Производство пептидов и белков путем накопления вбелковых телах, полученных из эндоплазматическогоретикулума растений - RU2005101738A

Реферат

1. Последовательность нуклеиновой кислоты, включающая первую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок γ-зеин, или ее фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) растительной клетки; вторую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется с помощью ферментативных или химических способов; и третью последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует интересующий продукт; где 3' конец указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты связан с 5' концом указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты и 3' конец указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты связан с 5' концом указанной третьей последовательности нуклеиновой кислоты.

2. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полный белок γ-зеина.

3. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих весь или часть повторного домена белка γ-зеина; одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих весь или часть ProX домена белка γ-зеина; или одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих весь или часть повторного домена белка γ-зеина, и одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих весь или часть ProX домена белка γ-зеина.

4. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из следующей группы: нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO:1 [нуклеотидная последовательность, которая кодирует γ-зеин (Фиг.1А)], нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO:2 [нуклеотидная последовательность, идентифицированная как RX3 (Фиг.1В)], нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO:3 [нуклеотидная последовательность, идентифицированная как R3 (Фиг.1В)], нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO:4 [нуклеотидная последовательность, идентифицированная как Р4 (Фиг.1С)], и нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO:5 [нуклеотидная последовательность, идентифицированная как X10 (Фиг.1С)].

5. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая определяет сайт расщепления протеазой.

6. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.5, где указанная протеаза является энтерокиназой, Arg-C эндопротеазой, Glu-C эндопротеазой, Lys-C эндопротеазой или фактором Ха.

7. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислоту, которая специфически расщепляется с помощью химических реагентов.

8. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.7, где указанный химический реагент является цианбромидом.

9. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где указанный интересующий продукт является белковым лекарственным средством.

10. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.9, где указанное белковое лекарственное средство представляет собой пептидный гормон или интерферон, причем указанное лекарственное средство эффективно для лечения человека и животного.

11. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.10, где указанный пептидный гормон выбирают из кальцитонина, эритропоэтина, тромбопоэтина и гормона роста.

12. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная третья последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую кальцитонин, и кодон для глицина при 3' конце указанной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей кальцитонин.

13. Слитый белок, содержащий

(i) аминокислотную последовательность белка γ-зеина, или ее фрагмент, способный к направлению и сохранению белка в ЭР растительной клетки,

(ii) аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется с помощью ферментативных или химических способов, и

(iii) интересующий продукт;

причем указанный слитый белок является продуктом экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-12 в системе растения-хозяина.

14. Слитый белок по п.13, содержащий полный белок γ -зеина.

15. Слитый белок по п.14, содержащий аминокислотную последовательность, показанную на Фиг.1А и идентифицированную как SEQ ID NO:6.

16. Слитый белок по п.15, содержащий фрагмент белка γ-зеина, при этом указанный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в ЭР растительной клетки.

17. Слитый белок по п.16, содержащий фрагмент белка γ-зеина, выбранный из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:7 [аминокислотная последовательность, соответствующая RX3 (Фиг.1В)], аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:8 [аминокислотная последовательность, соответствующая R3 (Фиг.1В)], аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:9 [аминокислотная последовательность, соответствующая Р4 (Фиг.1С)], и аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:10 [аминокислотная последовательность, соответствующая X10 (Фиг.1С)].

18. Слитый белок по п.13, где указанная аминокислотная последовательность, которая специфически расщепляется с помощью ферментативных способов, содержит сайт расщепления протеазой.

19. Слитый белок по п.13, где указанная аминокислотная последовательность, которая специфически расщепляется с помощью химических способов, содержит сайт, расщепляемый с помощью химического реагента.

20. Слитый белок по п.13, где указанный интересующий продукт является белковым лекарственным средством.

21. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая (i) последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, и (ii) регуляторную нуклеотидную последовательность, которая регулирует транскрипцию нуклеиновой кислоты по изобретению (i), причем указанная регуляторная последовательность (ii) является функциональной в растениях.

