Выделенное антитело против специфического мембранного антигена простаты (psma) и способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих psma - RU2421466C2

Код документа: RU2421466C2

Чертежи

Показать все 54 чертежа(ей)

Описание

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к дефукозилированным антителам к PSMA человека с усиленной способностью направлять клеточную цитотоксичность по отношению к экспрессирующим PSMA клеткам. Изобретение также направлено на клетки-хозяева, экспрессирующие анти-PSMA антитела без фукозильных остатков. Предлагаются также способы применения антител изобретения для ингибирования роста клеток, экспрессирующих PSMA, и ингибирования роста опухолевых клеток с экспрессией PSMA при различных раковых заболеваниях.

Уровень техники

Заболеваемость раком простаты у мужчин занимает лидирующую позицию и является одной из основных причин их смертности. Традиционные методы лечения включают в себя хирургические операции, гормоно- и химиотерапию, а также лучевую терапию. Однако эти методы малоэффективны в случае развития метастаз. Поэтому очень важна идентификация генов и/или их продуктов, представляющих собой диагностические и прогностические маркеры заболевания, а также являющихся мишенями при терапии. Простатоспецифический антиген (PSA) является одним из таких маркеров и используется при клинической диагностике и определении стадии развития опухоли при раке простаты. Однако PSA не дает возможности дифференцировать доброкачественную гиперплазию простаты (ВРН) от простатита и рака простаты в диапазоне 4-10 нг/мл, что требует проведения дополнительных цитологических и/или гистологических исследований для установления точного диагноза (Barren, R.J. et al. (1998) Prostate 36:181-188).

Простатоспецифический мембранный антиген (PSMA) - это трансмембранный гликопротеин II типа массой примерно 110 kD, состоящий из 750 аминокислотных остатков и имеющий примерно 54% гомологии с рецептором трансферрина. PSMA имеет три структурных домена: внутриклеточный - 19 аминокислотных остатков, трансмембранный - 24 аминокислотных остатка и наружный - 707 аминокислотных остатков. PSMA обладает нейрокарбоксипептидазной и фолатгидролазной активностью и, как сообщается, участвует в нейроэндокринной регуляции роста и дифференциации клеток простаты (Heston, W.D. (1996) Urologe-Ausgabe A. 35:400-407). PSM' - это локализованный в цитоплазме белок, полученный в результате альтернативного сплайсинга PSMA.

PSMA преимущественно экспрессируется эпителиальными клетками простаты. Уровень его экспрессии возрастает при раке простаты, особенно в слабодифференцированных, метастатических и резистентных к гормональной терапии карциномах (Gregorakis, А.К. et al. (1998) Seminars in Urologic Oncology 16:2-12; Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85). В тканях вне простаты, например в тонком кишечнике, слюнной железе, слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки, проксимальных почечных канальцах и тканях мозга, наблюдается низкий уровень экспрессии PSMA (Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85). PSMA также экспрессируется эндотелиальными клетками капилляров в околоопухолевой области и внутри опухоли определенной степени злокачественности, в том числе в клетках почечной карциномы и карциномы толстой кишки, но не экспрессируется в кровеносных сосудах нормальных тканей. Сообщалось, что PSMA участвует в ангиогенезе опухолей (Silver, D.A. (1997) Clinical Cancer Research 3:81-85).

Описаны антитела против внеклеточного (наружного) домена PSMA (См., например, Liu, H. et al. (1997) Cancer Res. 57:3629-3634; Murphy, G.P. et al. (1998) J. Urol. 160:2396-2401; Wang, S. et al. (2001) Int. J. Cancer 92:871-876; Kato, K. et al. (2003) Int. J. Urol. 10:439-444; US Patent No. 6,150,508 and US Patent No. 6,107,090). Недавно получены антитела против человеческого и гуманизированного PSMA (См., например, Bander, N.H. et al. (2003) Semin. Oncol. 30:667-676; PCT Publication WO 02/098897; PCT Publication WO 01/09192; PCT Publication WO 03/064606; PCT Publication WO 03/034903; and US Application No. 2004/0033229). Эти антитела используются для окрашивания клеток рака простаты. (См., например, Yao, D. et al. (2002) Semin. Urol. Oncol. 20:211-218; Bander, N.H. et al. (2003) J. Urol. 170:1717-1721). Антитела против PSMA используются также при терапевтическом лечении рака простаты, обычно в виде конъюгата с хемотерапевтическими агентами или радиоактивными изотопами. (См., например, Nanus, D.M. et al. (2003) J. Urol. 170:S84-89; Milowsky, M.I. et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:2522-2531; Henry, M.D. et al. (2004) Cancer Res. 64:7995-8001).

В настоящее время ощущается потребность в улучшенных антителах против PSMA, которые могут быть использованы при терапии и эффективны при лечении и/или предотвращении заболевания, включая экспрессию PSMA. Особенно это касается антител, обладающих цитотоксическим эффектом без конъюгации с хемотерапевтическими агентами или радиоактивными изотопами.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение направлено на изолированные дефукозилированные антитела (то есть на антитела без остатков фукозы), которые связываются с человеческим PSMA и демонстрируют улучшенную опосредованную (направляемую) антителами клеточную цитотоксичность (ADCC) по отношению к клеткам, экспрессирующим PSMA, по сравнению с недефукозилированной формой антител (то есть с антителами, содержащими остатки фукозы). Изобретение направлено также на методы лечения разнообразных заболеваний, при которых наблюдается экспрессия PSMA, с использованием антител и композиций настоящего изобретения.

Дефукозилированные антитела настоящего изобретения связываются с PSMA и ингибируют рост клеток, экспрессирующих PSMA, усиливая опосредуемую антителами клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии человеческих клеток-эффекторов (например, моноцитов или моноядерных клеток), по сравнению с фукозилированной формой антител. Таким образам, антитела настоящего изобретения обеспечивают лучшую эффективность при лечении заболеваний, характеризующихся экспрессией PSMA.

В соответствии с одним из аспектов изобретение направлено на изолированные антитела против простатоспецифического мембранного антигена, не имеющие фукозильных остатков. Предпочтительно, чтобы антитела усиливали зависящую от антител клеточную цитотоксичность по отношению к клеткам, экспрессирующим РSМА на поверхности, по сравнению с формой антигена, содержащего остатки фукозы. В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, антитела без фукозильных остатков имеют значения EC₅₀ ADCC активности против клеток рака простаты LNCaP 0,05 мкг/мл или меньше, или 0,04 мкг/мл или меньше, или 0,03 мкг/мл или меньше, или 0,02 мкг/мл или около 0,018 мкг/мл или меньше. В соответствии с другим предпочтительным аспектом изобретения антитела без фукозильных остатков характеризуются значениями ЕС₅₀ ADCC активности против клеток рака простаты LNCaP, которые, по крайней мере, в 3 раза ниже (или, по крайней мере, в 4 раза ниже, или в 5 раз ниже, или в 6 раз ниже), чем те же значения для антител, имеющих фукозильные остатки.

Предпочтительно, если дефукозилированные антитела настоящего изобретения представляют собой моноклональные антитела. В соответствии с одним из аспектов изобретение направлено на гуманизированные или химерные моноклональные антитела. Предпочтительно, если гуманизированные или химерные антитела получают из антител мыши против PSMA, выбранных из следующей группы: 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4Е10-1.14, 3Е11, 4D8, 3Е6, 3С9, 2С7, 1G3, 3С4, 3С6, 4D4, 1G9, 5С8В9, 3G6, 4С8В9, Е99, J415, J533 и J591. В соответствии с другим аспектом изобретение направлено на человеческие моноклональные антитела.

