Способы получения экспрессирующих химерный антигенный рецептор клеток - RU2017127051A
Код документа: RU2017127051A
Формула
1. Способ получения популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), которая истощена по регуляторным T-клеткам и может быть сконструирована для экспрессии CAR, причем данный способ содержит:
предоставление популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток), и
удаление регуляторных T-клеток, например, CD25+ T-клеток, из популяции для обеспечения тем самым популяции истощенных по T-регуляторам клеток, например, истощенных по CD25+ клеток, которые подходят для экспрессии CAR.
2. Способ по п. 1, в котором популяция истощенных по T-регуляторам клеток содержит менее чем 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток.
3. Способ по п. 1, в котором популяция иммунных эффекторных клеток представляет собой клетки субъекта, имеющего рак, например, субъекта, имеющего CD25-экспрессирующий рак, такой как, например, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).
4. Способ по п. 3, в котором популяция истощенных по T-регуляторам клеток содержит менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% опухолевых клеток.
5. Способ по п. 1, в котором регуляторные T-клетки, например, CD25+ T-клетки, удаляют из популяции с помощью анти-CD25 антитела или его фрагмента.
6. Способ по п. 5, в котором анти-CD25 антитело или его фрагмент конъюгированы с субстратом, например, гранулой.
7. Способ по п. 3, в котором популяцию иммунных эффекторных клеток получают от субъекта, имеющего гематологический рак, например, лейкоз, например, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ), или лимфому, например, мантийноклеточную лимфому (МКЛ).
8. Способ по п. 7, в котором популяция истощенных по T-регуляторам клеток содержит менее чем 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% клеток лейкоза, например, клеток ХЛЛ, клеток ОЛЛ, или клеток лимфомы, например, клеток МКЛ, клеток ХЛ, например, в котором популяция истощенных по T-регуляторам клеток содержит менее чем 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% опухолевых клеток, например, клеток ХЛЛ, например, в котором популяция истощенных по T-регуляторам клеток содержит менее чем 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% опухолевых клеток, например, клеток ХЛЛ.
9. Способ по п. 1, причем данный способ дополнительно содержит:
удаление из популяции клеток, которые экспрессируют опухолевый антиген, например, опухолевый антиген, который не содержит CD25, например, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 или CD11b, для обеспечения тем самым популяции истощенных по T-регуляторам, например, истощенных по CD25+, и истощенных по опухолевому антигену клеток, которые подходят для экспрессии CAR, например, CAR, описанного здесь.
10. Способ по п. 1, причем данный способ дополнительно содержит удаление из популяции клеток, которые экспрессируют ингибитор контрольных точек, например, ингибитор контрольных точек, описанный здесь, например, одной или нескольких из PD1+ клеток, LAG3+ клеток и TIM3+ клеток, для обеспечения тем самым популяции истощенных по T-регуляторам, например, истощенных по CD25+, клеток и истощенных по ингибитору контрольных точек клеток, например, истощенных по PD1+, LAG3+ и/или TIM3+ клеток.
11. Способ по п. 1, в котором предоставляемую популяцию иммунных эффекторных клеток выбирают на основании экспрессии одного или нескольких маркеров, например, CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA и CD45RO, например, предоставляемая популяция иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток) представляет собой CD3+ и/или CD28+.
12. Способ по любому из предшествующих пуектов, дополнительно содержащий: активирование популяции истощенных по T-регуляторам клеток, например, истощенных по CD25+ клеток, например, с помощью способа, описанного здесь, и/или трансдуцирование клеток из популяции истощенных по T-регуляторам клеток, например, популяции истощенных по CD25+ клеток, вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, например, CAR, описанный здесь, например, CAR CD19, описанный здесь.
13. Способ по п. 12, дополнительно содержащий размножение популяции истощенных по T-регуляторам клеток, например, сконструированных для экспрессии CAR, CAR, описанного здесь, например, CAR CD19, описанного здесь, например, с помощью способа, описанного здесь.
14. Способ по п. 13, в котором популяцию клеток размножают в течение периода, составляющего 8 дней или менее, например, 7, 6, 5, 4 или 3 дня, или в котором популяцию клеток размножают в культуре в течение 5 дней, и получаемые клетки являются более активными, чем те же клетки, размноженные в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования, например, в котором клетки, размноженные в течение 5 дней, показывают по меньшей мере одно-, двух-, трех- или четырехкратное увеличение клеточных удвоений при антигенной стимуляции по сравнению с теми же клетками, размноженными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования, или в котором клетки размножают в культуре в течение 5 дней, и получаемые клетки проявляют более высокое производство провоспалительных цитокинов, например, уровни IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с теми же клетками, размноженными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования.
15. Способ по п. 13, в котором популяцию клеток размножают посредством культивирования клеток в присутствии средства, которое стимулирует ассоциированный с комплексом CD3/TCR сигнал, и лиганда, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток, например, как описано здесь. В одном варианте осуществления средство представляет собой гранулу, конъюгированную с анти-CD3 антителом или его фрагментом и/или анти-CD28 антителом или его фрагментом.
