Штамм escherichia coli jm 105, трансформированный плазмидой pae12, - продуцент альфа-амидирующего фермента, рекомбинантная плазмида pae12, линия клеток с127 мыши, трансфицированная плазмидой pd bpv-ммт neo αаеа75-продуцент альфа-амидирующего фермента, ре - RU2129606C1

Чертежи

Показать все 7 чертежа(ей)

Описание

Настоящее изобретение относится к получению альфа-амидирующих ферментов методами рекомбинантной ДНК, и в частности к экспрессионным векторам и хозяевам, способным экспрессировать альфа-амидирующий фермент с высокими выходами и восстанавливаемой высокой чистотой.

В литературе хорошо отображен интрацеллюлярный процессинг (отщепление и/или модификация функциональных групп) форм предшественника нативных белков вслед за их трансляцией из нуклеиновокислотных кодирующих последовательностей.

Вообще, клетки млекопитающих и другие эукариоты могут осуществлять определенные методики пост-трансляционного процессинга, тогда как прокариоты не могут. Некоторые прокариоты, такие как E.coli, широко используются в качестве хозяев для получения белков млекопитающих путем технологии рекомбинантной ДНК (рДНК), поскольку они могут быть легко выращены методами групповой ферментации и поскольку генетически они хорошо характеризуются. Однако многие белки млекопитающих нуждаются в нескольких типах пост-трансляционного процессинга, и если эти белки получают методами генной инженерии E.Coli, например, тогда пост-трансляционный процессинг часто должен сопровождаться использованием сложных химических методов in vitro, которые экономически невыгодны для крупномасштабного производства.

Один тип процессинга включает специфическое амидирование карбокси-концевой аминокислоты пептида или белка. Многие встречающиеся в природе гормоны и пептиды содержат такую модификацию, которая часто является существенной, если белок должен быть биологически активным. Примером является кальцитонин, где замещение остатка неамидированного пролина амидированным пролином нативной формы приводит к 3000-кратному снижению биологической активности. Другие биологические пептиды, нуждающиеся в пост-трансляционном амидировании для полной активности, включают (но не ограничиваются) ростовый рилизинг-фактор, другие кальцитонины и пептид, связанный с геном кальцитонина.

Специфическое амидирование карбокси-концевой аминокислоты белка катализируется альфа-амидирующими ферментами. Полипептидные последовательности для многих важных биологических белков, которые нуждаются в амидировании для достижения максимальной эффективности, могут быть изготовлены, например, методами генной инженерии. Однако важное и иногда существенное карбокси-концевое амидирование часто должно осуществляться in vitro. Желательно в этот момент избегать дорогостоящих и обременительных методик химического амидирования, и поэтому желательно использовать амидирующий фермент для осуществления специфического амидирования. Однако альфа-амидирующий фермент трудно получить в свободном состоянии.

Присутствие амидированных пептидов в контрольной ткани не является обязательно синонимичным высоким уровням альфа-амидирующего фермента. Например, ткань аденогипофиза крысы содержит высокую альфа-амидирующую активность, однако ни один из известных субстратов (Эйппер и др., PNAS 80, стр. 5144-5148 (1983)). Ткань нейрогипофиза крысы содержит амидированные пептиды (окситоцин и вазопрессин), однако имеет очень низкую альфа-амидирующую активность (Эйппер и др., Endo 116, стр. 2497-2504 (1985)). Следовательно, пока отдельные ткани испытывают на альфа-амидирующую активность, нельзя ожидать присутствия или потенциальных уровней фермента.

Даже более серьезным препятствием пригодности амидирующего фермента, полученного из натуральных источников, является обычно низкий уровень чистоты. Амидирующие ферменты, получаемые из натуральных источников, загрязняются протеолитическими ферментами и другими примесями. Эффективное восстановление амидированного продукта весьма затруднено, когда эти примесьсодержащие ферменты используют для амидирования субстрата, выполненного из L-аминокислот. Присутствие протеаз, в частности, может разрушить субстрат и/или амидированный продукт и/или сам амидирующий фермент. Многие биологически важные полипептиды содержат L-аминокислоты и чувствительны к этому протеолитическому разрушению и к другим препятствующим амидированию факторам, вызванным присутствием примесей в препаратах амидирующего фермента.

Вследствие малого числа природных источников, низкого содержания и недостаточной чистоты альфа-амидирующего фермента существует необходимость создания эффективных методов массового получения альфа-амидирующего фермента, извлекаемого с высоким выходом и с высокой степенью чистоты.

В данном описании термины "амидирующий фермент" и "альфа-амидирующий фермент" касаются любого вещества, способного катализировать конверсию пептидил-субстрата в соответствующий пептидил-амид, имеющий аминогруппу вместо C-концевой аминокислоты указанного субстрата.

Целью настоящего изобретения является получение альфа-амидирующего фермента, извлекаемого с высокими выходами и с высокой степенью чистоты.

Другой целью настоящего изобретения является получение организмов хозяина, способных экспрессировать альфа-амидирующие ферменты, извлекаемые с высокими выходами и с высокой степенью чистоты.

