Способ рефолдинга рекомбинантных антител - RU2007118954A

Реферат

1. Способ получения препарата IgG-антитела, включающий в себя

взаимодействие очищенного препарата IgG-антитела, которое продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и

необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

2. Способ по п.1, где указанное IgG-антитело выбрано из группы, состоящей из IgG1-, IgG2-, IgG3- и IgG4-антитела или его фрагментов, которые проявляют наличие гетерогенности.

3. Способ по п.1, где указанное IgG-антитело представляет собой IgG2-антитело, которое элюируется в виде нескольких отдельных форм при ОФ-ВЭЖХ, и указанный способ приводит к уменьшению количества форм, элюирующихся при ОФ-ВЭЖХ, или изменяет относительное распределение указанных нескольких отдельных форм при указанной ОФ-ВЭЖХ.

4. Способ по п.3, где указанный способ предпочтительно способствует повышению по данным ОФ-ВЭЖХ, содержания по меньшей мере одной из указанных нескольких отдельных форм в указанном препарате.

5. Способ по п.4, где указанная предпочтительно обогащенная форма обладает фармацевтически желаемым свойством по сравнению с препаратом, который не был подвергнут обработке указанным способом.

6. Способ по п.1, где указанное IgG-антитело представляет собой рекомбинантное IgG1-антитело, содержащее по меньшей мере один свободный остаток цистеина, или фрагмент рекомбинантного IgG1-антитела, содержащий по меньшей мере один свободный остаток цистеина.

7. Способ по п.6, где указанный способ не включает в себя взаимодействия указанного препарата с хаотропным агентом.

8. Способ по п.1, где указанное IgG-антитело представляет собой IgG4-антитело, и указанный способ способствует снижению образования полумолекул IgG4.

9. Способ по п.1, где рН указанного связующего окислительно-восстановительного реагента составляет примерно от 5 до примерно 10.

10. Способ по п.1, где рН указанного связующего окислительно-восстановительного реагента составляет примерно от 7,6 до примерно 9,6.

11. Способ по п.1, где рН указанного связующего окислительно-восстановительного реагента составляет примерно 8,6.

12. Способ по п.1, где связующий окислительно-восстановительный реагент содержит восстановленный глутатион и окисленный глутатион.

13. Способ по п.12, где отношение восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону составляет примерно от 1:1 до примерно 100:1.

14. Способ по п.1, где связующий окислительно-восстановительный реагент содержит цистеин/цистин.

15. Способ по п.14, где [смесь] цистеин/цистин содержит примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистеина.

16. Способ по п.1, где связующий окислительно-восстановительный реагент содержит примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистина, и экзогенный цистеин не добавляют.

17. Способ по п.14, где [смесь] цистеин/цистин присутствует в соотношении цистеин/цистин в пределах примерно от 1:1 до примерно 10:1.

18. Способ по п.14, где [смесь] цистеин/цистин содержит примерно 6 мМ цистеина и примерно 1 мМ цистина.

19. Способ по п.14, где [смесь] цистеин/цистин содержит примерно 6 мМ цистеина и примерно 6 мМ цистамина.

20. Способ по п.14, где стадию взаимодействия проводят по меньшей мере в течение 30 мин.

21. Способ по п.20, где стадию взаимодействия проводят в течение примерно от 4 ч до примерно 48 ч.

22. Способ по п.1, где указанное рекомбинантное IgG-антитело очищают до указанного взаимодействия.

23. Способ по п.1, где указанное рекомбинантное IgG-антитело частично очищают перед указанным взаимодействием.

24. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя взаимодействие подвергнутого взаимодействию рекомбинантного IgG-антитела с дополнительной композицией, содержащей второй связующий окислительно-восстановительный реагент.

25. Способ по п.1, где перед указанным способом указанное IgG-антитело выделяют из культуральной среды клеток млекопитающего в способе, включающем в себя культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду IgG-антитело или фрагмент IgG-антитела; добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, и необязательно содержит хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки.

26. Способ по пп.1 и 25, где очистка включает в себя одну или более стадий хроматографии.

