Способ скрининга ингибиторов гамма-секретазы - RU2005140567A

Реферат

1. Способ обнаружения активности γ -секретазы, который заключается в том, что

А. используют трансген, кодирующий слитый белок, содержащий

а) первую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, содержащий аминокислотную последовательность GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID NO:1);

b) вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, у 5'-конца первой нуклеотидной последовательности;

с) промотор и

d) при необходимости, дополнительные кодирующие и/или некодирующие нуклеотидные последовательности;

В. данный трасген вводят в клетку и экспрессируют слитый белок;

С. слитый белок расщепляют внутри аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 γ-секретазой, присутствующей в клетке, в результате чего образуется первый неполный белок, содержащий аминокислотную последовательность GAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO:2), и второй неполный белок, содержащий аминокислотную последовательность VIVITLVML (SEQ ID NO:3); и

D. обнаруживают первый неполный белок и/или второй неполный белок;

и отличается тем, что за исключением SEQ ID NO:1 указанный слитый белок не содержит ни одного пептида, действующего в качестве сигнала для эндо- или экзоцитоза, и/или сайта расщепления протеазой.

2. Способ обнаружения активности γ-секретазы, который заключается в том, что

А. используют трансген, кодирующий слитый белок и содержащий нижеследующие элементы:

а) первую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, содержащий аминокислотную последовательность GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID NO:1);

b) вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, у 5'-конца первой нуклеотидной последовательности;

с) промотор и

d) при необходимости дополнительные кодирующие и/или некодирующие нуклеотидные последовательности;

В. данный трасген вводят в клетку и экспрессируют слитый белок;

С. слитый белок расщепляют внутри аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 γ-секретазой, присутствующей в клетке, в результате чего образуется первый неполный белок, содержащий аминокислотную последовательность GAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO:2), и второй неполный белок, содержащий аиминокислотную последовательность VIVITLVML (SEQ ID NO:3); и

D. определяют количество второго неполного белка и активность γ-секретазы на основании количества образовавшегося второго неполного белка;

и отличается тем, что за исключением SEQ ID NO:1 указанный слитый белок не содержит ни одного пептида, действующего в качестве сигнала для эндо- или экзоцитоза, и/или сайта расщепления протеазой.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором пептидный фрагмент является сайтом расщепления каспазой.

4. Способ по любому из п.1 или 2, где первая нуклеотидная последовательность кодирует амилоидный белок-предшественник (АРР) или его часть, причем указанные пептиды представляют собой NPTY и/или VEVD.

5. Способ по п.4, в котором первая нуклеотидная последовательность кодирует белок, выделенный из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4.

6. Способ по любому из пп.1 и 2, где вторая нуклеотидная последовательность кодирует сигнальный пептид АРР человека (SEQ ID NO:5), SUC2 (SEQ ID NO:12) или ВМ40 (SEQ ID NO:13).

7. Способ по п.6, в котором сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.

8. Способ по любому из пп.1 и 2, где промотор является промотором, предназначенным для экспрессии в клетках млекопитающих, C. elegans, дрожжах и дрозофиле.

9. Способ по п.8, где промотор является промотором CMV, HSV TK, RSV, SV40, LTR, unc119, unc54, hsp16-2, G₀A1, sel-12, ADH1, GAL1, MET3, MET25, MT, Ac5 или Ds47.

10. Способ по любому из пп.1 и 2, где клетка является эукариотической клеткой.

11. Способ по п.10, где клетка является клеткой человека.

12. Способ по п.10, где клетка является клеткой, отличной от человеческой.

13. Способ по п.12, где клетка является клеткой HeLa, 293, H4, SH-SY5Y, H9, Cos, CHO, N2A, SL2 или дрожжевой клеткой.

14. Способ по п.12, где клетка является клеткой C. elegans.

15. Способ по п.13, где клетка принадлежит трансгенному организму C. elegans.

16. Способ по п.13, где клетка является клеткой Saccharomyces cerevisiae.

17. Способ по любому из пп.1, 2, 5, 7, 9, 11-16, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

18. Способ по п.17, где дополнительная кодирующая нуклеотидная последовательность расположена у 3'-конца первой нуклеотидной последовательности.