В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения человеческое моноклональное антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи человека и вариабельный участок легкой цепи человека, где:

(а) вариабельный участок тяжелой цепи человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-9; и

(b) вариабельный участок легкой цепи человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 10-18.

В соответствии с различными аспектами изобретения следующие комбинации тяжелых и легких цепей являются предпочтительными:

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;

вариабельный участок тяжелой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельный участок легкой цепи человека, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

В соответствии с другим аспектом изобретения моноклональное антитело содержит:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 19-27;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 28-36;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 37-45;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 46-54;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 55-63; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 64-72.

В различных аспектах настоящего изобретения следующие комбинации тяжелой цепи и легкой цепи CDR1, CDR2 и CDR3 являются предпочтительными:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 19;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 28;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 46;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 55; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 64;

или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 20;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 29;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 47;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 56; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 65;

или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 21;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 30;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 48;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 57; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 66;

или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 22;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 31;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 49;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 58; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 67; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 23;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 32;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 50;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 59; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 68; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 24;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 33;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 51;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 60; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 69; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 25;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 34;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 52;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 61; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 70; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 26;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 35;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 53;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 62; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 71; или

(a) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 27;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 36;

(d) вариабельный участок легкой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO: 54;

(e) вариабельный участок легкой цепи человека CDR2, содержащий SEQ ID NO: 63; и

(f) вариабельный участок легкой цепи человека CDR3, содержащий SEQ ID NO: 72.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение направлено на дефукозилированные человеческие анти-PSMA антитела, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт или производное гена человека V_H 5-51 или V_H 3-30.3. Изобретение также направлено на дефукозилированные анти-PSMA антитела человека, содержащие вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт или производное гена человека V_k L6, 04/014 или L18. Кроме того, изобретение направлено на дефукозилированные человеческие антитела против PSMA, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой продукт или производное гена человека V_H 5-51 или V_H 3-30.3, и вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой продукт или производное гена человека V_k L6, 04/014 или L18.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение направлено на химерных цыплят, содержащих гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, кодирующие анти-PSMA антитела, такие как анти-PSMA антитела, экспрессированные в зародышах химерных цыплят, где эти антитела не содержат фукозильных остатков. Предпочтительно, гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов являются генами тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение направлено на клетку-хозяин, содержащую гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, кодирующие анти-PSMA антитела, где указанная клетка не содержит фукозилтрансферазу, так что экспрессируемые указанной клеткой анти-PSMA антитела не содержат остатков фукозы. Предпочтительно, чтобы гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина представляли собой гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека. Предпочтительно, если фукозилтрансфераза - это FUT8. Предпочтительно, чтобы клетка-хозяин относилась к линии СНО.

В соответствии с еще одним аспектом изобретение направлено на метод ингибирования роста клеток PSMA+. Метод включает приведение клеток в контакт с дефукозилированными антителами против PSMA в условиях, достаточных для индукции зависящей от антител клеточной цитотоксичности (ADCC) указанных клеток. Клетки могут быть, например, опухолевыми клетками. Предпочтительно, чтобы анти-PSMA антитела представляли собой антитела человека.

Изобретение направлено также на метод ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, где эти опухолевые клетки или эндотелиальные клетки сосудов, расположенных поблизости от опухоли, экспрессируют PSMA. Указанный метод включает назначение субъекту дефукозилированных анти-РSМА антител в количестве, эффективном для ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта. Предпочтительно, чтобы анти-PSMA антитела представляли собой антитела человека. В соответствии с предпочтительными аспектами опухолевые клетки представляют собой опухолевые клетки карциномы простаты.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующего далее подробного описания и примеров, которые не ограничивают область изобретения. Содержание всех ссылок, записей генетического банка (Genbank), патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных в настоящей заявке, явным образом включены в нее по ссылке.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 4А3, 7F12, 8С12, 8А11 и 16F9 (SEQ ID NOs: 1-5, соответственно) в соответствие (выравнивание) с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_H 5-51 (SEQ ID NO: 73).

На Фиг.2 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 4А3, 7F12 и 8С12 (SEQ ID NOs: 10-12, соответственно) в соответствие с аминокислотной последовательности зародышевой линии человека V_k L6 (SEQ ID NO: 74).

На Фиг.3 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 8А11 и 16F9 (SEQ ID NOs: 13 и 14, соответственно) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_k 04/014 (SEQ ID NO: 75).

На Фиг.4 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 78) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 9) вариабельного участка тяжелой цепи 1С3 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 27), CDR2 (SEQ ID NO: 36) и CDR3 (SEQ ID NO: 45) и указаны отклонения от зародышевых линий V, D и J.

На Фиг.5 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 82) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 18) вариабельного участка легкой цепи 1С3 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 54), CDR2 (SEQ ID NO: 63) и CDR3 (SEQ ID NO: 72) и указаны отклонения от зародышевых линий V и J.

На Фиг.6 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 79) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6) вариабельного участка тяжелой цепи 2А10 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 33) и CDR3 (SEQ ID NO: 42) и указаны отклонения от зародышевых линий V и J.

На Фиг.7 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 83) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 15) вариабельного участка легкой цепи 2А10 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 51), CDR2 (SEQ ID NO: 60) и CDR3 (SEQ ID NO: 69) и указаны отклонения от зародышевых линий V и J.

На Фиг.8 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 80) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7) вариабельного участка тяжелой цепи 2С6 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 34) и CDR3 (SEQ ID NO: 43) и указаны отклонения от зародышевых линий V, D и J.

На Фиг.9 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 84) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 16) вариабельного участка легкой цепи 2С6 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 52), CDR2 (SEQ ID NO: 61) и CDR3 (SEQ ID NO: 70) и указаны отклонения от зародышевых линий V и J.

На Фиг.10 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 81) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 8) вариабельного участка тяжелой цепи 2F5 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 26), CDR2 (SEQ ID NO: 35) и CDR3 (SEQ ID NO: 44) и указаны отклонения от зародышевых линий V, D и J.

На Фиг.11 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 85) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 17) вариабельного участка легкой цепи 2F5 моноклональных антител человека. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO: 53), CDR2 (SEQ ID NO: 62) и CDR3 (SEQ ID NO: 71) и указаны зародышевые отклонения V и J.

На Фиг.12 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 2А10, 2С6 и 2F5 (SEQ ID NOs: 6-8, соответственно) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_H 5-51 (SEQ ID NO: 73).

На Фиг.13 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка тяжелой цепи 1С3 (SEQ ID NO: 9) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_H 3-30.3 (SEQ ID NO: 76) и аминокислотной последовательностью зародышевой лини JH6b (SEQ ID NO: 86).

На Фиг.14 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 2С6 (SEQ ID NO: 16) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_k L6 (SEQ ID NO: 74) и аминокислотной последовательностью зародышевой линии JK3 (SEQ ID NO: 87).

На Фиг.15 показано приведение аминокислотной последовательности вариабельного участка легкой цепи 1С3, 2А10 и 2F5 (SEQ ID NOs: 18, 15 и 17, соответственно) в соответствие с аминокислотной последовательностью зародышевой линии человека V_k L18 (SEQ ID NO: 77) и аминокислотной последовательностью зародышевой линии JK4 (SEQ ID NO: 88).

