей мере, один полинуклеотид вируса западно-нильской лихорадки согласно изобретению и, по меньшей мере, один полинуклеотид, экспрессирующий иммуноген другого патогена.

Под экспрессированным таким образом "иммуногеном" понимаются, в частности, белок, гликопротеин, полипептид или пептид, эпитоп или производное, например, полученный слитой белок, вызывающий иммунную, предпочтительно защитную реакцию.

Как уже описано выше, такие композиции или поливалентные вакцины содержат, кроме того, фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество, а также при необходимости адъювант.

Объектом изобретения является также поливалентная иммуногенная композиция или поливалентная вакцина, содержащая, по меньшей мере, один вектор экспрессии in vivo, в который встроен, по меньшей мере, один полинуклеотид вируса лихорадки Западного Нила, и, по меньшей мере, один другой вектор экспрессии, в который введен полинуклеотид, кодирующий иммуноген другого патогенного возбудителя. Как уже описано выше, такие поливалентные композиции или вакцины содержат также фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество, а также при необходимости адъювант.

Для иммуногенных композиций и поливалентных вакцин указанные другие конские патогены выбирают, в частности, из группы, включающей вирусы конской ринопневмонии EHV-1 и/или EHV-4 (предпочтительно применять иммуногены EHV-1 и EHV-4 в ассоциации), вирусы конского гриппа EIV, вирусы восточного энцефалита EEV, вирусы западного энцефалита WEV, вирусы венесуэльского энцефалита VEV (предпочтительна комбинация всех трех EEV, WEV и VEV), Clostridium tetani (столбняк) и их смеси. Предпочтительно выбирать для EHV гены gB и/или gD, для EIV - гены НА, NP и/или N, для вирусов энцефалита - С и/или Е2, для Clostridium tetani - ген, кодирующий полностью или частично субъединицу С столбнячного токсина. Это включает использование полинуклеотидов, кодирующих иммунологически активный фрагмент или эпитоп данного иммуногена.

Другие указанные патогены птиц выбираются, в частности, из группы, включающей вирусы болезни Марека MDV (серотипы 1 и 2, предпочтительно серотип 1), вирусы болезни Ньюкасла (Newcastle) NDV, вирусы болезни Гумборо IBDV, вирусы инфекционного бронхита IBV, вирусы инфекционной анемии CAV, вирусы инфекционного ларинготрахеита ILTV, вирусы энцефаломиелита AEV (или также вирусы лейкоза птиц ALV), вирусы геморрагического энтерита индюшек (HEV), вирусы пневмовироза (TRTV), вирусы птичьей чумы (грипп птиц), вирусы серозного перикардита кур, реовирусы птиц, Escherichia coli, Mysoplasma gallinarum, Mysoplasma gallisepticum, Haemophilus avium, Pasteurella gallinarum, Pasteurella multocida gallicida и их смеси. Предпочтительно выбирать для MDV гены gB и/или gD, для NDV - гены HN и/или F, для IBDV - ген VP2, для IBV - гены S (в частности, S1), М и/или N, для CAV - гены VP1 и/или VP2, для ILTV - гены gB и/или gD, для AEV - гены env и/или gag/pro, для HEV - гены 100К и экзон, для TRTV - гены F и/или G, для птичьей чумы - гены НА, N и/или NP. Это включает использование полинуклеотидов, кодирующих иммунологически активный фрагмент или эпитоп данного иммуногена.

В качестве примера в поливалентную иммуногенную композицию или поливалентную вакцину согласно изобретению, в которую при необходимости введен адъювант, как описано выше, и которая предназначена для лошадей, можно включить одну или несколько плазмид, описанных в WO-A-98/03198, в частности, в примерах 8-25 этой более ранней заявки, и плазмиды, описанные в WO-A-00/77043 и предназначенные для лошадей, в частности, плазмиды, описанные в примерах 6 и 7 этой более ранней заявки. Для птиц можно вводить, например, одну или несколько плазмид, описанных в WO-A1-98/03659, в частности, в примерах 7-27 этой заявки.

Иммуногенные композиции или рекомбинантные вакцины, такие как описанные выше, также могут быть ассоциированы, по меньшей мере, с одной традиционной вакциной (инактивированной, живой аттенуированной, субъединичной), направленной против, по меньшей мере, одного другого патогена.

Также иммуногенные композиции и субъединичные вакцины согласно изобретению могут использоваться для сочетанной вакцинации. Следовательно, объектом изобретения являются также поливалентные иммуногенные композиции и поливалентные вакцины, содержащие белок или белки согласно изобретению и один или несколько иммуногенов (термин "иммуноген" был охарактеризован выше), по меньшей мере, одного другого патогенного возбудителя (в частности, содержащегося в приведенным выше перечне) и/или другой патогенный возбудитель в неактивной или аттенуированной форме. Как было описано выше, такие композиции или поливалентные вакцины содержат, кроме того, фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество, а также при необходимости адъювант.

Объектом настоящего изобретения являются, кроме того, методы иммунизации и вакцинации указанных выше целевых животных.

Эти методы предусматривают введение эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины согласно изобретению. Такое введение может производиться, в частности, парентерально, например, подкожно, внутрикожно, внутримышечно или через рот или нос. Может проводиться одно или несколько, в частности, два введения.