27. Способ по п.1, где концентрация рекомбинантного IgG-антитела составляет примерно от 1 мг/мл до примерно 50 мг/мл.

28. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование IgG-антитела, которое является более стабильным при хранении по сравнению с тем же самым IgG-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.

29. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование IgG-антитела, которое является более термостабильным по сравнению с тем же самым IgG-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.

30. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование IgG-антитела, которое обладает повышенной способностью к кристаллизации по сравнению с тем же самым IgG-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.

31. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование популяции IgG-антител, которая является более гомогенной по сравнению с тем же самым IgG-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.

32. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование IgG-антитела по меньшей мере с двукратно повышенной биологической активностью по сравнению с тем же самым IgG-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.

33. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя взаимодействие указанного IgG-антитела с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

34. Способ по п.33, где указанный хаотропный агент выбран из группы, состоящей из мочевины, аргинина, додецилсульфата натрия и гуанидингидрохлорида.

35. Способ по п.34, где указанный хаотропный агент содержит гуанидингидрохлорид.

36. Способ по п.35, где концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно от 0,1 М до примерно 1,5 М.

37. Способ по п.35, где концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно от 0,1 М до примерно 1 М.

38. Способ по п.35, где концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно 0,5 М.

39. Способ по п.35, где концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно 0,9 М.

40. Способ по п.33, где указанное взаимодействие с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом и указанное дополнительное взаимодействие с указанным хаотропным агентом обеспечивает продуцирование IgG-антитела по меньшей мере с трехкратно повышенной биологической активностью по сравнению с тем же самым IgG-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.

41. Способ по п.1 или 33, дополнительно включающий в себя помещение IgG-антитела, полученного указанным способом, в стерильную объемную форму.

42. Способ по п.1 или 33, дополнительно включающий в себя помещение IgG-антитела, полученного указанным способом, в стерильную разовую лекарственную форму.

43. Способ по п.1 или 33, дополнительно включающий в себя выделение фракции подвергшегося взаимодействию IgG-антитела, обладающего желаемой конформацией после рефолдинга.

44. Способ по п.43, где метод указанного выделения выбран из группы, состоящей из обращеннофазовой ВЭЖХ, эксклюзионной гель-хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, аффинной хроматографии и электрофореза.

45. Способ по п.43, где методом указанного выделения является ионообменная хроматография.

46. Препарат IgG-антитела, полученного способом по п.1 или 33, где указанный препарат содержит гомогенную популяцию указанного IgG-антитела.

47. Препарат по п.46, дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

48. Композиция, содержащая гомогенную популяцию рекомбинантного IgG-антитела и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.

49. Композиция по п.48, где указанное рекомбинантное IgG-антитело представляет собой IgG1-антитело.

50. Композиция по п.48, где указанное рекомбинантное IgG-антитело представляет собой IgG2-антитело.

51. Композиция по п.48, где указанное рекомбинантное IgG-антитело представляет собой IgG4-антитело.

52. Способ лечения субъекта, нуждающегося в IgG, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества гомогенной популяции IgG по любому из пп.49-51.

53. Способ по п.52, где указанное введение является подкожным или внутривенным введением.

54. Способ детектирования или мониторинга качества рекомбинантного IgG-антитела в процессе его производства, составления в композицию и/или хранения, включающий в себя

а) взаимодействие препарата указанного IgG, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11, и необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом;

b) расщепление молекулы IgG, которая была обработана на стадии а), на фрагменты; и

с) проведение хроматографического анализа интактного IgG и/или его фрагментов со стадии b), тем самым детектирования или мониторинга качества указанной молекулы IgG.

55. Способ по п.54, где указанное IgG-антитело представляет собой IgG1-антитело, а указанный мониторинг качества включает в себя мониторинг статуса свободного или непарного цистеина в указанном IgG1-антителе.

56. Способ по п.54, где указанное IgG-антитело представляет собой IgG2-антитело, а указанный мониторинг качества включает в себя мониторинг числа форм указанного IgG2 с целью определения гетерогенности препарата.