На Фиг.16 показана диаграмма векторов экспрессии Ov7.5 и Ov15. Указаны положения регуляторных последовательностей 5' и 3' векторов Ov. В 3'-конец вектора включена кассета, содержащая EGFP и пиромицин (Puro), которая управляется промотором (Сх), функционирующим в клетках всех типов и облегчающим выделение стабильно трансфектированных линий клеток cES и идентификацию вклада клеток cES в химеры. Подробно МАb-кассета проиллюстрирована в нижней части диаграммы. Тонкая черная линия соответствует последовательностям интронов и нетранслируемым последовательностям, производным от цепей L и Н человека (хотя последовательности интронов не представлены в конструкте Ov15Mab7F12). SiG_VL: последовательность сигнального пептида L-цепи; VL: последовательность гена V L-цепи; Ск: последовательность постоянного участка Каппа L-цепи; IRES: внутренняя рибосомальная последовательность ввода; SiG_VH: последовательность сигнального пептида Н-цепи; VH: последовательность гена V Н-цепи; СН1, Н, СН2 и СН3: кодирующие последовательности доменов СН1, Hinge(шарнира), СН2 и СН3 гамма 1 Н-цепи.

На Фиг.17 и 18 собраны структуры олигосахаридных цепей анти-PSMA антител 7F12, экспрессированные в зародышах цыпленка. Определение проводилось на масс-спектрометре MALDI TOF. Темными кружками отмечена манноза, светлыми кружками - гексозы (манноза или галактоза), темными квадратами - N-ацетилглюкозамин. Вертикальная линия указывает, что последняя гексоза может быть связана с или маннозой, или с N-ацетилглюкозаминовыми остатками вдоль линии.

Фиг.19, 20 представляют собой графики, показывающие результаты измерения ADCC с использованием экспрессируемого клетками СНО антитела 7F12 и экспрессированного организмом цыплят 7F12, по сравнению с изотипическим контролем. Результаты выражены в процентах лизиса.

На Фиг.19 представлены результаты, полученные с использованием IL-2 стимулированных эффекторных клеток.

На Фиг.20 представлены результаты, полученные с использованием свежевыделенных эффекторных клеток периферической крови человека.

На Фиг.21 представлена столбиковая диаграмма, показывающая результаты экспериментов, где ADCC активность экспрессируемых клетками СНО антител 7F12 и экспрессированных организмом цыплят 7F12 была блокирована антителами против CD16, по сравнению с изотипным контролем.

На Фиг.22 и 23 представлен график, показывающий результаты ADCC-анализов фукозилированной и дефукозилированной форм 2А10 mAb ("дефукозилированная") и 2А10 mAb ("родительская") и изотипного контроля.

На Фиг.22 и 23 представлены два независимых эксперимента с использованием клеток-мишеней LNCaP-C42b и стимулированных IL-2 эффекторных клеток.

На Фиг.24 представлены результаты, полученные с использованием клеток LNCaP-C42b и свежевыделенных эффекторных клеток периферической крови человека.

Фиг.25 представляет собой столбиковую диаграмму с результатами анализов ADCC активности для дефукозилированной и фукозилированной форм антител 2А10 mAb ("дефукозилированная") и 2А10 mAb ("родительская") по сравнению с изотипическим контролем и контролем в отсутствие антител, причем в этих анализах ADCC активность была блокирована анти-CD16 антителами.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение направлено на усовершенствованные композиции антител и основанные на их использовании улучшенные методы терапии для лечения и диагностики спектра заболеваний, ассоциированных с экспрессией PSMA и/или клетками, экспрессирующими PSMA. Антитела настоящего изобретения не содержат фукозильных остатков на своих углеводных цепях. Более того, антитела демонстрируют улучшенную направляемую антителами клеточную цитотоксичность (ADCC), связанную с уничтожением клеток PSMA+.

В соответствии с конкретными аспектами антитела настоящего изобретения представляют собой гуманизированные или полностью человеческие антитела и особенно полезны для терапевтического лечения заболеваний людей, связанных с РSМА-экспрессирующими клетками. Методы применения анти-PSMA антител без фукозильных остатков для терапевтического лечения (то есть для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с экспрессией PSMA) также охватываются настоящим изобретением.

Чтобы лучше понять настоящее изобретение, необходимо определить некоторые термины. Это сделано далее. В ходе подробного описания будут введены также дополнительные определения.

Термины "простатоспецифический мембранный антиген" и "PSMA" используются здесь взаимозаменяемо и включают любые варианты, изоформы и межвидовые гомологи человеческого PSMA, естественно экспрессирующиеся клетками и связывающиеся с описанными здесь антителами 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3. Выданный Генбанком номер полной аминокислотной последовательности человеческого белка PSMA - это NP_004467. Полная последовательность кДНК, кодирующая человеческий белок PSMA, получила номер Генбанка NM_004476.

В настоящем изобретении термины "антитела без остатков фукозы" и "дефукозилированные антитела" используются взаимозаменяемо и означают антитела, углеводные фрагменты которых не содержат фукозильных остатков или у которых фукозильные остатки были удалены. Антитела без фукозильных остатков можно получить, например, экспрессией антитела в клетке или системе экспрессии, которая не прикрепляет фукозильные остатки к углеводной цепи антитела или минимизирует прикрепление, или путем химической модификации антитела, удаляющей фукозильные остатки с углеводной цепи (например, обработкой антитела фукозидазой). Термины "без остатков фукозы" и "дефукозилированные" не ограничены механизмами получения антител с измененной структурой углеводов.

В настоящем изобретении термины "антитела, экспрессирующие остатки фукозы" и "фукозилированные антитела" используются взаимозаменяемо и означают антитела, углеводные фрагменты которых содержат фукозу.

Термин "иммунный ответ" означает действие, например, лимфоцитов, антиген представляющих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, образующихся в упомянутых выше клетках или в печени (включая антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к селективному повреждению, разрушению или выведению из человеческого организма внешних патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случае аутоиммунного заболевания или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей.

В настоящем изобретении термин "эффекторные клетки" означает иммунные клетки, вовлеченные в эффекторную фазу иммунного ответа, а не в когнитивную фазу или фазу активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например лимфоциты (например, В- и Т-клетки, в том числе цитолитические Т-клетки (CTL)), клетки-киллеры, клетки-природные киллеры, макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфоядерные клетки, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические рецепторы Fc и выполняют специфические иммунные функции. В соответствии с предпочтительными аспектами эффекторная клетка способна индуцировать зависящую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC), например, такой способностью обладают нейтрофилы. Например, экспрессирующие FcR моноциты и макрофаги принимают участие в специфическом уничтожении клеток-мишеней и представлении антигенов другим компонентам иммунной системы или в связывании с клетками, которые представляют антигены. В соответствии с другими аспектами эффекторная клетка может фагоцитировать антиген-мишень или клетку-мишень. Экспрессия конкретного FcR эффекторной клеткой может регулироваться гуморальными факторами, такими как цитокины. Например, показано, что экспрессия FcαRI усиливается под действием G-CSF или GM-CSF. Такая усиленная экспрессия усиливает эффекторную функцию клеток-носителей FcαRI по отношению к мишеням. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антиген-мишень или клетку-мишень.

"Клетка-мишень" или "целевая клетка" означает любую клетку или патоген, чье уничтожение было бы благоприятно для субъекта (например, человека или животного), и на которое может быть направлена композиция (например, антитела) настоящего изобретения. Например, клеткой-мишенью может быть клетка, экспрессирующая или сверхэкспрессирующая PSMA.

