Способы создания синтетических хромосом, имеющих генные регуляторные системы, и их применение - RU2018139465A

1. Способ конструирования реципиентной клетки с по меньшей мере двумя целевыми нуклеиновыми кислотами, каждая под контролем регуляторной контрольной системы, включающий:

трансфицирование реципиентных клеток первой линии компонентами для создания синтетической хромосомы, включая нуклеотидные последовательности, допускающие сайт-специфическую интеграцию целевых нуклеотидных последовательностей;

получение синтетической хромосомы-платформы с множеством сайтов сайт-специфической рекомбинации;

трансфицирование реципиентных клеток первой линии первым вектором доставки, содержащим первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы;

активирование сайт-специфической рекомбинации между синтетической хромосомой-платформой и первым вектором доставки, при этом первая целевая нуклеиновая кислота под контролем первой регуляторной контрольной системы нагружается на синтетическую хромосому-платформу, с получением синтетической хромосомы, экспрессирующей первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы;

выделение второй реципиентной клетки, содержащей синтетическую хромосому, экспрессирующую первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы;

наращивание вторых реципиентных клеток;

трансфицирование вторых реципиентных клеток вторым вектором доставки, содержащим вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы;

активирование сайт-специфической рекомбинации между синтетической хромосомой-платформой и вторым вектором доставки, при этом вторая целевая нуклеиновая кислота под контролем второй регуляторной контрольной системы нагружается на синтетическую хромосому-платформу, с получением синтетической хромосомы, экспрессирующей первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы и вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы; и

выделение третьей реципиентной клетки, содержащей синтетическую хромосому, экспрессирующую первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы и вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы.

2. Способ по п. 1, где первую и вторую регуляторные контрольные системы выбирают из Tet-On, Tet-Off, индуцируемой переключением Lac системы, экдизон-индуцируемой системы, системы переключения генов с использованием кумата или тамоксифен-индуцируемой системы.

3. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап индукции транскрипции первой и второй целевых нуклеиновых кислот при помощи первой и второй регуляторных контрольных систем.

4. Выделенная реципиентная клетка с по меньшей мере двумя целевыми нуклеиновыми кислотами, каждая из которых находится под контролем регуляторной контрольной системы, созданная способом по п. 1.

5. Способ конструирования реципиентной клетки с по меньшей мере двумя целевыми нуклеиновыми кислотами, каждая под контролем регуляторной контрольной системы, где транскрипция второй целевой нуклеиновой кислоты регулируется первым генным продуктом, где способ включает:

трансфицирование реципиентных клеток первой линии компонентами для создания синтетической хромосомы, включая нуклеотидные последовательности, допускающие сайт-специфическую интеграцию целевых нуклеотидных последовательностей;

получение синтетической хромосомы-платформы с множеством сайтов сайт-специфической рекомбинации;

трансфицирование реципиентных клеток первой линии первым вектором доставки, содержащим первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы; при этом генный продукт первой целевой нуклеиновой кислоты регулирует транскрипцию второй целевой нуклеиновой кислоты;

активирование сайт-специфической рекомбинации между синтетической хромосомой-платформой и первым вектором доставки, при этом первая целевая нуклеиновая кислота под контролем первой регуляторной контрольной системы нагружается на синтетическую хромосому-платформу, с получением синтетической хромосомы, экспрессирующей первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы;

выделение второй реципиентной клетки, содержащей синтетическую хромосому, экспрессирующую первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы;

наращивание вторых реципиентных клеток;

трансфицирование вторых реципиентных клеток вторым вектором доставки, содержащим вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы, при этом вторая регуляторная контрольная система регулируется генным продуктом первой целевой нуклеиновой кислоты;

активирование сайт-специфической рекомбинации между синтетической хромосомой-платформой и вторым вектором доставки, при этом вторая целевая нуклеиновая кислота под контролем второй регуляторной контрольной системы нагружается на синтетическую хромосому-платформу, с получением синтетической хромосомы, экспрессирующей первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы и вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы;

выделение третьей реципиентной клетки, содержащей синтетическую хромосому, экспрессирующую первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы и вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы;

индукцию транскрипции первой целевой нуклеиновой кислоты при помощи первой регуляторной контрольной системы, с получением первого генного продукта; и

регулирование транскрипции второй целевой нуклеиновой кислоты при помощи первого генного продукта.

6. Способ по п. 5, где генный продукт первой целевой нуклеиновой кислоты индуцирует транскрипцию второй целевой нуклеиновой кислоты.

7. Способ по п. 5, где генный продукт первой целевой нуклеиновой кислоты подавляет транскрипцию второй целевой нуклеиновой кислоты.

8. Способ по п. 5, где первую регуляторную контрольную систему выбирают из Tet-On, Tet-Off, индуцируемой переключением Lac системы, экдизон-индуцируемой системы, системы переключения генов с использованием кумата или тамоксифен-индуцируемой системы.