Разные вакцины могут вводиться струйным инъектором, без применения иглы. Для плазмид можно также применять частицы золота с покрытием плазмидами, наносимые с возможностью проникновения в клетки кожи иммунизируемого субъекта (Tang и др., Nature, 1992 г., №356, стр.152-154).

Иммуногенные композиции и вакцины согласно изобретению содержат в себе эффективное количество экспрессионного вектора или полипептида.

В случае применения иммуногенных композиций или вакцин на основе плазмиды доза составляет, как правило, от около 10 мкг до около 2000 мкг, в частности, от около 50 мкг до около 1000 мкг. Объемы дозы могут составлять от 0, 1 до 2 мл, предпочтительно от 0,2 до 1 мл.

Указанные дозы и их объемы хорошо подходят для вакцинации лошадей и млекопитающих.

Для вакцинации видов птиц доза составляет, в частности, от около 10 мкг до около 500 мкг, предпочтительно от около 50 мкг до около 200 мкг. Объемы дозы могут составлять, в частности, от 0,1 до 1 мл, предпочтительно от 0,2 до 0,5 мл.

Специалист обладает необходимыми знаниями, позволяющими оптимизировать эффективную дозу применяемой плазмиды для каждого протокола иммунизации или вакцинации и определить наиболее приемлемый способ введения в организм.

В случае применения иммуногенных композиций или вакцин на основе поксвируса доза составляет, как правило, от около 10² бляшкообразующих единиц (б.о.е.) до около 10⁹ б.о.е.

В том случае, когда вектором является вирус осповакцины, доза для лошадей и млекопитающих составляет, в частности, от около 10⁴ б.о.е. до около 10⁹ б.о.е., предпочтительно от около 10⁶ до около 10⁸ б.о.е.; в том случае, когда вектором является вирус оспы канареек, доза составляет, в частности, от около 10⁵ б.о.е. до около 10⁹ б.о.е., предпочтительно от около 10^5,5или 10⁶ до около 10⁸ б.о.е.

В том случае, когда вектором является вирус оспы канареек, доза для видов птиц составляет, в частности, от около 10³ б.о.е. до около 10⁷ б.о.е., предпочтительно от около 10⁴ до около 10⁶ б.о.е.; в том случае, когда вектором является вирус оспы домашней птицы, доза составляет, в частности, от около 10² б.о.е. до около 10⁵ б.о.е., предпочтительно от около 10³ до около 10⁵ б.о.е.

В случае применения иммуногенных композиций или вакцин на основе вирусного вектора, иного чем поксвирусный, в частности, на основе вируса герпеса, доза составляет, как правило, от около 10³ б.о.е. до около 10⁸ б.о.е. В случае применения иммуногенных композиций или вакцин для птиц доза составляет, как правило, от около 10³ б.о.е. до около 10⁶ б.о.е. В случае применения иммуногенных композиций или вакцин для лошадей доза составляет, как правило, от около 10⁶ б.о.е. до около 10⁸ б.о.е.

Объемы дозы иммуногенных композиций вакцин для лошадей на основе вирусных векторов составляют, как правило, 0,5-2,0 мл, предпочтительно 1,0-2,0 мл, особо предпочтительно 1,0 мл. Объемы дозы иммуногенных композиций и вакцин для птиц на основе вирусных векторов составляют, как правило, 0,1-1,0 мл, предпочтительно 0,1-0,5 мл, особо предпочтительно 0,2-0,3 мл. Средний специалист обладает и для этого типа вакцины необходимыми знаниями для оптимизации количества введений в организм, способа введения и применяемых доз при каждом протоколе иммунизации. В частности, предусмотрено двухкратное введение для лошадей, например, с интервалом в 35 суток.

В случае применения иммуногенных композиций или субъединичных вакцин доза составляет, как правило, от около 10 мкг до около 2000 мкг, в частности, от около 50 мкг до около 1000 мкг. Объемы дозы иммуногенных композиций и вакцин для лошадей на основе вирусных векторов составляют, как правило, 1,0-2,0 мл, предпочтительно 0,5-2,0 мл, особо предпочтительно 1,0 мл. Объемы дозы иммуногенных композиций и вакцин для птиц на основе вирусных векторов составляют, как правило, 0,1-1,0 мл, предпочтительно 0,1-0, 5 мл, особо предпочтительно 0,2-0,3 мл. Для этого типа вакцины средний специалист располагает знаниями, необходимыми для оптимизации количества введений в организм, определения способа введения и применяемых доз для каждого протокола иммунизации.

Изобретение касается также применения вектора экспрессии in vivo и получения векторов или полипептидов согласно изобретению для приготовления иммуногенной композиции или вакцины для защиты целевых животных от вируса лихорадки Западного Нила, а также при необходимости, по меньшей мере, от другого одного патогенного возбудителя. Приведенные в остальной части описания разные признаки относятся к этому объекту изобретения.