Другой целью настоящего изобретения является создание векторов экспрессии, содержащих ДНК-последовательности, кодирующие альфа-амидирующий фермент.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание векторов экспрессии, способных экспрессировать альфа-амидирующий фермент таким образом, что экспрессированный фермент можно легко извлечь и очистить до уровней, эффективных для амидирования пептидил-субстратов, содержащих L-аминокислоты, например, субстратов, очищенных от натуральных источников, синтезированных химически или полученных методами рекомбинантной ДНК.

Другой целью настоящего изобретения является создание векторов экспрессии, особенно пригодных для направления экспрессии альфа-амидирующего фермента в эукариотическом хозяине.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание векторов экспрессии, особенно пригодных для направления экспрессии альфа-амидирующих ферментов в прокариотическом хозяине.

Другой целью настоящего изобретения является создание средств для эффективного массового производства альфа-амидирующего фермента.

Эти и другие цели достигаются созданием хозяина, способного экспрессировать полипептидную последовательность альфа-амидирующего фермента, причем данный хозяин содержит вектор эксперссии, который включает транскрипционный промотор с последующей ниже ДНК-последовательностью, инородной для указанного хозяина, которая кодирует амидирующий фермент, при этом указанный вектор способен направлять экспрессию полипептидов в хозяине.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается хозяин, который способен экспрессировать полипептидную последовательность альфа-амидирующего фермента, причем хозяин содержит вектор экспрессии, включающий транскрипционный промотор с последующей ниже ДНК-последовательностью, инородной для указанного хозяина, которая способна гибридизировать в строгих условиях с ДНК-последовательностью 1, данной в конце описания.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается хозяин, который способен экспрессировать полипептидную последовательность альфа-амидирующего фермента, при этом хозяин включает вектор экспрессии, содержащий транскрипционный промотор с последующей ниже ДНК-последовательностью, инородной для указанного хозяина, которая способна гибридизировать в строгих условиях с ДНК-последовательностью 2, показанной в конце описания.

В данном описании термин "строгие условия" означает 2хSSl (0,3М хлорид натрия и 0,03 М цитрат натрия) при температуре 62^oC.

Настоящее изобретение также предлагает векторы экспрессии для направления экспрессии альфа-амидирующего фермента в прокариотных и эукариотных системах. Например, предлагается вектор экспрессии, который способен направлять в прокариотном хозяине экспрессию полипептидной последовательности альфа-амидирующего фермента, причем указанный вектор включает транскрипционный промотор с последующей ниже первой ДНК-последовательностью, имеющей область кодирования амидирующего фермента, при этом указанная первая последовательность является достаточно гомологичной натуральной ДНК-последовательности для экспрессии натурального амидирующего фермента с тем, чтобы подвергнуться гибридизации с указанной натуральной последовательностью в строгих условиях, и первая последовательность включает инициирующий метионин-кодон в пределах около 50 нуклеотидов начала указанной фермент-кодирующей области.

Аналогично, предлагается вектор экспрессии, который способен направлять экспрессию полипептидной последовательности альфа-амидирующего фермента в эукариотическом хозяине, при этом указанный вектор содержит транскрипционный промотор с последующей ниже первой ДНК-последовательностью, имеющей область кодирования амидирующего фермента, указанная первая последовательность является достаточно гомологичной натуральной ДНК-последовательности для экспрессии натурального амидирующего фермента с тем, чтобы подвергнуться гибридизации с указанной натуральной последовательностью в строгих условиях, и указанная первая последовательность включает стоп-кодон выше от последовательности, которая иначе бы кодировала домен, перекрывающий мембрану.

За этой первой последовательностью должна следовать последовательность, специфицирующая прибавление поли А к информационной РНК, генерированной транскрипцией из указанного промотора.

В данном описании термин "домен, перекрывающий мембрану" обозначает ДНК-последовательность, которая, как определено испытанием Кайта и Дулитла, J. Mol. Biol., том 157, стр. 105-132 (1982) (полное описание которого введено в качестве отсылки), кодирует аминокислотную последовательность с гидрофобностью, длиной, структурным характером и т.д., достаточными для того, чтобы стать закрепленной в мембране. Например, это может произойти тогда, когда белок синтезирован на мембрана-связанной рибосоме или, альтернативно, аминокислотная последовательность, кодируемая доменом, перекрывающим мембрану, может стать связанной с другими областями белка, где она представляет часть, так, что последовательность становится инсерцированной в гидрофобную среду мембраны, причем посттрансляционно. Домены, перекрывающие мембрану, описаны более подробно в работе Фон Хейне, Анализ последовательностей в молекулярной биологии: клад или тривиальные поиски, стр. 81-121 (Академ Пресс 1987), положения которой введены в данное описание в качестве отсылки.

Используемые здесь номера оснований представляют собой номера, конкретно указанные для любой ДНК-последовательности, намеренно приведенной вместе со ссылками номеров оснований. Для всех последовательностей, для которых номера оснований здесь конкретно не предназначены, основания должны быть пронумерованы последовательно с номера основания 1, который обозначает первое основание первого кодона, экспрессированного обсуждаемой последовательностью, и аминокислоты пронумерованы последовательно с первой, являющейся аминокислотой, выраженной основаниями 1-3.