Термин "зависящая от антитела клеточная цитотоксичность" или "ADCC" означает опосредуемую клетками цитотоксическую реакцию, когда клетка-мишень PSMA+ со связанным анти-PSMA антителом распознается эффекторной клеткой с Fc рецепторами и затем лизируется без обязательного участия комплемента.

В контексте настоящего изобретения термин "усиливает ADCC" (например, применительно к клеткам) означает любое заметное усиление лизиса клеток при их взаимодействии с анти-PSMA антителами без фукозильных остатков, по сравнению с уничтожением этих клеток при взаимодействии с фукозилированными анти-РSМА антителами в присутствии эффекторных клеток (например, при отношении клетки-мишени:эффекторные клетки = 1:50), например усиление лизиса клеток по меньшей мере, приблизительно, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300% или 325%.

Термин "антитело" в контексте настоящего изобретения включает целые антитела и их любые антиген-связывающие фрагменты (антиген-связывающие участки) или отдельные цепи. "Антитело" означает гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными мостиками, или его антиген-связывающий участок. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (обозначается V_H) и постоянный участок тяжелой цепи. Постоянный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, С_H1, С_H2 и С_H3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (обозначается V_L) и постоянного участка легкой цепи. Постоянный участок легкой цепи состоит только из одного домена, C_L. Участки V_H и V_L можно также разделить на участки гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR) и перемежающимися с более консервативными участками, так называемыми каркасными участками (FR). Каждый V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке, начиная от аминоконца и до карбоксильного конца: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей содержат домен связывания, взаимодействующий с антигеном. Три постоянных участка антитела могут опосредовать связывание иммуноглобулина с хозяйскими тканями или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (CIq) классической системы комплемента.

Термин "антиген-связывающий участок антитела" (или просто "участок антитела") здесь означает один или несколько фрагментов антитела, обладающих способностью специфически связываться с антигеном (например, с PSMA). Показано, что антиген-связывающая функция антитела может осуществляться фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов антитела, подходящих под определение "антиген-связывающих участков", включают: (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, С_L и С_H1; (ii) фрагмент F(ab')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два домена Fab, связанных дисульфидными мостиками в области петли, (iii) фрагмент Fd, содержащий домены V_H и С_H1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H одного "плеча" антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), содержащий домен V_H; и (vi) изолированный (CDR). Более того, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируются двумя различными генами, их можно объединить с использованием рекомбинантных методов и синтетического линкера, в результате чего они будут образовываться как одна белковая цепочка, в которой пара участков V_L и V_H формирует одновалентные молекулы (называемые одноцепочечными Fv (scFv); см., например., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также попадают под определение "антиген-связывающего участка антитела". Фрагменты этих антител получают традиционными методами, известными специалистам в соответствующей области; их проверка на применимость осуществляется так же, как и в случае интактных антител.

Термин "рекомбинантное человеческое антитело" здесь означает все человеческие антитела, которые готовят, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными методами, в том числе (а) выделенные из животных (например, из мышей) антитела, трансгенные или трансхромосомальные с включением генов иммуноглобулина человека или приготовленные с помощью гибридом (далее этот метод описан подробно), (b) антитела, выделенные из клеток-носителей, которые были трансформированы так, чтобы экспрессировать антитела человека, например, из трансфектом, (с) антитела, взятые из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, и (d) антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные другими способами, предполагающими сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные участки, в которых области каркаса и CDR являются производными от иммуноглобулина зародышевых линий человека. В соответствии с некоторыми аспектами, однако, рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвержены мутагенезу in vitro (или, в случае использования последовательностей животных, трансгенных по отношению к Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности участков V_H и V_L рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и производны от человеческих зародышевых последовательностей V_H и V_L и родственны им, могут и не встречаться в зародышевых человеческих антителах в природе.

Термин "моноклональное антитело" или "композиция моноклональных антител" здесь означает препарат молекул антитела одного молекулярного состава. Композиция моноклональных антител демонстрирует простую (одиночную) специфичность связывания и сродство к конкретному эпитопу.

Термин "антитело человека" здесь означает антитела с переменными участками, у которых как участки каркаса, так и CDR, производны от последовательностей зародышевых линий иммуноглобулина человека. Более того, если антитело содержит постоянный участок, то этот участок также будет производным от последовательностей зародышевых линий иммуноглобулина человека. Антитела человека (человеческие антитела) настоящего изобретения могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями зародышевых линий иммуноглобулина человека (например, они могут быть результатом мутаций вследствие случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматических мутаций in vivo).

Термин "человеческое моноклональное антитело" означает антитела, демонстрирующие простую специфичность связывания, каркасные и CDR вариабельные участки которых происходят от последовательностей зародышевых линий иммуноглобулина человека. В соответствии с одним аспектом изобретения человеческие моноклональные антитела получают из гибридомы, которая содержит В-клетки трансгенного животного, например трансгенной мыши, геном которых содержит трансген тяжелой цепи и легкой цепи человека, включенные в иммортализованную клетку.

Термин "человеческое моноклональное антитело" здесь означает также все антитела человека, которые готовят, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными методами, в том числе (а) выделенные из животных (например, из мышей) антитела, трансгенные или трансхромосомальные с включением генов иммуноглобулина человека или приготовленные с помощью гибридом (далее этот метод описан подробно), (b) антитела, выделенные из клеток-носителей, которые были трансформированы так, чтобы экспрессировать антитела человека, например, из трансфектом, (с) антитела, взятые из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, и (d) антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные другими способами, предполагающими сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные участки, в которых области каркаса и CDR являются производными от иммуноглобулина зародышевых линий человека. В соответствии с некоторыми аспектами, однако, рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвержены мутагенезу in vitro (или, в случае использования последовательностей животных, трансгенных по отношению к Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности участков V_H и V_L рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и производны от человеческих зародышевых последовательностей V_H и V_L и родственны им, могут и не встречаться в зародышевых человеческих антителах в природе.

Термин "выделенное (изолированное) антитело" здесь означает антитела, в значительной степени свободные от примесей других антител с другой антигенной специфичностью (например, выделенные антитела, специфически связывающиеся с PSMA, в значительной степени не содержат примесей антител, связывающихся с другими антигенами). Выделенные антитела, специфически связывающиеся с эпитопами, изоформами или вариантами человеческого PSMA, могут, однако, обладать кросс-реактивностью по отношению к другим родственным антигенам, например, из других видов (например, видовые гомологи PSMA). Более того, выделенное антитело может быть в значительной степени свободно от примесей других клеточных компонентов и/или химических веществ. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения комбинацию "выделенных" моноклональных антител с различной специфичностью объединяют в хорошо описанную композицию.

Термин "гуманизированное антитело" здесь означает антитела, у которых последовательности CDR, выделенные у зародышевых линий других млекопитающих, например мыши, были трансплантированы в каркасные последовательности человека. В каркасные участки этих последовательностей человека могут быть внесены дополнительные модификации.

Термин "химерное антитело" здесь означает антитела, вариабельные участки последовательностей которых получены у одних видов, а постоянные участки - у других видов. Например, у такого антитела вариабельные участки могут быть производными от антитела мыши, а постоянные участки - от антитела человека.