Вакцина на основе плазмиды или вирусная вакцина, экспрессирующая один или несколько белков вируса западно-нильской лихорадки, или субъединичная вакцина против западно-нильской лихорадки согласно настоящему изобретению не вызывает у вакцинированного животного образование антител против других белков данного вируса, которые не представлены в иммуногенной композиции или вакцине. Этот признак может быть использован для разработки методов дифференциальной диагностики, которые позволяют выявлять различия между животными, инфицированными патогенным вирусом западно-нильской лихорадки, и животными, вакцинированными с использованием вакцины согласно изобретению. У последних присутствуют эти белки и/или антитела, действующие против них, и они могут быть обнаружены реакцией "антиген - антитело". Иначе обстоит дело в отношении животных, вакцинированных согласно изобретению, реакция которых отрицательная. Для осуществления такой дискриминации используют белок, не представленный в вакцине (отсутствующий или неэкспрессируемый), например, белок С или белок NS1, NS2A, NS2B или NS3, если он не представлен в вакцине.

Следовательно, объектом настоящего изобретения является применение векторов, препаратов и полипептидов согласно изобретению для приготовления иммуногенных композиций и вакцин, позволяющих отличать вакцинированных животных от инфицированных.

Объектом изобретения является также метод иммунизации и вакцинации в сочетании с методом диагностики, обеспечивающим такую дискриминацию.

Белок, выбранный для диагностики, или один из его фрагментов или эпитопов используется в качестве антигена в диагностическом тесте и/или для получения поликлональных или моноклональных антител. Средний специалист обладает знаниями и опытом для получения таких антител и для применения антигенов и/или антител в традиционных методах диагностики, например, в методе ELISA.

Далее изобретение подробнее описывается с помощью вариантов его осуществления, приводимых в качестве не ограничивающих примеров.

Примеры

Все конструкции были получены с использованием стандартных приемов молекулярной биологии (клонирование, расщепление рестрикционными ферментами, синтез комплементарной цепи ДНК, амплификация при помощи полимеразной цепной реакции, элонгация олигонуклеотида ДНК-полимеразой...), описанных Sambrook J. и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2-е издание. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York, 1989 г.). Все рестрикционные фрагменты, использованные в настоящем изобретении, и разные фрагменты, полученные полимеразной цепной реакцией (ПЦР), были выделены и очищены с использованием набора Geneclean® (BIO101 Inc. La Jolla, CA).

Пример 1. Выращивание вируса западно-нильской лихорадки

Для амплификации вирусы западно-нильской лихорадки NY99 (Lanciotti R. S. и др., Science, 1999 г., №286, стр.2333-2337) культивировали на клетках VERO (клетки почки обезьяны, доступные от American Type Culture Collection (ATCC) под номером CCL-81).

Клетки VERO помещали в культуру во флаконы Falcon 25 см² со средой Eagle-МЕМ, обогащенной 1% дрожжевым экстрактом и 10% коровьей сывороткой, содержащей около 100000 клеток на 1 мл. Клетки культивировали при +37°С в атмосфере с содержанием 5% CO₂.

Через 3 суток клеточный слой достигал конфлюэнтности. Культуральная среда была замещена средой Eagle-MEM, обогащенной 1% дрожжевым экстрактом и 0,1% бычьим сывороточным альбумином, вирус западно-нильской лихорадки добавляли в количестве 5 б.о.е. на одну клетку.

По достижении полного цитопатогенного эффекта (СРЕ) (как правило, через 48 -72 часа после добавления в культуру) вирусную суспензию отбирали, осветляли центрифугированием и замораживали при -70°С. Необходимы, как правило, 3-4 последовательных пассажа для получения одной партии вируса. Партию вируса хранили при -70°С.

Пример 2. Экстрагирование вирусной РНК из вируса западно-нильской лихорадки

Вирусную РНК, содержавшуюся в 100 мл вирусной суспензии штамма вируса западно-нильской лихорадки NY99, экстрагировали после размораживания растворами набора "High Pure™ Viral RNA Kit" (Cat #1858882, Roche Molecular Biochemicals) с соблюдением инструкции поставщика по проведению экстрагирования. Осадок РНК, полученный в конце экстрагирования, ресуспендировали в 1-2 мл стерильной дистиллированной воды, свободной от рибонуклеазы.

Пример 3. Конструирование плазмиды pFC101

Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.

Реакцию обратной транскрипции, с последующей полимеразной цепной реакцией ("ОТ-ПЦР"), проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:

FC101 (30-мер)(SEQ ID NO:l)

5' TTTTTTGAATTCGTTACCCTCTCTAACTTC 3'

и FC102 (33-мер)(SEQ ID NO:2)

5' TTTTTTTCTAGATTACCTCCGACTGCGTCTTGA 3'.

Эта пара олигонуклеотидов позволяет включить рестрикционный сайт EcoRI, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.

Синтез первой цепи кДНК производился элонгацией олигонуклеотида FC102 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.

Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 302 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC101 и FC102 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.

Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRI, затем с помощью Xbal и использовали для выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRI-Xbal длиной около 290 п.о. Этот фрагмент называется фрагментом А.

Плазмида для эукариотической экспрессии pVR1020 (C.J.Luke и др., J. of Infectious Diseases. 1997 г., №175, стр.95-97), являющаяся производной плазмиды pVR1012 (фиг.1, пример 7, WO-A-98/03199; Hartikka J. и др., 1997 г., Human Gene Therapy, №7, стр.1205-1217), содержит кодирующую рамку сигнальной последовательности активатора человеческого тканевого плазминогена (tPA).