На фиг. 1 представлен график течения для конструирования вектора экспрессии млекопитающего для альфа-амидирующего фермента; на фиг. 2 представлен график течения для конструирования прокариотного вектора экспрессии для альфа-амидирующего фермента; на фиг. 3 представлена электрофоретограмма SDS - PAGE, окрашенная голубым Кумасси, нерастворимой фракции белка из JM105 E. Coli, несущего указанные плазмиды (которые имеют характеристики, приведенные в примере 1), при культивировании с (+) или без (-) IPTG, добавляемого в питательную среду (C-нерастворимые белки JM105 E.Coli, несущего рКК233-2); фиг. 4 представляет собой Вестерн-блот-анализ геля, показанного на фиг. 3; вслед за переносом белка к нитроцеллюлозе фильтр обрабатывают кроличьей антисывороткой AE и антикроличьим иммуноглобулином, сопряженным с щелочной фосфатазой, с последующим хромогенным субстратом для щелочной фосфатазы.

В соответствии с настоящим изобретением получают векторы экспрессии, пригодные для прокариотных систем, и векторы экспрессии, пригодные для эукариотных систем. ДНК, кодирующую амидирующий фермент, полезный в этих векторах, можно выделить, как описано в заявке ЕПВ N 0308067, полное раскрытие которой введено в данное описание в качестве отсылки. Альфа-амидирующие ферменты выделены из мозговой ткани карциномы щитовидной железы крысы или кондиционированных сред из клеточной линии крысы и очищены до гомогенности, как указывается в вышеприведенной основной заявке и в первичной заявке N 655366, поданной 27 сентября 1984 года и опубликованной в настоящее время как патент США N 4708934, приоритет которой заявлен и полное раскрытие которой введено в настоящее описание в качестве отсылки. Аминокислотные последовательности определены для очищенного альфа-амидирующего фермента, и эти последовательности используют для проектирования целого ряда олигонуклеотидных зондов, которые метят радиоактивным изотопом и используют для выделения кДНК для амидирующего фермента.

Выделение кДНК используют для скрининга полученных библиотек, например, из полной РНК мозговых тканей карциномы щитовидной железы крысы, их клеточных линий, или из клеточных линий, известных для получения амидирующего фермента, например, биологического депозита IVI 10028 (Ин Витро Интернейшнл, Линтикум, Мэриленд) (ткань МТС крысы), или родственной клеточной линии IVI 10029. Полную РНК получают и Поли-A РНК отбирают огило DT целлюлозой. кДНК получают при помощи хорошо известных методов с использованием первой обратной транскриптазы и затем ДНК-полимеразы. кДНК используют для генерации кДНК-библиотек в векторе λ gt и рекомбинантные ДНК упаковывают in vitro с образованием частиц инфекционного бактериофага.

Экстракты для упаковки коммерчески доступны, например, из Промега Биотех или Клонтех Лабораториез, или могут быть получены в соответствии с методами, хорошо известными в данной области знания. Фаг подвергают скринингу радиомечеными олигонуклеотидными зондами, полученными, как описано выше. Скрининг на бактериофаг, содержащий кДНК альфа-амидирующего фермента ("АЕ кДНК"), осуществляют пластинчатой разводкой образцов бактериофага и поднятием фага на диски нитроцеллюлозного фильтра. Гибридизация двумя или более радиомечеными АЕ-специфическими олигонуклеотидными зондами придает специфичность.

Олигонуклеотидные зонды, обозначенные AE4, AE5, AE8 и AE9 на стр. 61-64 заявка ЕПВ N 0308067, получают специфически при скрининге библиотек, полученных из биологического депозита IVI 10029, указанного выше.

Анализ AE кДНК из многих бактериофагов, выделенных вышеприведенными методами скрининга с олигонуклеотидной гибридизации, показывает, что кДНК могут быть разделены на множество отличающихся типов. Структура одного типа приведена ниже как диаграмма А, где нуклеотиды пронумерованы основанием 1, как первым основанием кодона для инициатора-метионина. Ниже нуклеотидной последовательности приведен однобуквенный аминокислотный код для трансляции последовательности генов в белок. Числа в круглых скобках в конце строки указывают аминокислотные числа.

Другой тип кДНК-последовательности, выделенной олигонуклеотидным гибридизационным скринингом, представлен ниже диаграммой B, где нумерация и другие условные обозначения те же, что и указанные для типа A.

Заявитель использует кДНК, выделенные вышеописанным способом, для конструирования как прокариотных, так и эукариотных векторов экспрессии, и целый ряд хозяев трансфецирован с использованием этих векторов для эффективной экспрессии альфа-амидирующего фермента.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения заявитель выполнил новые модификации относительно вышеприведенных кДНК с тем, чтобы оптимизировать не только экспрессию, но также восстановление амидирующего фермента. Характер и степень модификации могут варьироваться в зависимости от выбранного хозяина и/или вектора. Например, в предпочтительных вариантах заявитель вставил стоп-кодон выше от последовательности, которая иначе бы кодировала домен, перекрывающий мембрану. Присутствие этих доменов, перекрывающих мембраны, может быть нежелательным для системы экспрессии рекомбинантной ДНК, поскольку они могут побуждать экспрессированный белок быть мембрана-ассоциированным и, возможно, неактивным в организме хозяина или клеточной линии. Примеры доменов, перекрывающих мембрану, появляются в двух примерах кДНК, приведенных в диаграммах A и B (примерно, основания 2275-2355 последовательности, приведенной в диаграмме A, и примерно, основания 2587-2667 последовательности, приведенной в диаграмме B). кДНК диаграммы A и B, по существу, идентичны на аминостороне этих трансмембранных доменов, за исключением того, что по-видимому, является интрон-областью от основания 1178 до основания 1492 кДНК типа B.