Термин "эпитоп" означает протеиновый детерминант, способный к специфическому связыванию к или с антителом. Обычно эпитопы состоят из химически активных групп молекул на своей поверхности, такие как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и, обычно, характеризуются специфической трехмерной структурой и специфическими зарядами. Конформационные эпитопы отличаются от неконформационных тем, что связывание с первыми прекращается в присутствии денатурирующих агентов, а со вторыми - нет.

В настоящей заявке термин "специфическое связывание" означает связывание антитела с предопределенным антигеном. Как правило, при связывании константа диссоциации (K_D) комплекса антиген-антитело составляет 10^-7 М или меньше, причем K_D при связывании антитела с предопределенным антигеном по меньшей мере в два раза меньше K_D связывания с неспецифическим антигеном (например, с BSA, казеином), то есть не с предопределенным или близкородственным ему антигеном. Фразы "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфическое для антигена" используются взаимозаменяемо с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном".

Термин "изотип" означает здесь класс антитела (например, IgM или IgGI), кодирующийся генами постоянного участка тяжелой цепи.

Термин "вектор" означает здесь молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним из типов вектора является "плазмида", представляющая собой петлю двухцепочечной ДНК, в которую могут быть встроены дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, дополнительные сегменты ДНК могут быть встроены в вирусный геном. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они были введены (например, бактериальные векторы с бактериальной природой репликации или эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки-хозяина при попадании в нее и, таким образом, реплицируются вместе с геномом носителя. Более того, существуют векторы, способные управлять экспрессией генов, с которыми оперативно связаны. Такие векторы называются здесь "векторы рекомбинантной экспрессии" (или просто "векторы экспрессии"). В общем случае, векторы экспрессии, применимые в технологиях рекомбинантной ДНК, часто существуют в виде плазмид. В настоящем описании термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является самой распространенной формой вектора. Однако настоящее изобретение охватывает также и другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефектом репликации, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") в настоящем изобретении означает клетку, в которую был введен вектор рекомбинантной экспрессии. Необходимо понимать, что эти термины относятся не только к конкретной клетке, но и к ее потомству. Поскольку в последующих поколениях могут возникать различные модификации, определяемые либо мутациями, либо влиянием окружающей среды, такое потомство может и не быть идентичным родительской клетке, но все-таки оно входит в область действия термина "клетка-хозяин" в настоящей заявке. Рекомбинантные клетки-носители включают, например, клетки СНО, трансфектомы и лимфатические клетки.

Термин "субъект" здесь означает человека или другое животное. Термин "другое животное" включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы (не люди), овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д.

Термин "трансгенное животное" означает здесь животное (не человека), геном которого содержит один или больше трансген или трансхромосому тяжелых и/или легких цепей человека (интегрированных или неинтегрированных в природную геномную ДНК животного) и которое способно экспрессировать полностью человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может содержать трансген легкой цепи человека и либо трансген, либо трансхромосому тяжелой цепи человека, так что такая мышь будет вырабатывать анти-PSMA антитела человека при иммунизации антигеном PSMA и/или экспрессирующими PSMA клетками. Трансген тяжелой цепи человека можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши, что имеет место в случае трансгенной мыши, например мыши HuMAb, а можно ввести его экстрахромосомно, что имеет место для трансхромосомной мыши (например, КМ), как описано в патенте WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши способны вырабатывать различные изотипы моноклональных антител человека к PSMA (например, IgG, IgA и/или IgE), если осуществлять рекомбинацию V-D-J и переключать изотипы.

В следующих подразделах более подробно описаны различные аспекты настоящего изобретения.

Анти-PSMA антитела без остатков фукозы, обладающие усиленной активностью ADCC

Настоящее изобретение направлено на дефукозилированные анти-PSMA антитела с усиленной управляемой антителами клеточной цитотоксичностью (ADCC) по отношению к клеткам, экспрессирующим PSMA, по сравнению с фукозилированной формой антител. В соответствии с предпочтительным аспектом дефукозилированные антитела настоящего изобретения индуцируют повышенную ADCC к клеткам карциномы простаты LnCaP in vitro (АТСС CRL-1740) по сравнению с фукозилированной формой антител, например, в условиях, когда концентрация антител составляет 0,1 мкг/мл, а отношение количества клеток-мишеней к эффекторным клеткам составляет 1:100. Предпочтительно, если эффекторными клетками являются IL-2 стимулированные клетки периферической крови человека (например, 1×10⁶моноядерных клеток периферической крови человека инкубируют с человеческим IL-2 (10 U/мл) в течение ночи при 37°С). Дефукозилированная форма антител предпочтительно сравнивается с фукозилированной формой, которая получена экспрессией в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО.

В соответствии с предпочтительными аспектами изобретения ADCC активность дефукозилированной формы антител характеризуется значением эффективной коцентрации EC₅₀, равным 0,05 мкг/мл или меньше, более предпочтительно 0,04 мкг/мл или меньше, еще более предпочтительно 0,03 мкг/мл или меньше, еще более предпочтительно 0,02 мкг/мл или меньше и еще более предпочтительно, если ЕС₅₀, приблизительно составляет 0,018 мкг/мл. В соответствии с другими предпочтительными аспектами изобретения ADCC активность дефукозилированной формы антител характеризуется значением ЕС₅₀, равным 0,01 мкг/мл или меньше, более предпочтительно 0,009 мкг/мл или меньше, еще более предпочтительно 0,008 мкг/мл или меньше, еще более предпочтительно 0,007 мкг/мл или меньше, еще более предпочтительно 0,005 мкг/мл или меньше и еще более предпочтительно, если ЕС₅₀ приблизительно составляет 0,002 мкг/мл. Предпочтительно определять значения ЕС₅₀ ADCC активности анализом, который описан в Примере 4 с использованием IL-2-стимулированных эффекторных клеток, или анализом, описанным в Примере 4 с использованием человеческих эффекторных клеток свежевзятой периферической крови.

В соответствии с другими предпочтительными аспектами изобретения значения ЕС₅₀ ADCC активности дефукозилированной формы антител, по меньшей мере, в три раза меньше, чем для фукозилированной формы (например, формы антител, экспрессирующихся клеткам СНО), более предпочтительно, если, по меньшей мере, в 4 раза меньше, чем для фукозилированной формы, еще более предпочтительно, если, по меньшей мере, в 5 раз меньше, чем для фукозилированной формы, еще более предпочтительно, если, по меньшей мере, в 6 раз меньше, чем для фукозилированной формы, еще более предпочтительно, если, по меньшей мере, в 7 раз меньше, чем для фукозилированной формы, еще более предпочтительно, если, по меньшей мере, в 8 раз меньше, чем для фукозилированной формы, еще более предпочтительно, если, по меньшей мере, в 9 раз меньше, чем для фукозилированной формы, и еще более предпочтительно, если, по меньшей мере, в 10 раз меньше, чем для фукозилированной формы антитела. Предпочтительно также определять значения ЕС₅₀ ADCC активности анализом, который описан в Примере 4 с использованием IL-2-стимулированных эффекторных клеток, или анализом, описанным в Примере 4 с использованием человеческих эффекторных клеток свежевзятой периферической крови. Как правило, отношение ЕС₅₀ (фукозилированные):ЕС₅₀ (дефукозилированные) больше для эффекторных клеток свежевзятой периферической крови, хотя в этом случае максимальный процент лизиса будет меньше.