Плазмиду pVR 1020 модифицировали путем расщепления BamHI-BgIII и инсерции последовательности, содержащей несколько сайтов для клонирования (BamHI, Notl, EcoRI, Xbal, PmII, Pstl, BgIII) и образующейся в результате спаривания следующих олигонуклеотидов:

РВ326 (40-мер) (SEQ ID NO:3)

5' GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' и РВ329 (40-мер) (SEQ ID NO:4)

5'GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT3'.

Полученный таким образом вектор имеет размер около 5105 пар оснований и называется рАВ110.

Фрагмент А лигировали с экспрессионной плазмидой рАВ110, которая предварительно была расщеплена с помощью Xbal и EcoRI, с образованием плазмиды pFC101 (5376 п.о.). Под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека) эта плазмида содержала вставку, кодирующую сигнальную последовательность активатора человеческого тканевого плазминогена tPA, за которой следовала последовательность, кодирующая белок prM.

Пример 4. Конструирование плазмиды pFC102

Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.

Реакцию обратной транскрипции, с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР"), проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:

FC103 (30-мер) (SEQ ID NO:5)

5' TTTTTTGAATTCTCACTGACAGTGCAGACA 3'

и FC104 (33-мер) (SEQ ID NO:6)

5' TTTTTTTCTAGATTAGCTGTAAGCTGGGGCCAC 3'.

Эта пара олигонуклеотидов позволяет ввести рестрикционный сайт EcoRI, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.

Синтез первой цепи кДНК проводили путем элонгации олигонуклеотида FC104 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.

Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 252 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC103 и FC104 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.

Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRI, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRI-Xbal длиной около 240 п.о. Этот фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой рАВ110 (пример 3), которая предварительно была расщеплена с помощью Xbal и EcoRI, с образованием плазмиды pFC102 (5326 п.о.). Под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека) эта плазмида содержала вставку, кодирующую сигнальную последовательность активатора человеческого тканевого плазминогена tPA, за которой следовала последовательность, кодирующая белок М.

Пример 5. Конструирование плазмиды pFC103

Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.

Реакцию обратной транскрипции, с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:

FC105 (30-мер) (SEQ ID NO:7)

5' TTTTTTGAATTCTTCAACTGCCTTGGAATG 3'

и FC106 (33-мер) (SEQ ID NO:8)

5' TTTTTTTCTAGATTAAGCGTGCACGTTCACGGA 3'.

Эта пара олигонуклеотидов позволяет встроить рестрикционный сайт EcoRI, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.

Синтез первой цепи кДНК проводили путем элонгации олигонуклеотида FC106 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.

Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 1530 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC105 и FC106 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.

Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRI, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRI-Xbal длиной около 1518 п.о. Указанный фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой рАВ110 (пример 3), которая предварительно была расщеплена с помощью Xbal и EcoRI, с получением плазмиды pFC103 (6604 п.о.). Эта плазмида содержала под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека) вставку, кодирующую сигнальную последовательность активатора человеческого тканевого плазминогена tPA, за которой следовала последовательность, кодирующая белок Е.

Пример 6. Конструирование плазмиды pFC104

Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.

Реакцию обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:

FC101 (30-мер) (SEQ ID NO:l) и FC106 (33-мер) (SEQ ID NO:8).

Эта пара олигонуклеотидов позволяет встроить рестрикционный сайт EcoRI, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.

Синтез первой цепи кДНК проводился путем элонгации олигонуклеотида FC106 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.

Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента данной 2031 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC101 и FC106 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.

Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRI, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRI-Xbal длиной около 2019 п.о. Указанный фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой рАВ110 (пример 3), которую предварительно расщепляли с помощью Xbal и EcoRI, получая плазмиду pFC104 (7105 п.о.). Эта плазмида содержала вставку, кодирующую сигнальную последовательность активатора человеческого тканевого плазминогена tPA, за которой следовала последовательность, кодирующая белок prM-М-Е, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса, или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека).

Пример 7. Конструирование плазмиды pFC105

Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.

Реакцию обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:

FC107 (30-мер) (SEQ ID NO:9)

5' TTTTTTGATATCACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3'

и FC106 (33-мер) (SEQ ID NO:8).

Эта пара олигонуклеотидов позволяет ввести рестрикционный сайт EcoRV, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3" вставки.

Синтез первой цепи кДНК проводили путем элонгации олигонуклеотида FC106 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.

Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42° С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 2076 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC106 и FC107 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.

Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRV, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRV-Xbal длиной около 2058 п.о.

Указанный фрагмент лигировали с экспрессионнной плазмидой pVR1012, которую предварительно расщепляли с помощью Xbal и EcoRV, получая плазмиду pFC105 (6953 п.о.). Эта плазмида содержала вставку, кодирующую полипротеин prM-М-Е, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса, или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека).

Пример 8. Конструирование плазмиды pFC106

Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.

Реакцию обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:

FC108 (36-мер) (SEQ ID NO:10)

5' TTTTTTGATATCATGTATAATGCTGATATGATTGAC 3'

и FC109 (З6-мер) (SEQ ID NO: 11)

5'TTTTTTTCTAGATTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC 3'

Эта пара олигонуклеотидов позволяет включить рестрикционный сайт EcoRV, рестрикционный сайт Xbal, инициириующий кодон ATG в позиции 5' и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.