16. Способ по любому из пп. 13-15, в котором популяцию клеток размножают в подходящей среде (например, среде, описанной здесь), которая включает один или несколько интерлейкинов, что приводит к по меньшей мере 200-кратному (например, 200-кратному, 250-кратному, 300-кратному, 350-кратному) увеличению количества клеток в течение 14-дневного периода размножения, например, как измерено с помощью способа, описанного здесь, такого как проточная цитометрия, например, в котором популяцию клеток размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7 (например, IL-15 и IL-7).
17. Способ по любому из пп. 13-16, в котором популяцию клеток криосохраняют после подходящего периода размножения.
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащий приведение популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, hTERT, и причем нуклеиновая кислота представляет собой, например, ДНК или РНК.
19. Реакционная смесь, содержащая популяцию истощенных по T-регуляторам клеток, содержащую менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток.
20. Реакционная смесь, содержащая популяцию истощенных по T-регуляторам клеток, содержащую менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25-экспрессирующих опухолевых клеток, например, клеток ХЛЛ.
21. Реакционная смесь по п. 20, в которой популяция клеток содержит менее чем 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% опухолевых клеток, например, CD25-экспрессирующих опухолевых клеток, например, клеток ХЛЛ, или в которой популяция клеток содержит менее чем 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% опухолевых клеток, например, CD25-экспрессирующих опухолевых клеток, например, клеток ХЛЛ.
22. Реакционная смесь по любому из пп. 20-21, в которой реакционная смесь содержит популяцию истощенных по T-регуляторам клеток, содержащую менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% экспрессирующих ингибитор контрольных точек клеток, например, PD1+ клеток, LAG3+ клеток или TIM3+ клеток.
23. Реакционная смесь по любому из пп. 19-22, в которой реакционная смесь дополнительно содержит средство, которое активирует и/или размножает клетки популяции, например, средство, которое стимулирует ассоциированный с комплексом CD3/TCR сигнал, и/или лиганд, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток, например, в которой средство представляет собой гранулу, конъюгированную с анти-CD3 антителом или его фрагментом и/или анти-CD28 антителом или его фрагментом.
24. Реакционная смесь по любому из пп. 19-23, дополнительно содержащая один или несколько факторов для пролиферации и/или жизнеспособности, включая сыворотку (например, фетальную бычью или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ и TNF-α или любые другие добавки для роста клеток, например, причем реакционная смесь дополнительно содержит IL-15 и/или IL-7.
25. Реакционная смесь по любому из пп. 19-24, в которой множество клеток популяции в реакционной смеси содержат молекулу нуклеиновой кислоты, например, молекулу нуклеиновой кислоты, описанную здесь, которая содержит кодирующую CAR последовательность, например, кодирующую CAR CD19 последовательность, например, как описано здесь, например, в которой множество клеток популяции в реакционной смеси содержат вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, например, CAR, описанный здесь, например, CAR CD19, описанный здесь, например, в которой вектор представляет собой вектор, описанный здесь, например, вектор, выбранный из группы, состоящей из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора.
26. Реакционная смесь по любому из пп. 19-24, дополнительно содержащая криопротектор или стабилизатор, такой как, например, сахарид, олигосахарид, полисахарид и полиол (например, трегалозу, маннит, сорбит, лактозу, сахарозу, глюкозу и декстран), соли и краун-эфиры. В одном варианте осуществления криопротектор представляет собой декстран.
27. Способ получения популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), сконструированных для экспрессии CAR, причем данный способ содержит:
предоставление популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток), причем множество иммунных эффекторных клеток содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, например, CAR, описанный здесь, например, CAR CD19, описанный здесь, и
размножение клеток популяции в присутствии одного или нескольких интерлейкинов, что приводит к по меньшей мере 200-кратному (например, 200-кратному, 250-кратному, 300-кратному, 350-кратному) увеличению количества клеток в течение 14-дневного периода размножения, например, как измерено с помощью способа, описанного здесь, такого как проточная цитометрия.
28. Способ по п. 27, в котором популяцию клеток размножают в присутствии IL-15 и/или IL-7, например, IL-15 и IL-7.
29. Способ по п. 27 или 28, в котором популяцию клеток размножают в течение периода, составляющего менее чем 8 дней, например, 7, 6, 5, 4 или 3 дня.
30. Способ по п. 27 или 28, в котором клетки размножают в культуре в течение 5 дней, и получаемые клетки являются более активными, чем те же клетки, размноженные в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования.
31. Способ по п. 30, в котором клетки, размноженные в течение 5 дней, показывают по меньшей мере одно-, двух-, трех- или четырехкратное увеличение клеточных удвоений при антигенной стимуляции по сравнению с теми же клетками, размноженными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования, или в котором клетки размножают в культуре в течение 5 дней, и получаемые клетки проявляют более высокое производство провоспалительных цитокинов, например, уровни IFN-γ и/или GM-CSF, по сравнению с теми же клетками, размноженными в культуре в течение 9 дней в тех же условиях культивирования.