КДНК диаграмм A и B кодируют белковые продукты размером приблизительно 94 и 105 кД соответственно. Оба этих белка больше, чем зрелые активные ферменты, которые очищены из экстрактов животных тканей или секреций клеточных линий. Каждый из этих продуктов первичной трансляции представляет собой пре-профермент, который содержит мембрана-перекрывающие домены в C-концевой 1/3 части кодирующей последовательности. Предпочтительно, чтобы стоп-кодон располагался так, чтобы экспрессированный белок имел молекулярную массу около 75 при экспрессии с помощью кДНК диаграммы A (то есть, стоп расположен между основаниями 2025 и 2275) и 87 кД при экспрессии с помощью кДНК диаграммы B (то есть, стоп располагается между основаниями, примерно, 2340 и 2590).

Для цитоплазматической экспрессии зрелого альфа-амидирующего фермента в E. coli, например, предпочтительно, чтобы были удалены генные последовательности, которые кодируют натуральную последовательность секреторного сигнала, чтобы кодон инициации располагался в пределах, приблизительно, 50 нуклеотидов генных последовательностей, кодирующих старт зрелого белка, соответствующего альфа-амидирующему ферменту, и чтобы генные последовательности, кодирующие мембрана-перекрывающие домены в C-концевой области, не были транслированы. Кодон инициации, конечно, находится в рамке с последовательностью, которая кодирует фермент, и, в некоторых предпочтительных вариантах, располагается выше от области, иногда непосредственно за данной областью.

При экспрессии AE кДНК в E.coli обнаружено, что натуральная генная последовательность содержит криптический сайт связывания рибосомы E. coli ("RBS") и кодон инициации, внутренний для натуральных последовательностей инициации. Это приводит к получению белка амидирующего фермента, усеченного в N-конце. Хотя это и не препятствует получению желаемого продукта в E.coli, сосуществование правильно инициированных и внутренне инициированных продуктов затрудняет процессинг и очистку рекомбинантного продукта в пригодную форму, и поэтому является нежелательным. Для отщепления неожиданного, не желательного продукта необходимо отщепить или сайт рибосомного связывания, или кодон внутренней инициации, или оба.

Например, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения валин-кодон, который в прокариотных системах кодирует инициирующий метионин, заменяют с помощью точечной мутации эквивалентным неинициирующим валин-кодоном у оснований 661-663 (кДНК любой диаграммы A или B). Вместо этой точечной мутации, или в добавление к ней, в других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения заявитель устранил или в значительной мере модифицировал любую область, кодирующую сайт рибосомного связывания, который встречается непосредственно выше сайта внутренней инициации, и более предпочтительно, любой сайт рибосомного связывания, где бы он не присутствовал. Эти модификации выполнены с тем, чтобы по существу элиминировать внутреннюю инициацию так, чтобы белок, экспрессированный вследствие внутренней инициации, после электрофореза нельзя было наблюдать как отдельную полосу.

Для получения экспрессии секретированного белка активного альфа-амидирующего фермента из клеточной линии рекомбинантного эукариотного хозяина необходимо удалить генные последовательности, кодирующие трансмембранный домен, находящийся в C-концевой области натуральных генных последовательностей. Для кДНК типа A это осуществляют усечением белок-кодирующей области посредством введения стоп-кодона в том месте или вблизи того места, где натуральный амидирующий фермент пост-трансляционно перерабатывается в некоторых натуральных системах, как объясняется более подробно ниже. Для кДНК типа B это также осуществляют путем введения нового стоп-кодона в область ферментного белка, где натуральный амидирующий фермент типа B перерабатывается пост-трансляционно (см. ниже). Это не должно означать исключение возможности того, что в некоторых системах клеток хозяина может быть предпочтительным экспрессировать целые, встречающиеся в природе генные последовательности. Поскольку кДНК типа B содержит последовательности с характеристиками непереработанного нитрона, может возникнуть трудность в экспрессии этой кДНК в некоторых клетках эукариотного хозяина. Эти клетки могут неэффективно продуцировать мРНК из гена типа B вследствие наличия спаренных сайтов акцептора и донора сплайсинга. Элиминирование сайта акцептора поэтому может быть необходимым для обеспечения получения эффективной экспрессии кДНК AE типа B.

Заявитель обнаружил, что карбоксильный конец встречающегося в природе белка альфа-амидирующего фермента с молекулярной массой 75 кД находится за пределами аминокислотного положения 709 (814 для типа B). Для получения белка 75 кД (87 кД для типа B) в клетке хозяина рекомбинантной ДНК стоп-кодон интродуцирован в кДНК мутацией кодона для лизина аминокислотного положения 716 (821 для типа B). Эту модификацию осуществляют с использованием олигонуклеотид-направленного сайт-специфического мутагенеза. Такой мутагенез можно осуществить разнообразными способами. Такие способы широко представлены в литературе по молекулярной биологии. Используемым заявителем основным способом является способ, описанный Тэйлором Дж. У. и др., (1985), Nucl. Acids Res, 13: стр. 8749-8764; Тэйлором Дж. У. и др., (1985), Nucl. Acids Res. , 14: стр. 8764-8785; Накамае К. и Экштейном Ф. (1986), Nucl. Acids. Res. , 13: стр. 9679-9698. Реагенты, необходимые для осуществления данного способа, поставляются в форме комплекта для мутагенеза из Амершам Корпорейшн.

