Модифицированный фиброин - RU2019101640A

1. Модифицированный фиброин, включающийпоследовательность домена, представленную формулой 1

мотив (A)_n-REP]_m,

где последовательность домена имеет аминокислотную последовательность, содержащую область с локально высоким гидропатическим индексом, эквивалентную аминокислотной последовательности, в которой один или множество аминокислотных остатков в REP заменены аминокислотными остатками с высоким гидропатическим индексом, и/или один или множество аминокислотных остатков с высоким гидропатическим индексом были встроены в REP по сравнению с природным фиброином;

в формуле 1 мотив (A)_nпредставляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 4-20 аминокислотных остатков, а число аланиновых остатков составляет 83% или более от общего числа аминокислотных остатков в мотиве (A)_n; REP представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 10-200 аминокислотных остатков, m равно целому числу от 10 до 300, множество мотивов (A)_n может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности, а множество REP может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности.

2. Модифицированный фиброин по п. 1, где область с локально высоким гидропатическим индексом состоит из 2-4 следующих друг за другом аминокислотных остатков.

3. Модифицированный фиброин по п. 1 или 2, где аминокислотные остатки с высоким гидропатическим индексом выбраны из изолейцина (I), валина (V), лейцина (L), фенилаланина (F), цистеина (C), метионина (M) и аланина (A).

4. Модифицированный фиброин, включающий последовательность домена, представленную формулой 1:

мотив (A)_n-REP]_m,

где в случае, когда во всех REP, включенных в последовательность, за исключением последовательности мотива (A)_n, расположенного, в основном, с C-концевой стороны по отношению к С-концу последовательности домена, общее число аминокислотных остатков, содержащихся в области, в которой средняя величина гидропатического индекса для четырех следующих друг за другом аминокислотных остатков составляет 2,6 или более, было принято за x, а общее число аминокислотных остатков, содержащихся в последовательности, за исключением последовательности мотива (A)_n, расположенного, в основном, с C-концевой стороны по отношению к С-концу последовательности домена, было принято за y, то x/y составляет 6,2% или более;

в формуле 1, мотив (A)_nпредставляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 4-20 аминокислотных остатков, а число аланиновых остатков составляет 83% или более от общего числа аминокислотных остатков в мотиве (A)_n; REP представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 10-200 аминокислотных остатков, m равно целому числу от 10 до 300, множество мотивов (A)_n может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности, а множество REP может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности.

5. Модифицированный фиброин по любому из пп. 1-4, где фиброин, помимо аминокислотной последовательности, в которой один или множество аминокислотных остатков в REP были заменены аминокислотными остатками с высоким гидропатическим индексом, и/или один или множество аминокислотных остатков с высоким гидропатическим индексом были встроены в REP, имеет аминокислотную последовательность с заменой, делецией, инсерцией и/или добавлением одного или множества аминокислотных остатков по сравнению с природным фиброином.

6. Модифицированный фиброин по п. 5, где природным фиброином является фиброин, происходящий от насекомых или пауков.

7. Модифицированный фиброин по п. 5, где природным фиброином является мажорный белок паука, имеющий бутылочнообразную форму (MaSp), или минорный белок паука, имеющий бутылочнообразную форму (MiSp).

8. Модифицированный фиброин, включающий

аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, или

аминокислотную последовательность, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.

9. Модифицированный фиброин по любому из пп. 1-8, также включающий последовательность метки у N-конца или у C-конца или у обоих концов.

10. Модифицированный фиброин по п. 9, где последовательность метки включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6.

11. Модифицированный фиброин, включающий

аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, или

аминокислотную последовательность, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.

12. Нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный фиброин по любому из пп. 1-11.

13. Нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с комплементарной цепью нуклеиновой кислоты по п. 12 в жестких условиях и кодирует модифицированный фиброин, включающий последовательность домена, представленную формулой 1

[мотив (A)_n-REP]_m,

в формуле 1 мотив (A)_nпредставляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 4-20 аминокислотных остатков, а число аланиновых остатков составляет 83% или более от общего числа аминокислотных остатков в мотиве (A)_n; REP представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 10-200 аминокислотных остатков, m равно целому числу от 10 до 300, множество мотивов (A)_n может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности, а множество REP может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности.

14. Нуклеиновая кислота, имеющая последовательность, которая на 90% или более идентична нуклеиновой кислоте по п. 13, и кодирующая модифицированный фиброин, включающий последовательность домена, представленную формулой 1

[мотив (A)_n-REP]_m,

в формуле 1 мотив (A)_nпредставляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 4-20 аминокислотных остатков, а число аланиновых остатков составляет 83% или более от общего числа аминокислотных остатков в мотиве (A)_n; REP представляет собой аминокислотную последовательность, состоящую из 10-200 аминокислотных остатков, m равно целому числу от 10 до 300, множество мотивов (A)_n может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности, а множество REP может представлять собой одну и ту же аминокислотную последовательность или различные аминокислотные последовательности.

15. Экспрессионный вектор, включающий

последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 12-14, и

одну или множество регуляторных последовательностей, функционально присоединенных к этой последовательности.

16. Экспрессионный вектор по п. 15, который представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор.

17. Хозяин, трансформированный экспрессионным вектором по п. 15 или 16.

18. Хозяин по п. 17, который является прокариотом.

19. Хозяин по п. 18, где прокариотом является микроорганизм, принадлежащий к роду, выбранному из группы, состоящей из Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium и Pseudomonas.

20. Хозяин по п. 17, который является эукариотом.

21. Хозяин по п. 20, где эукариотом являются клетки дрожжей, нитчатых грибов или насекомых.

22. Хозяин по п. 21, где дрожжами являются дрожжи, принадлежащие к роду, выбранному из группы, состоящей из Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia, Candida, Yarrowia и Hansenula.

23. Хозяин по п. 22, где дрожжами, принадлежащими к роду Saccharomyces, являются Saccharomyces cerevisiae; дрожжами, принадлежащими к роду Schizosaccharomyces, являются Schizosaccharomyces pombe; дрожжами, принадлежащими к роду Kluyveromyces, являются Kluyveromyces lactis; дрожжами, принадлежащими к роду Trichosporon, являются Trichosporon pullulans; дрожжами, принадлежащими к роду Schwanniomyces, являются Schwanniomyces alluvius; дрожжами, принадлежащими к роду Pichia, являются Pichia pastoris; дрожжами, принадлежащими к роду Candida, являются Candida albicans; дрожжами, принадлежащими к роду Yarrowia, являются Yarrowia lipolytica, а дрожжами, принадлежащими к роду Hansenula, являются Hansenula polymorpha.

24. Хозяин по п. 21, где нитчатыми грибами являются нитчатые грибы, принадлежащие к роду, выбранному из группы, состоящей из Aspergillus, Penicillium и Muсor.

25. Хозяин по п. 24, где нитчатыми грибами, принадлежащими к роду Aspergillus, являются Aspergillus oryzae; нитчатыми грибами, принадлежащими к роду Penicillium, являются Penicillium chrysogenum, а нитчатыми грибами, принадлежащими к роду Muсor, являются Muсor fragilis.

26. Хозяин по п. 21, где клетками насекомых являются клетки насекомых отряда Жесткокрылых.

27. Хозяин по п. 26, где клетками насекомых являются клетки насекомых, происходящих от Spodoptera frugiperda, или клетки насекомых, происходящих от Trichoplusia ni.

28. Продукт, включающий модифицированный фиброин по любому из пп. 1-11 и выбранный из группы, состоящей из волокна, пряжи, нитей, пленки, пены, сферы, нанофибрилл, гидрогеля, смолы и их эквивалентов.