Синтез первой цепи кДНК проводился путем элонгации олигонуклеотида FC109 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.

Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 2973 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC108 и FC109 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.

Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRV, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRV-Xbal длиной около 2955 п.о.

Указанный фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой pVR1012, которую предварительно расщепляли с помощью Xbal и EcoRV, получая плазмиду pFC106 (7850 п.о.). Эта плазмида содержала вставку, кодирующую полипротеин NS2A-NS2B-NS3, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса, или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека).

Пример 9. Конструирование плазмиды-донора для инсерции в сайт С5 вируса оспы канареек ALVAC

На фиг.16 описания изобретения US-A-5 756 103 приведена последовательность фрагмента длиной 3199 п.о. геномной ДНК вируса оспы канареек. Анализ этой последовательности обнаружил открытую рамку считывания (ORF), которую обозначили C5L и которая начинается в позиции 1538 и оканчивается в позиции 1859. Конструирование инсерционной плазмиды, приводящей к делеции ORF C5L и ее замещению сайтом множественного клонирования, фланкированным сигналами прерывания транскрипции и трансляции, проводилось, как описано ниже.

Реакция ПЦР проводилась на основе матрицы, представленной геномной ДНК вируса оспы канареек, с использованием следующих олигонуклеотидов:

С5А1 (42-мер) (SEQ ID NO: 12)

5' ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC 3'

и С5В1 (73-мер) (SEQ ID NO: 13)

5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTGA GAGTACCACTTCAGCTACCTC 3' с целью выделения ПНР-фрагмента длиной 223 п.о. (фрагмент В).

Реакцию ПЦР проводили на основе матрицы, представленной геномной ДНК вируса оспы канареек, с использованием следующих олигнуклеотидов:

С5С1 (72-мер) (SEQ ID NO: 14):

5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCATTATAAA GATCTAAAATGCATAATTTC 3'

и C5D1 (45-мер) (SEQ ID NO: 15):

5'GATGATGGTACCGTAAACAAATATAATGAAAAGTATTCTAAACTA3' с целью выделения ПЦР-фрагмента длиной 482 п.о. (фрагмент С).

Фрагменты В и С подвергли совместной гибридизации для использования в качестве матрицы во время реакции ПЦР, проводившейся с использованием олигонуклеотидов С5А1 (последовательность ID №12) и C5D1 (последовательность ID №15), для получения ПЦР-фрагмента длиной 681 п.о. Этот фрагмент был расщеплен рестрикционными ферментами Sacl и Kpnl для выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента Sacl-Kpnl длиной 664 п.о. Указанный фрагмент лигировали с вектором pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA, Cat # 212205), который предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Sacl и Kpnl, для получения плазмиды pC5L. Последовательность этой плазмиды проверялась секвенированием. Эта плазмида содержала 166 п.о. последовательности, расположенной выше ORF C5L ("левое фланкирующее плечо С5"), сигнал раннего прерывания транскрипции вируса осповакцины, терминирующие кодоны в 6 фазах считывания, сайт множественного клонирования, содержащий рестрикционные сайты Smal, Pstl, Xhol и EcoRI, а также 425 п.о. последовательности, расположенной ниже ORP C5L ("правое фланкирующее плечо С5").

Плазмида pMP528HRH (Perkus М. и др., J. Virol, 1989 г., №63, стр.3829-3836) использовалась в качестве матрицы для амплификации полной последовательности промотора Н6 осповакцины (GenBank, номер доступа V28351) с использованием следующих олигонуклеотидов:

JCA291 (34-мер) (SEQ ID NO: 16)

5'AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3'

и JCA292 (43-мер) (SEQ ID NO: 17)

5'AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG3'

для амплификации ПЦР-фрагмента длиной 149 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Smal и EcoRI для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Smal-EcoRI длиной 138 п.о. Указанный фрагмент был лигирован с плазмидой pC5L, предварительно расщепленной с помощью Smal и EcoRI, для получения плазмиды pFC107.

Пример 10. Конструирование рекомбиниантного вируса vCP1712

Реакцию ПЦР проводили с использованием плазмиды pFC105 (пример 7) в качестве матрицы и следующих олигонуклеотидов:

FC110 (33-мер) (SEQ ID NO:18):

5'TTTTCGCGAACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'

и FC 111 (39-мер) (SEQ ID NO:19)

5'TTTTGTCGACGCGGCCGCTTAAGCGTGCACGTTCACGGA3'

для амплификации ПЦР-фрагмента длиной около 2079 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Nrul-Sall длиной около 2068 п.о. Затем этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), предварительно расщепленной рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC108.

Плазмиду pFC108 линеаризовали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя описанный выше способ осаждения фосфатом кальция (Panical и Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci., 1982 г., №79, стр.4927-4931; Piccini и др., In Methods in Enzymology, 1987 г., №153, стр.545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Положительные бляшки отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина оболочки Е. Эти бляшки подвергали четырем последовательным циклам отбора/очистки бляшек до выделения чистой популяции. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между донорной плазмидой pFC108 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, затем амплифицировали, и шток полученного рекомбинантного вируса обозначили VCP1712.