22. Конструкция по п.21, где указанная регуляторная последовательность (ii) является тканеспецифичной.

23. Конструкция по п.21, где указанная регуляторная последовательность (ii) содержит промотор, функциональный в растениях.

24. Конструкция по п.22, где указанная регуляторная последовательность (ii) содержит промотор 35SCaMV, промотор "пататина", промотор запасного белка, промотор гена убихитина или регуляторную последовательность гена γ-зеина.

25. Конструкция по п.21, где указанная регуляторная последовательность (ii) содержит последовательность окончания транскрипции, функциональную в растении.

26. Конструкция по п.25, где указанная регуляторная последовательность (ii) содержит терминатор 35SCaMV, терминатор гена октопинсинтазы (ocs), терминатор гена нопалинсинтазы (nos) или терминатор гена γ-зеина.

27. Конструкция по п.21, где указанная регуляторная последовательность (ii) далее содержит трансляционный энхансер, функциональный в растении.

28. Конструкция по п.27, где указанный трансляционный энхансер, функциональный в растении, содержит промотирующую последовательность для транскрипции вируса гравировки томата, и т.п.

29. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.1 или конструкцию нуклеиновой кислоты по п.21.

30. Трансформированная система растения-хозяина, причем указанная система растения-хозяина трансформируется нуклеиновой кислотой по п.1 или конструкцией по п.21, или вектором по п.29.

31. Трансгенная система растения-хозяина, причем указанная трансгенная система растения-хозяина содержит, интегрированную в его геном, последовательность нуклеиновой кислотой по п.1.

32. Система растения-хозяина по п.30, где указанная система растения-хозяина является однодольным или двудольным растением.

33. Система растения-хозяина по п.32, где указанная система растения-хозяина представляет собой зерновые, бобовые, крестоцветные или пасленовые.

34. Система растения-хозяина по п.30, содержащая семена.

35. Система растения-хозяина по п.31, где указанная система растения-хозяина является однодольным или двудольным растением.

36. Система растения-хозяина по п.35, где указанная система растения-хозяина представляет собой зерновые, бобовые, крестоцветные или пасленовые.

37. Система растения-хозяина по п.31, содержащая семена.

38. Способ получения интересующего продукта в системе растения-хозяина, который включает выращивание трансформированной системы растения-хозяина по п.30 в условиях, которые допускают получение и экспрессию указанного интересующего продукта в форме слитого белка.

39. Способ получения интересующего продукта в системе растения-хозяина, который включает выращивание трансгенной системы растения-хозяина по п.31 в условиях, которые допускают получение и экспрессию указанного интересующего продукта в форме слитого белка.

40. Способ по п.38, который далее включает выделение и очистку указанного слитого белка.

41. Способ по п.38, который далее включает высвобождение указанного интересующего продукта из указанного слитого белка.

42. Способ по п.39, который далее включает выделение и очистку указанного слитого белка.

43. Способ по п.39, который далее включает высвобождение указанного интересующего продукта из указанного слитого белка.

44. Способ получения кальцитонина в системе растения-хозяина, включающий

а) трансформирование системы растения-хозяина вектором экспрессии или конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную последовательность для транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты (последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению), которая состоит из первой последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок γ-зеин, или ее фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) растительных клеток; второй последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется с помощью ферментативных или химических способов; и третьей последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует кальцитонин; где 3' конец указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты связан с 5' концом указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты и 3' конец указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты связан с 5' концом указанной третьей последовательности нуклеиновой кислоты;

b) генерирование полных растений из указанных систем растений-хозяев, трансформированных указанным вектором экспрессии или конструкцией нуклеиновой кислоты;

c) выращивание таких трансформированных растений при условиях, которые обеспечивают получение и экспрессию кальцитонина в форме слитого белка; и, если желательно,

d) выделение, очистку указанного слитого белка и обработку указанного слитого белка для того, чтобы высвободить кальцитонин.

45. Способ по п.40, где указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полный белок γ-зеина.

46. Способ по п.40, где указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует фрагмент белка γ-зеина.