Усиленную активность ADCC дефукозилированных антител настоящего изобретения можно количественно измерить, например, как увеличение процента лизиса клеток по сравнению с фукозилированной формой антитела, причем активность ADCC для фукозилированной и дефукозилированной форм измеряется в одних и тех же условиях (например, одинаковые концентрации антител и одинаковые отношения концентрации клеток-мишеней к эффекторным клеткам). В дополнение к этому или альтернативно, усиленную активность ADCC дефукозилированных антител настоящего изобретения можно количественно измерить через снижение значения EC₅₀ дефукозилированной формы по сравнению с фукозилированной. Это снижение можно выразить как отношение ЕС₅₀ фукозилированной формы к ЕС₅₀ дефукозилированной формы.

Примеры клеточных линий PSMA+, которые могут использоваться в эссеях ADCC настоящего изобретения и по отношению к которым дефукозилированные антитела настоящего изобретения демонстрируют усиленную активность ADCC, по сравнению с фукозилированной формой антител, включают клетки LnCaP, 22Rv1 и/или PCa2b. Усиленный дефукозилированными анти-PSMA антителами ADCC эффект может приводить к ADCC-активности клеток PSMA+ при такой концентрации антител, когда ADCC вообще не наблюдается при использовании фукозилированной формы.

Дефукозилирование анти-PSMA антител

Анти-PSMA антитела (например, мышиные, химерные, гуманизированные и человеческие) известны в науке, и они могут применяться в настоящем изобретении. Анти-PSMA антитела настоящего изобретения модифицированы так, что у них отсутствуют фукозильные остатки. Антитела без фукозильных остатков можно получить различными способами. Например, с помощью технологий рекомбинантной ДНК их можно экспрессировать в клетке с измененным механизмом гликозилирования, при котором будет ингибироваться введение остатков фукозы в углеводную цепочку. Кроме того (или в дополнение к этому), антитела можно дефукозилировать, химически удалив фукозильные остатки.

Более того, в соответствии с предпочтительным аспектом антитела можно экспрессировать в химерной системе экспрессии цыплят, так что антитела будут образовываться в зародышах химерных цыплят. Работа с химерными зародышами цыплят, экспрессирующими анти-PSMA антитела, подробно описана в Примере 1, а в Примере 3 показано, что такие экспрессированные в зародышах цыплят анти-PSMA антитела не содержат остатков фукозы. Химерные цыплята, зародыши которых подходят для экспрессии протеинов, описаны в заявке РСТ WO 2004/015123. Таким образом, в соответствии с другим аспектом изобретение направлено на химерных цыплят, содержащих гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, кодирующие экспрессирующиеся в зародышах химерных цыплят анти-PSMA антитела, причем эти антитела не содержат остатков фукозы. Предпочтительно, чтобы гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина представляли собой гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека.

В соответствии с одним аспектом изобретения антитела экспрессируют в клетках, в которых отсутствует фермент фукозилтрансфераза, так что такая клеточная линия вырабатывает протеины без остатков фукозы в углеводных цепях (см. Примеры 5 и 6). Например, ген фукозилтрансферазы FUT8 (альфа(1,6)фукозилтрансфераза) отсутствует в клеточных линиях Ms704, Ms705 и Ms709, так что в углеводных цепочках антител, экспрессирующихся в клетках Ms704, Ms705 и Ms709, отсутствуют остатки фукозы. Линии Ms704, Ms705 и Ms709 FUT8-/- были созданы целевым разрушением гена FUT8 в клетках CHO/DG44 с использованием двух векторов замещения (см. U.S. Patent Publication No. 20040110704 by Yamane et al. и Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). В качестве еще одного примера, в работе ЕР 1,176,195 Hanai et al. описывают клеточную линию с функционально поврежденным геном FUT8, кодирующим фукозилтрансферазу, так что антитела, экспрессируемые в таких линиях, демонстрируют гипофукозилирование, уменьшая количество или вовсе устраняя фермент, родственный альфа 1,6 связи. Hanai с соавторами описывают клеточные линии, от природы характеризующиеся низкой активностью фермента, присоединяющего фукозу к N-ацетилглюкозамину, который связывается с участоком Fc антитела, или не обладающие такой активностью. Например, это может быть линия крысиной миеломы YB2/0 (АТСС CRL 1662). Поданная Presta заявка РСТ Publication WO 03/035835 содержит описание вариантной линии клеток СНО, клеток Lec13 с уменьшенной способностью прикреплять фукозу к Asn(297)-связанным углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессирующихся в этих клетках-носителях (см. также Shields, R.L et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В публикации РСТ WO 99/54342 Umana et al. описывает клеточные линии, сконструированные так, чтобы экспрессировать гликопротеин-модифицированные гликозилтрансферазы (например, бета(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnTIII)), так что экспрессирующиеся в этих сконструированных клеточных линиях антитела демонстрировали повышенное содержание раздвоенных структур GlcNac, что приводило к повышению активности ADCC антител (см. также Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).

В соответствии с другим аспектом анти-PSMA антитела экспрессируются, а фукозильные остатки отщепляются от нее с помощью фермента фукозидазы. Например, удалить фукозильные остатки от антител можно с помощью фукозидазы альфа-L-фукозидазы (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Кроме того, в соответствии с другими аспектами можно приготовить и другие формы гликозилированных антител. Например, можно сделать агликозилированные антитела (то есть антитела без гликозилирования). Подобные углеводные модификации могут сопровождаться, например, изменением одного или нескольких сайтов гликозилирования последовательности антитела. Например, в результате одной или нескольких аминокислотных замен можно удалить один или несколько каркасных сайтов гликозилирования вариабельного участка и, таким образом, этот сайт гликозилироваться не будет. Подобное агликозилирование может повышать сродство антитела к антигену. Подробно этот подход описан в патентах U.S. Patent Nos. 5,714,350 и 6,350,861 Co et al.

Определение отсутствия остатков фукозы у анти-PSMA антител

Антитела настоящего изобретения не содержат фукозильных остатков, например, в фрагменте Fc углеводной цепи. Антитела можно проверить на отсутствие фукозильных остатков стандартными методами, известными в соответствующей области, например капиллярным электрофорезом APTS с индукцией флуоресценции лазерным излучением. Кратко, N-связанные олигосахариды очищенных анти-PSMA антител выделяют, добавляя пептид N-гликаназу (Прозим) с последующей инкубацией в течение одной ночи. Углеводы ресуспендируют и дериватизируют 8-аминопирен-1,3,6-трисульфонатом (APTS) в мягких условиях восстановительного аминирования, при которых минимизируется дезалилирование и отщепление фукозильных остатков. Аддукты реакции анализируют капиллярным электрофорезом с детекцией индуцированной лазером флуоресценции на детекторе производства Beckman Coulter. Отсутствие фукозы можно определить по сдвигу в электрофорезе по сравнению с тем же антителом, содержащим фукозу. Отсутствие фукозы в анти-PSMA антителах можно определить также методом моносахаридного анализа с использованием HPLC. Другие методы анализа содержания углеводов и структуры антител включают MS-профилирование экспрессируемых углеводов (гликомика), прямой MALDI TOF анализ высвобождающихся интактных гликанов (позволяющий определить массу гликанов различных классов), низкие спектры CID MSMS (чтобы получить информацию о структурной композиции гликанов), высокие спектры CID MSMS и спектры MSn (дающие информацию о соединимости гликанов между собой), а также последовательное поглощение экзогликозидазой (дающее информацию о структурной совместимости гликанов). Методология определения содержания углеводов в антителах подробно рассматривается в Примере 3.