Мутация последовательности изменяет кодон лизина AAA в стоп-кодон TAA. Олигонуклеотид, используемый для мутагенеза, вводит это изменение, однако в иных отношениях является идентичным в смысле последовательности встречающейся в природе кДНК-последовательности для соответствующего фермента (типа A или типа B), подлежащего мутации.

Заявитель также обнаружил, что встречающаяся в природе укороченная форма белка альфа-амидирующего фермента продуцируется процессингом белка типа B во внутренней области белка, которая является уникальной для белка фермента типа B. Это приводит к образованию ферментного продукта, имеющего молекулярную массу около 43 кД. Заявитель полагает, что ДНК-последовательность выше от области интрона является достаточной для кодирования полипептида, способного проявлять значительную альфа-амидирующую активность. Следовательно, полипептиды, которые восстанавливаются без труда и которые способны экспрессировать альфа-амидирующую активность, могут кодироваться кДНК, которые значительно усечены путем помещения стоп-кодона где-то в области интрона кДНК типа B непосредственно перед или после соответствующего местоположения, в котором данный интрон свободен от кДНК типа A. Предпочтительное усечение происходит в результате размещения стоп-кодона в пределах приблизительно 30 пар оснований от начала области интрона, предпочтительно, непосредственно ниже от нее. Для обеспечения получения предпочтительной короткой формы белка альфа-амидирующего фермента в рекомбинантных клетках хозяина создают модифицированную кДНК, имеющую стоп-кодон вместо лизин-кодона в положении аминокислоты 436 кДНК типа B. Эту мутацию осуществляют олигонуклеотид-направленным сайт-специфическим мутагенезом AE кДНК типа B.

Несмотря на то, что укорачивание белка альфа-амидирующего фермента интродукцией стоп-кодона в положении аминокислоты 436 кДНК типа B приводит к получению белка, который наиболее близко приближается к тому, который получен натурально протеолитическим расщеплением продукта первичной трансляции (или некоторых других промежуточных продуктов расщепления в биосинтетическом пути обмена), дополнительное укорачивание белка альфа-амидирующего фермента может также привести к получению активного продукта в клетках хозяина рекомбинантной ДНК. Заявитель модифицировал AE кДНК несколькими иными способами для создания таких более коротких форм белка. В одном примере заявитель использует олигонуклеотид-направленный сайт-специфический мутагенез для преобразования тирозин-кодона в аминокислотном положении 396 кДНК типа B в стоп-кодон. Это изменение приводит к получению белка с молекулярной массой около 39 кД, когда кДНК транслируют и перерабатывают. Во втором случае заявитель использует встречающийся в природе сайт распознавания Bam H1 фермента кДНК типа B с тем, чтобы интродуцировать стоп-кодон мутагенезом линкеров. Этот метод хорошо известен в молекулярной биологии и просто включает расщепление кДНК с последующим лигированием к фрагменту двунитевого синтетического линкера, который комплементарен с одним концом расщепленной кДНК и который интродуцирует в рамке стоп-кодон сразу же за пределами сайта расщепления. Заявитель использует олигонуклеотидный фрагмент со следующей последовательностью с тем, чтобы осуществить данную модификацию
5' GATCCACTAATGATCA 3'
3'GTGATTACTAGTTCGA 5'
Этот линкер интродуцирует стоп-кодон вслед за гистидин-кодоном у аминокислоты 469. Трансляция и процессинг кДНК приводят к синтезу белка с молекулярной массой около 46 кД.

Предпочтительное размещение усекающего стоп-кодона осуществляют в пределах приблизительно 15 пар оснований ДНК-последовательности, которая кодирует последовательные основные остатки (обычно, Lys - Lys), и особенно, непосредственно выше от нее. Заявитель полагает, что натуральный полипептид, кодируемый кДНК типа B, во время пост-трансляционных модификаций, которые встречаются в течение натуральной экспрессии амидирующего фермента, подвергается процессингу в месте расположения или около таких последовательных основных остатков, например, последовательных лизинов, кодируемых в пределах интрон-области кДНК диаграммы. Даже когда инсерцированные стоп-кодоны не предназначены для усечения экспрессированного полипептида вышеописанным образом, предпочтительно, чтобы инсерцированный стоп-кодон располагался в пределах примерно 20 пар оснований (и предпочтительно, непосредственно выше от них) ДНК-последовательностей, кодирующих последовательные основные аминокислотные остатки. Инсерция стоп-кодонов в этих положениях, по-видимому, приведет к экспрессии полипептида, напоминающего некоторые натуральные амидирующие ферменты после того, как они подверглись пост-трансляционному процессингу.