Пример 11. Конструирование рекомбинантного вируса VCP1713

Плазмиду pFC104 (пример 6) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Sall и Pmll для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmall-Sall длиной около 2213 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), которую предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC109.

Плазмиду pFC109 линеаризировали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ из примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC109 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина оболочки Е, и подвергли амплификации. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили VCP1713.

Пример 12. Конструирование рекомбинантного вируса VCP1714

Плазмиду рFС103 (пример 5) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Sall и Pmll для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-Sall длиной около 1712 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), которую предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC110.

Плазмиду pFC110 линеаризировали с помощью Noti, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ из примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC110 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина оболочки Е, и подвергали амплификации. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили vCP1714.

Пример 13. Конструирование рекомбинантного вируса VCP1715

Плазмиду pFC102 (пример 4) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Sall и Pmll для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-Sall длиной около 434 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), которую предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC111.

Плазмиду pFC111 линеаризировали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ из примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC111 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина мембраны М, и подвергали амплификации. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили VCP1715.

Пример 14. Конструирование рекомбинантного вируса VCP1716

Плазмиду pFC101 (пример 3) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Sall и Pmll для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-Sall длиной около 484 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), которую предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC112.

Плазмиду pFC112 линеаризировали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ из примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC112 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина предмембраны prM, и подвергали амплификации. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили vCP1716.

Пример 15. Конструирование плазмиды-донора для инсерции в сайт С6 вируса оспы канареек ALVAC

На фиг.4 описания изобретения WO-A-01/05934 представлена последовательность фрагмента длиной 3700 п.о. геномной ДНК вируса оспы канареек. Анализ этой последовательности обнаружил открытую рамку считывания (ORF), которую обозначили C6L и которая начинается в позиции 377 и оканчивается в позиции 2254. Конструирование инсерционной плазмиды, приводящей к делеции ORF C6L и к ее замещению сайтом множественного клонирования, фланкированным сигналами прерывания транскрипции и трансляции, проводилось, как описано ниже.

Реакция ПЦР проводилась на основе матрицы, представленной геномной ДНК вируса оспы канареек, с использованием следующих олигонуклеотидов:

С6А1 (42-мер) (SEQ ID NO:20)

5' ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT 3'

и С6В1 (73-мер) (SEQ ID NO:21)

5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGT AAGTAAGTATTTTTATTTAA 3' с целью выделения ПЦР-фрагмента длиной 432 п.о. (фрагмент D).

Реакцию ПЦР проводили на основе матрицы, представленной геномной ДНК вируса оспы канареек, с использованием следующих олигнуклеотидов:

С6С1 (72-мер) (SEQ ID NO:22)

5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATrGATTAACTAGTCAAATGAGT ATATATAATTGAAAAAGTAA 3'

и C6D1 (45-мер) (SEQ ID NO:23)

5'GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG3'

с целью выделения ПЦР-фрагмента длиной 1210 п.о. (фрагмент Е).

Фрагменты D и Е подвергали совместной гибридизации для использования в качестве матрицы в реакции ПЦР, проводившейся с применением олигонуклеотидов С6А1 (SEQ ID NO:20) и C6D1 (SEQ ID NO:23), для получения ПЦР-фрагмента длиной 1630 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Sacl и Kpnl для выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента Sacl-Kpnl длиной 1613 п.о. Указанный фрагмент лигировали с вектором pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA, Cat # 212205), который предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Sacl и Kpnl, для получения плазмиды pC6L. Последовательность этой плазмиды проверялась секвенированием. Эта плазмида содержала 370 п.о. последовательности, расположенной выше ORF C6L ("левое фланкирующее плечо С6"), сигнал раннего прерывания транскрипции вируса осповакцины, терминирующие кодоны в 6 фазах считывания, сайт множественного клонирования, содержащий рестрикционные сайты Smal, Pstl, Xhol и EcoRI, а также 1156 п.о. последовательности, расположенной ниже ORF C6L ("правое фланкирующее плечо С6").

Плазмида pMPIVC (Schmitt J.F.C. и др., J. Virol, 1988 г., №62, стр.1889-1897;

Saiki R.K. и др., Science, 1988 г., стр.487-491) использовалась в качестве матрицы при амплификации полной последовательности промотора 13L вируса осповакцины с использованием следующих олигонуклеотидов:

FC113 (33-мер) (SEQ ID NO:24)

5'AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT3'

и FC113 (43-мер) (SEQ ID NO:25)

5'AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTrGT3'

для амплификации ПЦР-фрагмента длиной 151 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Smal и EcoRI для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Smal-EcoRI длиной 136 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pC6L, предварительно расщепленной с помощью Smal и EcoRI, для получения плазмиды pFC113.