Измерение зависящего от антител уничтожения клеток PSMA+

Дефукозилированные анти-PSMA антитела можно проверить на способность опосредовать фагоцитоз и убивать клетки, экспрессирующие PSMA. В соответствии с одним аспектом изобретения дефукозилированные анти-PSMA антитела усиливают уничтожение клеток, экспрессирующих PSMA, по сравнению с такими же антителами, содержащими фукозу в той же концентрации. В соответствии с другим аспектом дефукозилированные анти-PSMA антитела индуцируют гибель экспрессирующих PSMA клеток, причем такие же антитела, содержащие фукозу, в той же концентрации не индуцируют эту гибель.

ADCC активность моноклональных антител можно проверить в анализах in vitro. Например, можно воспользоваться анализом ADCC, основанным на высвобождении хрома. Кратко, моноядерные клетки периферической крови (РВМС) или другие эффекторные клетки здоровых доноров очищают центрифугированием в градиенте плотности Ficoll Hypaque с последующим лизисом содержащихся там следовых количеств эритроцитов. Промытые РВМС суспендируют в RPMI с 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой и смешивают с клетками, меченными⁵¹Cr и экспрессирующими PSMA. Это делают с различным отношением концентрации эффекторных клеток к клеткам опухолей (эффекторные клетки:опухолевые клетки). После этого в различных концентрациях добавляют анти-PSMA антитела. В качестве отрицательного контроля можно использовать изотипно соответствующие антитела. Анализы выполняют при 37°С в течение 4-18 часов. Цитолиз образцов измеряют, определяя высвобождение⁵¹Cr в культуральный супернатант. Можно также тестировать одновременный эффект различных анти-РSМА моноклональных антител, определяя, не усиливается ли цитолиз в присутствии нескольких форм антител.

Альтернативным анализом, позволяющим определить способность анти-РSМА антител опосредовать фагоцитоз и гибель экспрессирующих РSМА клеток, является флуорометрический анализ с разрешением во времени. Кратко, экспрессирующие PSMA клетки загружают в ацетоксиметильный эфир усиливающего флуоресценцию лиганда (BATDA), проникающего сквозь клеточные мембраны. Внутри клетки эфирные связи гидролизуются, и соединение уже не может проходить сквозь мембраны. После этого в различных концентрациях добавляют анти-PSMA антитела. По завершении цитолиза в систему вводят раствор европия (Perkin Elmer), и все свободные лиганды связываются с европием, формируя высокофлуоресцирующий стабильный комплекс (EuTDA), который можно определять на микропланшетном ридере (Perkin Elmer). Интенсивность измеренного сигнала коррелирует с количеством лизировавшихся клеток.

Предпочтительный метод анализа ADCC для изучения ADCC активности анти-PSMA антител настоящего изобретения подробно рассматривается в Примере 4.

Анти-PSMA антитела можно тестировать на модели in vivo (например, на мышах), определяя их эффективность в опосредовании фагоцитоза и уничтожении экспрессирующих PSMA клеток, то есть опухолевых клеток. Эти антитела можно выбирать, например, руководствуясь следующими не ограничивающимися критериями:

1. Связывание с живыми клетками, экспрессирующими PSMA.

2. Высокое сродство при связывании PSMA.

3. Связывание с уникальным эпитопом на PSMA (чтобы устранить возможную конкуренцию моноклональных антител с комплементарной активностью при совместном использовании).

4. Интернализация клеток, экспрессирующих PSMA.

5. Опосредование in vitro ингибирования роста, фагоцитоза и/или уничтожения клеток, экспрессирующих PSMA, в присутствии эффекторных клеток человека.

Предпочтительные моноклональные антитела настоящего изобретения соответствуют одному или нескольким перечисленным критериям. В конкретном аспекте настоящего изобретения моноклональные антитела используют совместно, например, в составе фармацевтической композиции, содержащей два или более анти-PSMA моноклональных антитела или их фрагментов. Например, чтобы добиться желаемого терапевтического или диагностического эффекта, в одном составе можно объединить анти-PSMA моноклональные антитела с различной, но комплементарной активностью. Иллюстрацией такого подхода является композиция, содержащая анти-PSMA моноклональные антитела, опосредующие высокоэффективное уничтожение клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток, а также еще один тип анти-PSMA моноклональных антител, ингибирующих рост клеток, экспрессирующих PSMA.

Измерение связывания с PSMA

Связывание антител настоящего изобретения с PSMA можно тестировать, например, стандартными методами анализа, известными в соответствующей области, такими как ELISA, FACS и/или Biacore. Кратко, в типичном анализе ELISA планшеты для микротитрования покрывают очищенным PSMA в концентрации 0.25 мкг/мл в PBS и затем блокируют раствором 5% бычьего сывороточного альбумина в PBS. В каждую ячейку вводят разбавленные до нужной концентрации антитела и инкубируют на 1-2 часа при температуре 37°С. Планшеты промывают после этого системой PBS/Tween и инкубируют с вторичным реагентом (например, Fc-специфическим поликлональным реагентом в случае антител человека или козы к человеческому IgG), конъюгированным к щелочной фосфатазе. Промывку осуществляют в течение часа при 37°С. По завершении промывки планшеты инкубируют с субстратом pNPP (1 мг/мл) и анализируют при OD 405-650.

Чтобы продемонстрировать связывание моноклональных антител с экспрессирующими PSMA живыми клетками, можно использовать цитометрию в потоке. В соответствии с типичным протоколом такого метода (не ограничивающим область изобретения), экспрессирующие PSMA клеточные линии (выращенные в стандартных условиях) смешивают с различными концентрациями моноклональных антител в PBS, содержащем 0,1% BSA и 20% мышиной сыворотки, и затем один час инкубируют при 37°С. После последующей промывки клетки реагируют с меченными флуоресцеином вторичными антителами (например, античеловеческим IgG антителом) в тех же условиях, что и для первичных антител. Образцы можно анализировать на приборе FACScan, использующем свет и свойства бокового рассеяния, позволяющие регистрировать отдельные клетки. В дополнение или помимо цитометрии в потоке можно использовать также флуоресцентную микроскопию. Клетки окрашивают так, как было описано, и затем изучают методом флуоресцентной микроскопии. Данный метод позволяет увидеть отдельные клетки, но его чувствительность может быть понижена в зависимости от плотности антигена.

Взаимодействие анти-PSMA антител с антигеном PSMA можно исследовать также методом Вестерн-блоттинга. Например, можно приготовить экстракты клеток, экспрессирующих PSMA, и поставить с ними электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS). По окончании электрофореза выделенные антигены переносят на мембрану из микроцеллюлозы, блокируют 20% мышиной сывороткой и анализируют с помощью тестируемых моноклональных антител. Для детекции связывания антител можно использовать антиспецифические специфические вторичные антитела, соединенные со щелочной фосфатазой и поставляемые с субстратными таблетками BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, МО). Известны и другие технологии, позволяющие оценить способность антител связываться с PSMA, к их числу относятся RIA и анализ Biacore. Подробно подходящие методы определения связывания PSMA описаны в Примере 4.