57. Способ по п.54, где указанная молекула IgG представляет собой молекулу IgG4, а указанный мониторинг качества включает в себя мониторинг присутствия полумолекул IgG4.

58. Способ по п.54, где хроматография включает в себя анализ ЖХ/МС.

59. Способ по п.54, где детектирование или мониторинг проводят во время стадии очистки молекулы IgG, где указанная очистка включает в себя колоночную хроматографию.

60. Способ получения рекомбинантного IgG-антитела или фрагмента IgG-антитела, включающий в себя

взаимодействие IgG-антитела или фрагмента IgG-антитела, которое было продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и необязательно

дополнительное взаимодействие указанного IgG-антитела или фрагмента IgG-антитела с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

61. Способ по п.60, где перед указанным способом указанное IgG-антитело или фрагмент IgG-антитела выделяют из культуральной среды клеток млекопитающего в способе, включающем в себя культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду IgG-антитело или фрагмент IgG-антитела; добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, и необязательно содержит хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки.

62. Способ по п.60, где указанное рекомбинантное IgG-антитело представляет собой IgG1.

63. Способ по п.60, где указанное рекомбинантное IgG-антитело представляет собой IgG2.

64. Способ по п.60, где указанное рекомбинантное IgG-антитело представляет собой IgG4.

65. Способ получения кристаллической формы интактного рекомбинантного IgG-антитела, включающий в себя осуществление способа по п.1 или 60;

и получение кристаллической формы указанного рекомбинантного IgG-антитела.

66. Способ по п.65, дополнительно включающий в себя выделение рекомбинантного IgG-антитела, полученного по п.1 или 60, до кристаллизации указанного антитела.

67. Способ по п.1, где указанное рекомбинантное IgG-антитело присоединено к стационарной фазе хроматографической колонки, и редокс-реагенты и хаотропные реагенты являются частью подвижной фазы.

68. Способ по п.1, где указанный связующий окислительно-восстановительный реагент является ферментом.

69. Способ по п.1, где указанный связующий окислительно-восстановительный реагент включает в себя ионы двухвалентного металла и кислород.

70. Способ получения препарата IgG-антитела, включающий в себя

взаимодействие выделенного препарата IgG-антитела, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и

необязательно дополнительную денатурацию препарата под действием высокого давления до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

71. Способ получения IgG-антитела или его фрагмента, включающий в себя

культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду IgG-антитело или фрагмент IgG-антитела;

добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, и необязательно содержит хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки; и тем самым получения IgG-антитела или его фрагмента, обладающих улучшенными фармацевтическими и кристаллизационными свойствами по сравнению с IgG-антителом или его фрагментом, которые не подвергались воздействию указанного связующего окислительно-восстановительного реагента и необязательно хаотропного агента.

72. В способе получения рекомбинантного IgG-антитела или фрагмента рекомбинантного IgG-антитела на основе клеток млекопитающего усовершенствование, включающее в себя добавление в культуральную среду, используемую для продуцирования указанного IgG-антитела или указанного фрагмента IgG-антитела, связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, и необязательно хаотропного агента при секреции указанного IgG-антитела или указанного фрагмента IgG-антитела в указанную среду.

73. Композиция, содержащая гомогенную популяцию антитела и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель, где указанное антитело имеет аминокислотную последовательность, идентичную последовательности 146В7.

74. Композиция по п.73, где по меньшей мере 90% указанного антитела имеет правильную пространственную упаковку (фолдинг) по данным ограниченного протеолиза при участии Lys-C-протеазы.

75. Композиция по п.74, где по меньшей мере 90% указанного антитела не цистеинилировано.

76. Композиция по п.73, где указанное антитело представляет собой кристаллизованное антитело.

77. Способ получения препарата IgG1-антитела, включающий в себя

взаимодействие очищенного препарата IgG1-антитела, которое продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и

необязательно дополнительное взаимодействие указанного

препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

78. Препарат IgG1-антитела, полученный способом по п.1 или 33, где указанный препарат содержит гомогенную популяцию указанного IgG1-антитела.