Для цитопластматической экспрессии в прокариотных системах любые области кодирования сигнальной последовательности (например, первые основания кДНК обоих типов A и B, которые выше приведены диаграммами), предпочтительно, элиминируют, и метионин-инициатор-кодон инсерцируют в пределах около 50 нуклеотидов от начала области, которая кодирует амидирующий фермент.

Альтернативный вариант для прокариотной экспрессии элиминирует любые кодирующие последовательности для сигнальной последовательности или последовательности профермента и инсерцирует инициатор-метионин-кодон в пределах около 50 нуклеотидов начала области, которая кодирует амидирующий фермент. Во многих натуральных AE кДНК это соответствует началу области, которая кодирует Ser-X-Ser (X обозначает phe или Ieu). См., например, основания 124-132 последовательности для кДНК типа A или типа B. В некоторых вариантах желательной может быть секреция альфа-амидирующего фермента. В данном случае предпочтительно сохранить области кодирования сигнальной последовательности, или альтернативно, заменить их гетерологичными последовательностями, которые могут выполнять аналогичную функцию, например, сигнальными последовательностями бактериального белка OMP A.

Специалисту в данной области знаний понятно, что в пределах объема настоящего изобретения возможны многочисленные мутации и усечения ДНК-последовательностей, приведенных в данном описании для кодирования амидирующего фермента, и что такие модифицированные последовательности будут кодировать полипептиды, способные функционировать как амидирующие ферменты. Следовательно, формула предлагаемого изобретения должна быть построена с тем, чтобы включать все функциональные эквиваленты ДНК-последовательностей, векторов экспрессии и клеток хозяина.

Примеры прокариотных векторов экспрессии, которые могут быть при желании модифицированы с тем, чтобы включать ДНК-последовательности, кодирующие амидирующий фермент в соответствии с настоящим изобретением, включают (но не ограничиваются) pKK233-, pKK322-2, pKROK-1, pkT279, 280, 287, pPL лямбда, pYEJ 001, pKC30, pPROK-C, все коммерчески доступны. Прокариотные хозяева, которые можно трансфецировать векторами экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, включают (но не ограничиваются) C600, LE392, RRI, DHI, SF8, причем все они коммерчески доступны.

Эукариотные векторы экспрессии, которые по желанию можно модифицировать с тем, чтобы включить ДНК-последовательности, кодирующие амидирующий фермент в соответствии с настоящим изобретением, включают (но не ограничиваются) pMAMNeo, pdBPVMMTNeo, pRSV, peuKCl, pCH110, причем все они коммерчески доступны. Могут быть также использованы соответствующие дрожжевые векторы. Предпочтительные эукариотные хозяева могут быть трансфецированы векторами экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, и они включают (но не ограничиваются) IVI депозит 10029, Hela, CV1, C127, CHO (яичник китайского хомячка) и COS.

Пример 1. Экспрессия белков альфа-амидирующего фермента в E.coli.

Для того, чтобы экспрессировать альфа-амидирующий фермент в E.coli (см. график течения на фиг. 2), фрагмент кДНК, имеющий последовательность, приведенную в диаграмме A, переваривают с KpnI и Hing III и выделяют фрагмент размером около 2,1 кб. Для того, чтобы вновь построить амино-конец, соответствующий натуральному зрелому ферменту, олигонуклеотидный линкер с последовательностью
5'CATGTCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTAC 3'
3' AGTAAAAGGTTACTTACGGAAC 5'
лигируют к этому ДНК-фрагменту. Полученный фрагмент содержит один Nco I-совместимый липкий конец и один липкий конец Hind III. Вектор экспрессии E.coli, pKK233-2, получают коммерческим путем из Фармация Ко. и переваривают рестрикционными ферментами Nco I и Hind III. Большой линейный фрагмент выделяют и лигируют к линкер-адаптированному кДНК-фрагменту. Лигационную смесь используют для трансформации компетентного JM105 E.coli. Трансформанты выбирают по устойчивости к ампициллину и выделенные клоны анализируют на рекомбинантную плазмиду рестрикционным ферментом и анализом ДНК-последовательности с тем, чтобы подтвердить структуру вектора экспрессии Эдалее "pAE12"), который они содержат. Вектор экспрессии содержит гибридный trp-lac промотор, который репрессируется lac-репрессором и индуцируется обработкой клеток изопропилтиогалактозидом (IPTG). Выше от инициатор-метионина вектор также содержит последовательности сайта сильного рибосомного связывания.

Для получения экспрессии альфа-амидирующего фермента в E.coli выращивают рекомбинантные клетки при встряхивании в LB-бульоне при температуре 37^oC до значения оптической плотности (OD₆₀₀), равного 0,4. IPTG прибавляют в культуру до конечной концентрации 1 мМ и выращивание продолжают при температуре 37^oC при встряхивании в течение 3-5 часов. Клетки собирают центрифугированием культуры и супернатант декантируют. Клетки ресуспендируют в буферном растворе, содержащем коктейль ингибиторов протеазы, обрабатывают лизоцимом и затем ультразвуком с тем, чтобы лизировать клеточные мембраны. Лизаты центрифугируют при 12000 x g для разделения растворимой и нерастворимой фракций клеток. Каждую фракцию анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (ЭФ в ПААГ с DDC-Na) и окрашиванием белка. Белок альфа-амидирующего фермента легко идентифицируют в качестве IPTG-индуцируемого продукта в нерастворимой белковой фракции. Поскольку плазмида первоначальной экспрессии не содержат стоп-кодон, специфицированный генными последовательностями альфа-амидирующего фермента, образованный индуцируемый продукт содержит последовательности, специфицированные расположенной ниже векторной ДНК, синтезированной с C-концом белковых последовательностей альфа-амидирующего фермента. Кроме того, индуцированный нерастворимый белок также содержит меньший специфический белок фермента амидирования, нежели тот, который представлен продуктом, образованным внутренней инициацией белкового синтеза в криптическом RBS и кодоном инициации (аминокислотное положение 221 последовательности альфа-амидирующего фермента).