Пример 16. Конструирование рекомбинантных вирусов vCP1717 и vCP1718

Реакцию ПЦР проводили с использованием плазмиды pFC106 (пример 8) в качестве матрицы и следующих олигонуклеотидов:

FC114 (33-мер) (SEQ ID NO:26)

5'TTTCACGTGATGTATAATGCTGATATGATTGAC3'

и FC115 (42-мер) (SEQ ID NO:27)

5'TTTTGGATCCGCGGCCGCTTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC3'

для амплификации ПЦР-фрагмента размером около 2973 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Pmll и BamHl для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-BamHl размером около 2958 п.о. (фрагмент F). Плазмиду pFC113 (пример 15) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Pmll и BamHl для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-BamHl размером около 4500 п.о. (фрагмент G). Фрагменты F и G лигировали друг с другом для получения плазмиды pFC114.

Плазмиду pFC114 линеаризовали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек vCP1713 (пример 11), используя описанный выше способ осаждения фосфатом кальция (Panicali и Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci., 1982 г., №79, стр.4927-4931; Piccini и др.. In Methods in Enzymology, 1987 г., №153, стр.545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Положительные бляшки отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина оболочки Е. Эти бляшки подвергали четырем последовательным циклам отбора/очистки до выделения чистой популяции. Бляшку, представлявшую результат рекомбинации in vitro между плазмидой pFC114 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, затем амплифицировали, и шток полученного рекомбинантного вируса обозначили vCP1717.

Линеаризованная с помощью Notl плазмида pFC114 также была использована для трансфекции первичных клеток куриного эмбриона, инфицированных вирусом оспы канареек vCP1712 (пример 10), с применением описанного выше способа. Шток полученного при этом рекомбинантного вируса обозначили vCP1718.

Пример 17. Конструирование плазмиды pFC115

Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.

Реакцию обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с применением 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:

FC116 (39-мер) (SEQ ID NO:28)

5'TTTTTTGATATCATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'

и FC106 (33-мер) (SEQ ID NO:8).

Эта пара олигонуклеотидов позволяет ввести рестрикционный сайт EcoRV, рестрикционный сайт Xbal и инициириующий кодон в позиции 5', а терминирующий кодон в позиции 3' вставки.

Синтез первой цепи кДНК проводится путем элонгации олигонуклеотида FC106 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.

Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 2079 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC106 и FC116 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.

Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRV, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRV-Xbal размером около 2061 п.о.

Указанный фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой pVR1012, которую предварительно расщепляли с помощью Xbal и EcoRV, для получения плазмиды рFС115 (6956 п.о.). Эта плазмида содержала вставку, кодирующую полипротеин prM-М-Е, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса, или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека).

Пример 18. Конструирование рекомбинантных вирусов vCP2017

Реакцию ПЦР проводили с использованием плазмиды pFC115 (пример 17) в качестве матрицы и следующих олигонуклеотидов:

FC117 (33-мер) (SEQ ID NO:29)

5'TTTTCGCGAATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'

и FC111 (39-мер) (SEQ ID NO: 19)

для амплификации ПЦР-фрагмента размером около 2082 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Nrul-Sall размером около 2071 п.о. Затем эту плазмиду лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), предварительно расщепленной рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC116.

Плазмиду pFC116 линеаризировали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC116 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности глико оболочки Е, и амплифицировали. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили vCP2017.

Пример 19. Приготовление рекомбинантных вакцин

Для приготовления конских вакцин рекомбинантный вирус оспы канареек vCP1712 (пример 10) вводили в растворы карбомера, а именно Carbopol™ 974P, выпускаемый BF Goodrich, штат Огайо, США (молекулярный вес около 3000000).

Резервный 1,5%-ный раствор Carbopol™ 974P приготовили с использованием дистиллированной воды с содержанием 1 г/л хлорида натрия. Этот резервный раствор применяли для приготовления раствора с содержанием 4 мг/мл Carbopol™ 974P в физиологическом растворе. Резервный раствор смешивали с соответствующим объемом физиологического раствора либо в одну стадию, либо в несколько последовательных стадий, при этом значение рН поддерживалось на каждом этапе добавкой 1N раствора гидроксида натрия (или более концентрированного) для получения конечного значения рН 7,3-7,4.

Полученный таким образом готовый к употреблению раствор Carbopol™ 974P использовали для разведения лиофилизированных рекомбинантных вирусов или для разбавления концентрированных резервных растворов рекомбинантных вирусов. Так, например, для получения вирусной суспензии с содержанием 10⁸ б.о.е. на дозу объемом 1 мл резервный вирусный раствор разбавляют до концентрации 10^8,3 б.о.е. на мл, после чего разбавляют равным объемом указанного готового к употреблению раствора Carbopol™ 974P с концентрацией 4 мг/мл.

Рекомбинантные вакцины могут быть также приготовлены с использованием рекомбинантных вирусов оспы канареек vCP1713 (пример 11) или vCP1717 (пример 16), или vCP1718 (пример 16), или vCP2017 (пример 18), или смеси из трех вирусов оспы канареек vCP1714 (пример 12), vCP1715 (пример 13) и vCP1716 (пример 14), применяя описанный выше способ.

Пример 20. Приготовление конских ДНК-вакцин

Раствор ДНК, содержащий плазмиду pFC104 (пример 6), концентрировали осаждением этанолом, как описано в Sambrook и др. (1989 г.). Осадок ДНК перерастворяли в 0,9%-ном растворе NaCl до концентрации 1 мг/мл. Приготовили 0,75 мМ раствор DMRIE-DOPE растворением лиофилизованного вещества DMRIE-DOPE в соответствующем объеме стерильной воды.