79. Способ лечения субъекта, нуждающегося в IgG1, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества гомогенной популяции IgG1 по любому из пп.49-51.

80. Способ детектирования или мониторинга качества рекомбинантного IgG1-антитела в процессе его производства, составления в композицию и/или хранения, включающий в себя

а) взаимодействие препарата указанного IgG1, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11, и необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом;

b) расщепление молекулы IgG1, которая была обработана на стадии а), на фрагменты; и

с) проведение хроматографического анализа интактного IgG1 и/или его фрагментов со стадии b), тем самым детектирования или мониторинга статуса свободного или непарного цистеина указанного IgG1-антитела.

81. Способ получения рекомбинантного IgG1-антитела или фрагмента IgG1-антитела, включающий в себя

взаимодействие IgG1-антитела или фрагмента IgG1-антитела,

которое было продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и необязательно

дополнительное взаимодействие указанного IgG1-антитела или фрагмента IgG1-антитела с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

82. Способ получения кристаллизованной формы интактного рекомбинантного IgG1-антитела, включающий в себя осуществление способа по п.1 или 60;

и получение кристаллизованной формы указанного рекомбинантного IgG1-антитела.

83. Способ получения препарата IgG1-антитела, включающий в себя

взаимодействие выделенного препарата IgG1-антитела, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и

необязательно дополнительную денатурацию указанного препарата под действием высокого давления до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

84. Способ получения IgG1-антитела или его фрагмента, включающий в себя

культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду IgG1-антитело или фрагмент IgG1-антитела;

добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, и необязательно содержит хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки; и, тем самым, получения IgG1-антитела или его фрагмента, обладающих улучшенными фармацевтическими и кристаллизационными свойствами по сравнению с IgG1-антителом или его фрагментом, которые не подвергались воздействию указанного связующего окислительно-восстановительного реагента и необязательно хаотропного агента.

85. Способ получения препарата IgG2-антитела, включающий в себя

взаимодействие очищенного препарата IgG2-антитела, которое было продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и

необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

86. Препарат IgG2-антитела, полученный способом по п.1 или 33, где указанный препарат содержит гомогенную популяцию указанного IgG2-антитела.

87. Способ лечения субъекта, нуждающегося в IgG2, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества гомогенной популяции IgG2 по любому из пп.49-51.

88. Способ детектирования или мониторинга качества рекомбинантного IgG2-антитела во время его производства,

составления композиции и/или хранения, включающий в себя

а) взаимодействие препарата указанного IgG2, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11, и необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом;

b) расщепление молекулы IgG2, которая была обработана на стадии а), на фрагменты; и

с) проведение хроматографического анализа интактного IgG2 и/или его фрагментов со стадии b), тем самым детектирования или мониторинга числа форм указанного IgG2 в целях определения гетерогенности препарата.

89. Способ получения рекомбинантного IgG2-антитела или фрагмента IgG2-антитела, включающий в себя

взаимодействие IgG2-антитела или фрагмента IgG2-антитела, которое было продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и необязательно

дополнительное взаимодействие указанного IgG2-антитела или фрагмента IgG2-антитела с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

90. Способ получения кристаллизованной формы интактного рекомбинантного IgG2-антитела, включающий в себя осуществление способа по п.1 или 60;

и получение кристаллизованной формы указанного рекомбинантного IgG2-антитела.

91. Способ получения препарата IgG2-антитела, включающий в себя

взаимодействие выделенного препарата IgG2-антитела, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и

необязательно дополнительную денатурацию препарата под действием высокого давления до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.

92. Способ получения IgG2-антитела или его фрагмента, включающий в себя

культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду IgG2-антитело или фрагмент IgG2-антитела;

добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, и необязательно содержит хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки; и, тем самым, получения IgG2-антитела или его фрагмента, обладающих улучшенными фармацевтическими и кристаллизационными свойствами по сравнению с IgG2-антителом или его фрагментом, которые не подвергались воздействию указанного связующего окислительно-восстановительного реагента и необязательно хаотропного агента.