9. Выделенная реципиентная клетка с по меньшей мере двумя целевыми нуклеиновыми кислотами, каждая из которых находится под контролем регуляторной контрольной системы, созданная способом по п. 5.

10. Способ конструирования реципиентной клетки с по меньшей мере тремя целевыми нуклеиновыми кислотами, каждая под контролем регуляторной контрольной системы, где транскрипция третьей целевой нуклеиновой кислоты регулируется первым и вторым генными продуктами, где способ включает:

трансфицирование реципиентных клеток первой линии компонентами для создания синтетической хромосомы, включая нуклеотидные последовательности, допускающие сайт-специфическую интеграцию целевых нуклеотидных последовательностей;

получение синтетической хромосомы-платформы с множеством сайтов сайт-специфической рекомбинации;

трансфицирование реципиентных клеток первой линии первым вектором доставки, содержащим первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы, при этом генный продукт первой целевой нуклеиновой кислоты регулирует транскрипцию третьей целевой нуклеиновой кислоты;

активирование сайт-специфической рекомбинации между синтетической хромосомой-платформой и первым вектором доставки, при этом первая целевая нуклеиновая кислота под контролем первой регуляторной контрольной системы нагружается на синтетическую хромосому-платформу, с получением синтетической хромосомы, экспрессирующей первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы;

выделение второй реципиентной клетки, содержащей синтетическую хромосому, экспрессирующую первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы;

наращивание вторых реципиентных клеток;

трансфицирование вторых реципиентных клеток вторым вектором доставки, содержащим вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы, при этом генный продукт второй целевой нуклеиновой кислоты регулирует транскрипцию третьей целевой нуклеиновой кислоты;

активирование сайт-специфической рекомбинации между синтетической хромосомой-платформой и вторым вектором доставки, при этом вторая целевая нуклеиновая кислота под контролем второй регуляторной контрольной системы нагружается на синтетическую хромосому-платформу, с получением синтетической хромосомы, экспрессирующей первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы и вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы;

выделение третьей реципиентной клетки, содержащей синтетическую хромосому, экспрессирующую первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы и вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы;

наращивание третьих реципиентных клеток;

трансфицирование третьих реципиентных клеток третьим вектором доставки, содержащим третью целевую нуклеиновую кислоту под контролем третьей регуляторной контрольной системы, при этом генные продукты первой и второй целевых нуклеиновых кислот регулируют транскрипцию третьей целевой нуклеиновой кислоты при помощи третьей регуляторной контрольной системы;

активирование сайт-специфической рекомбинации между синтетической хромосомой-платформой и третьим вектором доставки, при этом третья целевая нуклеиновая кислота под контролем третьей регуляторной контрольной системы нагружается на синтетическую хромосому-платформу, с получением синтетической хромосомы, экспрессирующей первую целевую нуклеиновую кислоту под контролем первой регуляторной контрольной системы, вторую целевую нуклеиновую кислоту под контролем второй регуляторной контрольной системы и третью целевую нуклеиновую кислоту под контролем третьей регуляторной контрольной системы;

индукцию транскрипции первой и второй целевых нуклеиновых кислот при помощи первой и второй регуляторных контрольных систем, с получением первого и второго генных продуктов; и

регулирование транскрипции третьей целевой нуклеиновой кислоты при помощи первого и второго генных продуктов.

11. Способ по п. 10, где как первый, так и второй, генные продукты необходимы для регулирования транскрипции третьей целевой нуклеиновой кислоты.

12. Способ по п. 10, где либо первый, либо второй, генный продукт регулирует транскрипцию третьей целевой нуклеиновой кислоты.

13. Способ по п. 10, где регуляция третьей целевой нуклеиновой кислоты представляет собой индукцию транскрипции третьей целевой нуклеиновой кислоты.

14. Способ по п. 10, где регуляция третьей целевой нуклеиновой кислоты представляет собой подавление транскрипции третьей целевой нуклеиновой кислоты.

15. Способ по п. 10, где первую и вторую регуляторные контрольные системы выбирают из Tet-On, Tet-Off, индуцируемой переключением Lac системы, экдизон-индуцируемой системы, системы переключения генов с использованием кумата или тамоксифен-индуцируемой системы.

16. Выделенная реципиентная клетка с по меньшей мере двумя целевыми нуклеиновыми кислотами, каждая из которых находится под контролем регуляторной контрольной системы, созданная способом по п. 10.

17. Способ по п. 10, дополнительно включающий выделение четвертой реципиентной клетки, содержащей синтетическую хромосому, содержащую первую, вторую и третью целевые нуклеиновые кислоты.

18. Выделенная реципиентная клетка, содержащая синтетическую хромосому, содержащую первую, вторую и третью целевые нуклеиновые кислоты, созданная способом по п. 17.