Для удаления нежелательных последовательностей из C-концевой части экспрессированного продукта осуществляют мутацию лизин-кодона в положении 716 последовательности типа A с тем, чтобы генерировать стоп-кодон TAA в данном положении. Мутированную кДНК затем переваривают с Kpn1 и Eco R1 и используют для замещения первоначального фрагмента Kpn1 - EC0 R1 в первоначальном векторе экспрессии pAE12. Аналогичным образом кДНК-последовательности B-типа мутируют в сравнительном положении (аминокислота 821) для создания стоп-кодона, и фрагмент Kpn 1-Eco R1 из мутированной кДНК B-типа используют для замещения соответствующего фрагмента в pAЕ12. Образованные таким образом две плазмиды экспрессии, pAE24 (тип A) и pAE25 (тип B), затем используют для трансформации JM105. Полученные штаммы культивируют для экспрессии, как описано выше для pAE12-содержащих штаммов. Как обнаружено, pAE24 продуцирует два IPTG - индуцируемых нерастворимых белка с молекулярной массой около 75 кД и 55 кД, тогда как обнаружено, что pAE25 продуцирует два IPTG - индуцируемых нерастворимых белка с молекулярной массой около 76 кД и 67 кД. И вновь, малый белок в каждой из этих пар представляет собой нежелательный, усеченный в амино-конце продукт из любой кДНК, либо типа A, либо типа B.

Для элиминирования инициации белкового синтеза в криптическом внутреннем сайте рибосомного связывания и кодонов инициации (аминокислотное положение 221) стартовый кодон GTG (GTG может служить в качестве инициатора-МЕТ-кодона в бактериях) превращают в кодон GTT, который не может инициировать белковый синтез, однако который все же кодирует валин, который обычно присутствует в этом положении в белках альфа-амидирующего фермента, кодируемых натуральными генами. Когда мутированная область кДНК замещена натуральной последовательностью в векторах экспрессии pAE24 и pAE32, создаются два новых вектора pAE31 и pAE32. Трансформация JM105 E.coli этими модифицированными векторами экспрессии и испытание полученных белков из рекомбинантных штаммов показывает, что мутагенез является эффективным средством для элиминирования нежелательной внутренней инициации. IPTG - индуцированный продукт из клеток хозяина, несущих pAE31, имеет молекулярную массу 75 кД, тогда как данный продукт из клеток, трансформированных с помощью pAE32, имеет молекулярную массу 86 кД.

Заявитель обнаружил, что распространенный в природе амидирующий фермент из кДНК типа B перерабатывается посттрансляционно с получением белков с молекулярной массой около 43 кД, и осуществил ряд мутаций в AE кДНК типа B, которые позволяют провести экспрессию белков, которые оканчиваются в положении (или около такового), где заканчивается натурально переработанный фермент. Две из этих мутацией получают олигонуклеотидным мутагенезом, тогда как третью создают мутацией адаптера-линкера, как указано выше. Когда кДНК, несущие эти мутации, используют для замещения соответствующих сегментов pAE32, трансформированных в JM105 и анализированных на белковое получение в экспериментах, аналогичных тем, которые описаны выше, обнаруживаются усеченные белки альфа-амидирующего фермента. При мутации в аминокислотном положении 396 кДНК типа B изменяющей натуральный тирозин-кодон на стоп-кодон (pAE36), обнаруживается ферментный белок с молекулярной массой 39 кД, тогда как линкерный мутагенез, который заканчивает трансляцию у гистидин-кодона у аминокислоты 464, приводит к получению вектора pAE51, который продуцирует рекомбинантный белок альфа-амидирующего фермента с молекулярной массой 46 кД вслед за трансформацией и индукцией JM105 E.coli.

Все рекомбинантные белки альфа-амидирующего фермента, продуцируемые в E. coli, которые описаны выше, сегрегируют с нерастворимой фракцией клеточных экстрактов. Ферментам можно придать растворимость и активность путем обработки с помощью 8 М мочевины с последующим быстрым разбавлением в 50 мМ Трис-HCl, pH 7. Когда JM105 E.coli, несущий pAE12, выращивают и индуцируют с помощью IPTG, как описано выше, белки альфа-амидирующего фермента присутствуют на уровне, по меньшей мере, 30 мг на литр бактериальной культуры.

Характерные примеры индуцированного нерастворимого белка, продуцируемого в E.coli, несущем плазмиды экспрессии AE приведены на фиг. 3 и 4.

Пример 2. Генерирование млекопитающего вектора экспрессии pd BPV-MMTNEO-AE_A75.