19. Способ по п.18, где дополнительная кодирующая нуклеотидная последовательность кодирует белок, экспрессируемый в виде слитого белка с первым неполным белком и вторым неполным белком, и может быть использована для обнаружения второго неполного белка.

20. Способ по п.19, где дополнительная кодирующая нуклеотидная последовательность кодирует белок, содержащий ДНК-связывающий домен и домен, активирующий транскрипцию.

21. Способ по п.20, где дополнительная кодирующая нуклеотидная последовательность кодирует белок, содержащий GAL4-связывающий домен и домен, активирующий транскрипцию, фрагмента VP16 (GAL4-VP16).

22. Способ по любому из пп.1 и 2, где клетка котрансфецирована репортерной плазмидой, содержащей ген-репортер под контролем регулируемого промотора.

23. Способ по п.22, где регулируемый промотор активируется доментом, активирующим транскрипцию.

24. Способ по п.23, где репортерная плазмида кодирует ген-репортер для EGFP (усиленного зеленого флуоресцирующего белка), Ura 3, His 3 или Lac Z и регулируемый промотор содержит GAL4-связывающие сайты и минимальный промотор ВИЧ.

25. Способ по любому из пп.1, 2, 5, 7, 9, 11-16, 18-21, 23, 24, где трансген содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:22.

26. Способ по п.25, где трансген находится в векторе.

27. Способ по п.26, где рекомбинантный вектор является pcDNA 3.1+.

28. Способ по любому из пп.1, 2, 5, 7, 9, 11-16, 18-21, 23, 24, 26, 27, где активность эндогенной γ-секретазы в клетке не обнаружена.

29. Способ по п.28, где клетка котрансфецирована с использованием библиотеки кДНК.

30. Способ по п.29, в котором кДНК, полученная из ткани человека или ткани, отличной от человеческой, либо из клеток человека или клеток, отличных от человеческих, присутствует в библиотеке кДНК.

31. Применение способа по любому или нескольким из пп.28-30 для идентификации кДНК, кодирующей γ-секретазу, субъединичный белок γ-секретазы или γ-секретаза-подобную протеиназу, которое заключается в том, что

а) идентифицируют клетку, в которой обнаружена активность γ-секретазы; и

b) выделяют из указанной клетки кДНК, кодирующую γ -секретазу.

32. Трансген, содержащий

а) первую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, содержащий аминокислотную последовательность GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID NO:1);

b) вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, у 5'-конца первой нуклеотидной последовательности;

с) промотор и

d) по крайней мере одну дополнительную нуклеотидную последовательность у 3'-конца первой нуклеотидной последовательности, которая кодирует ДНК-связывающий домен и домен, активирующий транскрипцию.

33. Трансген по п.32, где первая нуклеотидная последовательность кодирует АРР или часть АРР.

34. Трансген по одному или обоим пп.32 и 33, который имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO:14.

35. Вектор, содержащий трансген по любому или нескольким пп.32-34.

36. Вектор по п.35, который является вектором pDBTrp или pcDNA 3.1+.

37. Способ получения трансгенной клетки, в котором клетку трансфецируют вектором по одному или обоим пп.35 и 36.

38. Способ получения трансгенного организма C. elegans, в котором трансген по одному или нескольким пп.31-33 микроинъецируют в гонады организма C. elegans.

39. Клетка, содержащая трансген по одному или нескольким пп.32-34.

40. Трансгенный организм C. elegans, содержащий трансген по одному или нескольким пп.32-34.

41. Дрожжевая клетка, содержащая трансген по одному или нескольким пп.32-34.

42. Клетка, содержащая

а) трансген по одному или нескольким пп.32-34;

b) библиотеку кДНК и

с) репортерную плазмиду.

43. Применение клетки по п.42 для идентификации кДНК, кодирующей γ-секретазу, субъединичный белок γ-секретазы или γ-секретаза-подобную протеиназу.

44. Способ идентификации кДНК γ-секретазы, субъединичного белка γ-секретазы или γ-секретаза-подобной протеиназы, который заключается в том, что

а) получают клетку по п.42 и

b) определяют, образовался ли второй неполный белок.