Химерные или гуманизированные анти-PSMA антитела

В соответствии с определенными аспектами дефукозилированные анти-PSMA антитела настоящего изобретения представляют собой химерные или гуманизированные антитела. Такие антитела получают из доступных мышиных анти-PSMA антител с помощью известных процедур превращения мышиного антитела в химерное или гуманизированное антитело. Неограничивающие примеры таких мышиных анти-PSMA антител включают 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4Е10-1.14, 3Е11, 4D8, 3Е6, 3С9, 2С7, 1G3, 3С4, 3С6, 4D4, 1G9, 5С8В9, 3G6, 4С8В9, Е99, J415, J533 и J591 моноклональные антитела. Гибридомы, секретирующие 3F5.4G6, 3D7.1.1, 4Е10-1.14, 3Е11, 4D8, 3Е6, 3С9, 2С7, 1G3, 3С4, 3С6, 4D4, 1G9, 5С8В9, 3G6 или 4С8В9 были выгружены для всеобщего доступа и описаны в патенте US No. 6,150,508. Гибридомы, секретирующие Е99, J415, J533 или J591 были выгружены для всеобщего доступа и описаны в патенте US No. 6,107,090. Более того, гуманизированные анти-PSMA антитела, включая гуманизированную версию J591, подробно описаны в публикации РСТ WO 02/098897. Кроме того, другие античеловеческие PSMA антитела также были описаны, например, это антитела mAb 107-1A4 (Wang, S. et al. (2001) Int. J. Cancer 92:871-876) и mAb 2C9 (Kato, K. et al. (2003) Int. J. Urol. 10:439-444).

Моноклональные анти-PSMA антитела человека

Предпочтительные антитела настоящего изобретения включают анти-PSMA моноклональные антитела человека. В качестве примеров таких антител можно указать 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 антитела, они были выделены и структурно охарактеризованы, как первоначально было описано в публикациях РСТ WO 01/09192 и WO 03/064606, а также в американской временной заявке (U.S. Provisional Application) No. 60/654,125, озаглавленной "Моноклональные антитела человека к простатоспецифическому мембранному антигену (PSMA)", поданной 18 февраля 2005 года; содержание всех этих работ явным образом включено сюда по ссылке. Аминокислотные последовательности VH антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены как SEQ ID NOs: 1-9, соответственно. Аминокислотные последовательности VL антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены как SEQ ID NOs: 10-18, соответственно. Другие человеческие анти-PSMA антитела, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают антитела, которые рассматриваются в публикации РСТ WO 03/034903 и заявке США No. 2004/0033229.

Поскольку каждая из этих молекул может связываться с PSMA, последовательности V_H и V_L можно смешивать и спаривать друг с другом, создавая другие анти-PSMA связывающие молекулы настоящего изобретения. Для проверки способности таких "перемешанных" антител связывать PSMA можно воспользоваться анализами для определения связывания, хорошо известными в данной области, такими как анализы FACS и ELISA. Предпочтительно, когда цепи V_H и V_L смешаны и приведены в соответствие друг с другом и последовательность V_H конкретной пары V_H/V_L замещена на структурно похожую последовательность V_H. Аналогично, предпочтительно, если последовательность V_L конкретной пары V_H/V_L замещена на структурно похожую последовательность V_L. Например, очень хорошо поддаются перемешиванию последовательности V_H антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6 и 2F5, так как в этих антителах используются V_H последовательности, которые получены от одной и той же зародышевой последовательности (V_H 5-51) и поэтому демонстрируют структурное сходство. Аналогично этому очень хорошо поддаются перемешиванию последовательности V_L антител 4А3, 7F12, 8С12 и 2С6, так как в этих антителах используются V_L последовательности, которые получены от одной и той же зародышевой последовательности (V_L L6), и поэтому они демонстрируют структурное сходство. Аналогично этому также очень хорошо поддаются перемешиванию последовательности V_L антител 8А11 и 16F9, так как в этих антителах используются V_L последовательности, которые получены от одной и той же зародышевой последовательности (V_L 04/014), и поэтому они демонстрируют структурное сходство. Аналогично этому также очень хорошо поддаются перемешиванию последовательности V_L антител 1С3, 2А10 и 2F5, так как в этих антителах используются V_L последовательности, которые получены от одной и той же зародышевой последовательности (V_L L18), и поэтому они демонстрируют структурное сходство.

В соответствии с конкретными аспектами изобретение направлено на дефукозилированные моноклональные антитела или их антиген-связывающие участки, содержащие:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NOs: 1-9; и

(b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NOs: 410-18, где антитела специфически связывают PSMA человека.

Предпочтительные комбинации тяжелых и легких цепей включают:

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и

(b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; или

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; или

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; или

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

В соответствии с другим аспектом изобретение направлено на дефукозилированные антитела, содержащие тяжелую и легкую цепи CDR1, CDR2 и CDR3 антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 или 1С3, или их комбинацию. Аминокислотные последовательности V_H цепей CDR1 антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены номерами SEQ ID NOs: 19-27, соответственно. Аминокислотные последовательности V_H цепей CDR2 антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены номерами SEQ ID NOs: 28-36, соответственно. Аминокислотные последовательности V_H цепей CDR3 антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены номерами SEQ ID NOs: 37-45, соответственно. Аминокислотные последовательности V_K цепей CDR1 антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены номерами SEQ ID NOs: 46-54, соответственно. Аминокислотные последовательности V_К цепей CDR2 антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены номерами SEQ ID NOs: 55-63, соответственно. Аминокислотные последовательности V_К цепей CDR3 антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3 представлены номерами SEQ ID NOs: 64-72, соответственно. Регионы CDR выделены в соответствии с системой Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

Поскольку каждое из этих антител может связываться с PSMA, и антиген-связывающая специфичность обеспечивается, в основном, участками CDR1, 2 и 3, цепи V_H последовательностей CDR1, 2 и 3 и цепи V_К последовательностей CDR1, 2 и 3 можно смешивать и соотносить (то есть можно смешивать и соотносить CDR различных антител, хотя каждое антитело должно содержать V_H CDR1, 2 и 3 и Vk CDR1, 2 и 3) с получением других анти-PSMA связывающих молекул настоящего изобретения. Для проверки способности таких "перемешанных" антител связывать PSMA можно воспользоваться анализами для определения связывания, хорошо известными в данной области, такими как анализ FACS и анализ ELISA. Предпочтительно, в случае смешивания последовательностей V_H CDR, последовательности CDR1, CDR2 и/или CDR3 конкретной последовательности V_H замещают на структурно похожие последовательности CDR. Аналогично этому, в случае смешивания последовательностей V_К CDR, последовательности CDR1, CDR2 и/или CDR3 конкретной последовательности V_К замещают на структурно похожие последовательности CDR. Специалисту в данной области понятно, что для создания новых последовательностей V_H и V_L одну или несколько последовательностей CDR участков V_H и/или V_L можно заменить на структурно похожие последовательности CDR, описанные здесь для моноклональных антител 4А3, 7F12, 8С12, 8А11, 16F9, 2А10, 2С6, 2F5 и 1С3.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение направлено на дефукозилированные моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, содержащие:

(а) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 19-27;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 28-36;

(c) вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 37-45;

(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 46-54;

(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 55-63; и

(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 64-72;

Где антитело специфически связывается с PSMA.

В соответствии с предпочтительным аспектом антитела содержат:

(a) вариабельный участок тяжелой цепи CDR1 человека, содержащий SEQ ID NO: 19;

(b) вариабельный участок тяжелой цепи CDR2 человека, содержащий SEQ ID NO: 28;

(d) вариабельный участок легкой цепи CDR1 человека, содержащий SEQ ID NO: 46;

(e) вариабельный участок легкой цепи CDR2 человека, содержащий SEQ ID NO: 55; и

(f) вариабельный участок легкой цепи CDR3 человека, содержащий SEQ ID NO: 64.