Для генерирования млекопитающего вектора экспрессии, который экспрессирует и существенно секретирует альфа-амидирующий фермент типа А с молекулярной массой 75 кД из клеток млекопитающих (см. диаграмму течения фиг. 1), осуществляют следующее:
1) Промежуточный вектор экспрессии pd MMTNeo (коммерчески доступен из Американской коллекции типовых культур) (как показано) переваривают с Bgl11. Линейную форму выделяют и очищают.

2) Рекомбинантную кДНК типа A, содержащую полную пре-пропоследовательность и искусственный стоп-кодон TAA в положении 2146-2148, выделяют путем последовательного переваривания с Bgl 1 и Xho 1. Затем выделяют и очищают фрагмент, соответствующий альфа-амидирующему ферменту.

3) Вставку (альфа-амидирующий фермент типа A) и вектор (pd-MMTNeo) смешивают, и соответственные концы выравнивают с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1. 5'-выступающие сегменты наполняют прибавлением дНТФ и 3'-выступающие сегменты переваривают обратно с получением выровненного конца (альтернативно, последовательные SI-нуклеаза и Кленов + дНТФ могут быть использованы для получения ровных концов). Молекулы с выровненными концами затем лигируют в течение 16 часов при температуре 15^oC.

4) Лигированный материал затем трансформируют в RRI E. coli. Рекомбинантные клоны отбирают в присутствии 50 мкг/мл ампициллина. Ориентацию вставки в рекомбинантные клоны проверяют с использованием комплекта рестрикционных ферментов. Как определено, один клон, упоминаемый как pdMMTNeoα-AE_A75 (клон 11), имеет кДНК типа A в правильной ориентации относительно промотора MMT.

5) Плазмидную ДНК из рекомбинантного pdMMTNeoα-AE_A75 (клона 11) переваривают с помощью Bam H1. Линеаризованный вектор выделяют и очищают, обрабатывая затем бактериальной щелочной фосфатазой (B.A.P) в течение 2 часов при температуре 37^oC с тем, чтобы удалить 5'-фосфаты. Геном BPV-1 выделяют и очищают вслед за перевариванием B и Bam H1 вектора pdBPV-MMTNeo. Этот фрагмент BAm H1 ДНК BPV-1, который имеет размер около 8,0 кб, затем лигируют к вектору pdMMTNeo αAE_A75, линеаризованному с помощью Bam H1 и обработанному B.A.P. при этом лигирование осуществляют в течение 3 часов при температуре 14^oC. После трансформирования лигационной смеси в RRI E.coli рекомбинантные клоны отбирают на агаровых пластинках с бульоном LB и 50 мкг/мл ампициллина. Рекомбинантные плазмиды анализируют на ДНК BPV и также анализируют на кДНК AE типа A. Рестрикционное картирование выявляет, что клон 21 имеет размер около 17 кб и продуцирует ожидаемую рестрикционную карту. Эту эксперссионную плазмиду затем используют для экспрессии αAE_A75 в клетках C127 мыши.

6) Клетки C127 мыши трансфецируют 20 мкг pdBPV-MMTNeo αAE_A75 стандартным методом преципитации в CaPO₄. Приблизительно через 2 недели после трансфекции трансформированные очаги в отдельности поднимают и выращивают в питательной среде, содержащей антибиотик G418. Когда клетки вырастают до достаточной производительности в Модифицированной Среде Дульбекко, пополненной 10%-ной сывороткой плода коровы, клоны исследуют на способность секретировать альфа-амидирующий фермент путем измерения ферментативной активности в кондиционированных средах культуры клеток, а также путем измерения иммунореактивности альфа-амидирующего фермента в среде, используя стандартные методики метки радиоактивным изотопом и иммунопреципитации. Клоны, секретирующие активный, иммунореактивный альфа-амидирующий фермент с молекулярной массой 75 кД, распространяют до большого количества клеток (перенося в клеточную культуральную среду с пониженным содержанием сыворотки и, следовательно, пониженным уровнем экзогенного белка) и используют для получения больших количеств активного рекомбинантного фермента из клеточных кондиционированных сред.

Термины и описания, используемые здесь, представляют собой варианты осуществления изобретения, приведенные только с целью иллюстрации, и не являются ограничениями многих вариантов, которые, по мнению специалиста, могут быть возможными в практике настоящего изобретения.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения альфа-амидирующего фермента. Плазмиду рАЕ12 конструируют на основе рКК233-2 путем переваривания рестриктазами Neo I и Hind III и лигирования к ДНК-фрагменту, кодирующему альфа-амидирующий фермент. Плазмида содержит гибридный trp - lac. Штамм Escherichia coli JM105 трансформируют плазмидой pAEl2. Вектор экспрессии для клеток С127 мыши конструируют на основе рd MMT Neo. Полученная плазмида pdBPV-MMTNeoαAE_A75 содержит промотор ММТ, ДНК-последовательность, кодирующую фермент, ген резистентности к неомицину. Линию клеток С127 мыши трансфицируют указанной плазмидой и получают линию-продуцент альфа-амидирующего фермента. Изобретение позволяет получить фермент с высоким выходом и чистотой. 4 с.п. ф-лы, 4 ил.

Формула