45. Применение клетки по п.42 в способе идентификации ингибиторов активности γ-секретазы, субъединичного белка γ -секретазы или γ-секретаза-подобной протеиназы.

46. Способ идентификации веществ, ингибирующих активность γ-секретазы, субъединичного белка γ-секретазы или γ -секретаза-подобной протеиназы, который включает нижеследующие стадии:

А. Получение трансгенного организма, отличного от человеческого, или трансгенной клетки, которые содержат трансген, имеющий нижеследующие элементы:

а) первую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, содержащий аминокислотную последовательность GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID NO:1);

b) вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, у 5'-конца первой нуклеотидной последовательности;

с) промотор и

d) при необходимости дополнительные некодирующие и/или кодирующие нуклеотидные последовательности;

репортерную плазмиду, имеющую сайт связывания белка, минимальный промотор, ген-репортер и при необходимости кДНК, кодирующую γ-секретазу, субъединичный белок γ-секретазы или γ-секретаза-подобную протеиназу,

при этом трансгенный организм, отличный от человеческого, или трансгенная клетка экспрессирует трансген и при необходимости γ-секретазу, субъединичный белок γ-секретазы или γ-секретаза-подобную протеиназу, кодированную данной кДНК;

В. Культивирование трансгенного организма, отличного от человеческого, или трансгенной клетки с исследуемым веществом и

С. Определение количества второго неполного белка.

47. Способ идентификации веществ, ингибирующих активность γ-секретазы, субъединичного белка γ-секретазы или γ-секретаза-подобной протеиназы, который заключается в том, что

А. используют трансген, содержащий нижеследующие элементы:

а) первую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, содержащий аминокислотную последовательность GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML (SEQ ID NO:1);

b) вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, у 5'-конца первой нуклеотидной последовательности;

с) промотор и

d) при необходимости дополнительные кодирующие и/или некодирующие нуклеотидные последовательности;

В. данный трасген, репортерную плазмиду и при необходимости кДНК, кодирующую γ-секретазу, субъединичный белок γ-секретазы или γ-секретаза-подобную протеиназу, вводят в клетку и экспрессируют слитый белок, кодированный указанным трансгеном, и при необходимости γ-секретазу, субъединичный белок γ-секретазы или γ-секретаза-подобную протеиназу, кодированную указанной кДНК, в присутствии исследуемого вещества;

С. слитый белок

а) расщепляют, в результате чего образуется первый неполный белок, содержащий аминокислотную последовательность GAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO:2), и второй неполный белок, содержащий аминокислотную последовательность VIVITLVML (SEQ ID NO:3), или

b) не расщепляют внутри аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 γ-секретазой, присутствующей в клетке, в результате чего не образуется обнаруживаемое количество первого и/или второго неполного белка;

D. определяют количество второго неполного белка.

48. Способ идентификации веществ, ингибирующих активность γ-секретазы, субъединичного белка γ-секретазы или γ-секретаза-подобной протеиназы, в котором трансген, кодирующий слитый белок, содержащий сигнальный пептид и SEQ ID NO:1, экспрессируют в присутствии исследуемого вещества и определяют воздействие указанного вещества на количество образовавшегося второго неполного белка, содержащего аминокислотную последовательность VIVITLVML (SEQ ID NO:3).

49. Ингибитор γ-секретазы, субъединичного белка γ-секретазы или γ -секретаза-подобной протеиназы, идентифицированный способом по любому из пп.46-48.

50. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически активное соединение, ингибирующее активность γ-секретазы, субъединичного белка γ-секретазы или γ-секретаза-подобной протеиназы при осуществлении способа по одному или нескольким пп.46-48.

51. Способ получения фармацевтической композиции, который включает осуществление способа по одному или нескольким пп.46-48 и приготовление препарата, содержащего идентифицированное фармацевтически активное соединение.

52. Способ получения фармацевтического препарата, который включает

а) осуществление способа по одному или нескольким пп.46-48 и

b) смешивание идентифицированного фармацевтически активного соединения с фармацевтически инертными неорганическими и/или органическими наполнителями.

53. Тест-набор для обнаружения активности γ-секретазы, субъединичного белка γ-секретазы или γ-секретаза-подобной протеиназы, который включает трансген, вектор или клетку по любому предшествующему пункту.