32. Способ по любому из пп. 27-31, в котором популяцию клеток размножают посредством культивирования клеток в присутствии средства, которое стимулирует ассоциированный с комплексом CD3/TCR сигнал, и лиганда, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток, например, как описано здесь, например, в котором средство представляет собой гранулу, конъюгированную с анти-CD3 антителом или его фрагментом и/или анти-CD28 антителом или его фрагментом.
33. Способ по любому из пп. 27-32, в котором предоставляемая популяция иммунных эффекторных клеток представляет собой популяцию истощенных по T-регуляторам клеток, содержащую менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток, или в котором предоставляемая популяция иммунных эффекторных клеток представляет собой популяцию истощенных по T-регуляторам клеток, содержащую менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25-экспрессирующих опухолевых клеток, например, клеток ХЛЛ.
34. Способ по п. 33, в котором предоставляемая популяция клеток содержит менее чем 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% опухолевых клеток, например, CD25-экспрессирующих опухолевых клеток, например, клеток ХЛЛ, или в котором предоставляемая популяция клеток содержит менее чем 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% CD25+ клеток и менее чем 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% опухолевых клеток, например, CD25-экспрессирующих опухолевых клеток, например, клеток ХЛЛ.
35. Способ по любому из пп. 50-53, в котором предоставляемая популяция иммунных эффекторных клеток также содержит менее чем 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% экспрессирующих ингибитор контрольных точек клеток, например, PD1+ клеток, LAG3+ клеток или TIM3+ клеток.
36. Способ по любому из пп. 33-35, дополнительно содержащий приведение популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей субъединицу теломеразы, например, hTERT, и причем нуклеиновая кислота представляет собой, например, ДНК или РНК.
37. Реакционная смесь, содержащая популяцию иммунных эффекторных клеток, в которой множество клеток популяции в реакционной смеси содержат молекулу нуклеиновой кислоты, например, молекулу нуклеиновой кислоты, описанную здесь, которая содержит кодирующую CAR последовательность, например, кодирующую CAR CD19 последовательность, например, как описано здесь, и IL-7 и/или IL-15.
38. Реакционная смесь, содержащая популяцию иммунных эффекторных клеток, в которой множество клеток популяции в реакционной смеси содержат вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, например, CAR, описанный здесь, например, CAR CD19, описанный здесь, и IL-7 и/или IL-15, и, необязательно, причем вектор представляет собой вектор, описанный здесь, например, вектор, выбранный из группы, состоящей из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора или ретровирусного вектора.
39. Реакционная смесь по п. 37 или 38, дополнительно содержащая средство, которое активирует и/или размножает клетки популяции, например, средство, которое стимулирует ассоциированный с комплексом CD3/TCR сигнал, и/или лиганд, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности клеток, например, причем средство представляет собой гранулу, конъюгированную с анти-CD3 антителом или его фрагментом и/или анти-CD28 антителом или его фрагментом.
40. Способ получения популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток, NK-клеток), причем данный способ содержит:
предоставление популяции иммунных эффекторных клеток (например, T-клеток) и
приведение популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, и РНК, кодирующей субъединицу теломеразы, например, hTERT, в условиях, подходящих для экспрессии CAR и субъединицы теломеразы.
41. Способ по п. 40, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая CAR, и РНК, кодирующая субъединицу теломеразы, являются частью одной и той же молекулы нуклеиновой кислоты, или в котором нуклеиновая кислота, кодирующая CAR, и РНК, кодирующая субъединицу теломеразы, являются частью различных молекул нуклеиновой кислоты.
42. Способ по п. 40, который содержит приведение популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, и РНК, кодирующей субъединицу теломеразы, по существу в одно и то же время, или который содержит приведение популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, до приведения популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с РНК, кодирующей субъединицу теломеразы, или который содержит приведение популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR, после приведения популяции иммунных эффекторных клеток в контакт с РНК, кодирующей субъединицу теломеразы.
43. Способ по п. 40, в котором РНК, кодирующая субъединицу теломеразы, представляет собой мРНК, или в котором РНК, кодирующая субъединицу теломеразы, содержит структуру поли(A)-хвоста или 5ʹ-кэпа.
44. Способ по п. 40, который содержит трансфицирование, трансдуцирование или электропорирование иммунных эффекторных клеток РНК, кодирующей субъединицу теломеразы.
45. Иммунная эффекторная клетка (например, T-клетка или NK-клетка), содержащая:
нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR; и
РНК (например, мРНК), кодирующую экзогенную субъединицу теломеразы, например, hTERT.
46. Иммунная эффекторная клетка (например, T-клетка или NK-клетка), содержащая:
CAR; и
экзогенную субъединицу теломеразы, например, hTERT,
причем клетка не содержит ДНК, кодирующую экзогенную субъединицу теломеразы.