Образования комплексов плазмидной ДНК с липидами достигали разбавлением в равных частях 0,75 мМ раствора DMRIE-DOPE (1: 1) раствором ДНК 1 мг/мл в 0,95%-ном NaCl. Раствор ДНК постепенно вводили через зачеканенную иглу 26G по стенке сосуда с раствором катионного липида, избегая пенообразования. Производили осторожное встряхивание после смешивания обоих растворов. В результате получили композицию с содержанием 0,375 мМ DMRIE-DOPE и 500 мкг/мл плазмиды.

Желательно, чтобы комплект растворов, используемый при всех описанных выше операциях, имел комнатную температуру окружающей среды. Для образования комплекса ДНК/DMRIE-DOPE выдерживали перед иммунизацией животных в течение 30 мин при температуре окружающей среды.

ДНК-вакцины могут быть также получены с помощью растворов ДНК, содержащих плазмиды pFC104 (пример 6) и pCF 106 (пример 8) или плазмиды pFC105 (пример 7) и pCF 106, плазмиды pCF 115 (пример 17) и pFC106 или плазмиды pFC101, pFC102 и pFC103 (примеры 3-5), или плазмиду pFC105 или pFC115 с использованием способа, описанного в данном примере.

Пример 21. Тесты на экспрессию in vitro

Экспрессию белков вируса лихорадки Западного Нила тестировали для каждой конструкции традиционными методами непрямой иммунофлуоресценции и методами Вестерн-блоттинга.

Эти тесты проводились на 96-луночных планшетах, содержавших клетки СНО, выращенные в монослое, и трансфицированных плазмидами или содержавшими клетки CEF, выращенные в монослое и инфицированные рекомбинантными вирусами.

Белки вирусов западно-нильской лихорадки обнаруживали с помощью сывороток инфицированных лошадей или цыплят и меченых антисывороток.

Размер полученных фрагментов после миграции в геле агарозы сравнивали с ожидаемыми размерами.

Пример 22. Эффективность воздействия на животных

Рекомбинантные и плазмидные вакцины вводили в два приема с интервалом около двух недель в организм невакцинированных цыплят EOPS в возрасте около 7 дней внутримышечно в объеме около 0,1 мл. В исследование была включена контрольная невакцинированная группа цыплят.

Цыплятам вводили внутрикожно в шею 10^3-4 TCID₅₀ патогенного вируса западно-нильской лихорадки.

Наблюдались виремия, антительный ответ и смертность. Вскрытия производились для определения патологических изменений.

Пример 23. Титрование нейтрализующих антител к вирусу лихорадки Западного Нила

Для каждой сыворотки делали серию разведений из расчета 1: 3 в среде DMEM с добавкой 10% эмбриональной телячьей сыворотки в 96-луночных планшетах с клеточной культурой. К 0,05 мл разбавленной сыворотки добавили 0,05 мл культуральной среды, содержавшей приблизительно 100 DICC₅₀/мл вируса западно-нильской лихорадки. Полученную смесь инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% CO₂.

В каждую смесь затем добавили 0,15 мл суспензии клеток VERO, содержавшей около 100000 клеток на 1 мл. Через 4-5 суток выращивания при температуре 37°С в атмосфере с содержанием 5% СО₂ наблюдали через фазово-контрастный микроскоп за цитопатическим эффектом (ЕСР). Нейтрализующие титры каждой сыворотки рассчитывали по методу Кербера. Титры представлены в виде наибольшего разведения, ингибировавшего цитопатический эффект в 50% лунок. Титры выражены в форме log10 VN50. Каждую сыворотку титровали, по меньшей мере, дважды, преимущественно четырежды.

Пример 24. Испытание vCP2017 на лошадях

Рекомбинантные вакцины, содержавшие vCP2017 (пример 18), приготовленные непосредственно перед применением и содержавшие 1 мл адъюванта Carbopol® 974P (4 мг/мл), инъецировали в два приема с интервалом в 35 дней невакцинированным лошадям в возрасте 3 месяцев внутримышечно в объеме около 1 мл. Вакцинировали три группы животных с применением дозы 10^5,8DICC₅₀ (т.е. 10^5,64 б.о.е.) для группы 1, 10^6,8 DICC₅₀ (т.е. 10^6,64 б.о.е.) для группы 2 и 10^7,8 DICC₅₀ (т.е. 10^7,64 б.о.е.) для группы 3. В исследованиях участвовала контрольная невакцинированная группа животных.

Проводили серологическое исследование. Титры нейтрализующих антител были определены и выражены в форме log10 VN50, как указано в примере 23.

Реферат

Изобретение относится к области вирусологии и ветеринарии. Предложена вакцина для защиты лошадей, собак, кошек, крупного рогатого скота, свиней и птиц от вируса лихорадки Западного Нила. Вакцина содержит один или несколько рекомбинантных вирусов оспы птиц NYVAC или MVA и экспрессирует белки prM, M и Е вируса западно-нильской лихорадки. Изобретение может быть использовано в ветеринарии для вакцинации животных против вируса лихорадки Западного Нила. 21 з.п. ф-лы, 1 табл.

Формула