Иммунотерапия злокачественных заболеваний в-клеток и аутоиммунных заболеваний с применением конъюгированных и неконъюгированных антител, комбинаций антител и слитых белков - RU2335297C2

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическому способу лечения злокачественных заболеваний, связанных с B-клетками, в частности к способу лечения агрессивных лимфом, которые не являются лимфомами Ходжкина (неходжкинские лимфомы). В частности, данное изобретение направлено на разработку способов лечения и диагностики заболеваний, связанных с B-клетками, заболеваний, связанных с T-клетками, или аутоиммунных заболеваний у млекопитающих путем введения млекопитающим терапевтических композиций, для которых не осуществляется предварительное введение дозы антитела, не меченного радиоактивной меткой.

Уровень техники

B-клеточные лимфомы экспрессируют поверхностные антигены, которые, как было показано, являются хорошими мишенями для терапии моноклональными антителами (Mab). Антитела, либо применяемые сами по себе (простые антитела), либо в сочетании с химиотерапией, могут быть конъюгированы с токсинами или с радионуклидами для радиоиммунотерапии (RAIT). Антитело, меченное радиоактивной меткой, вводят после (Kaminski M.S. et al., J. Clin. Oncol.19: 3918-3928, 2001) или совместно (Press O.W. et al., New Engl. J. Med. 329: 1219-24, 1993) с немеченым антителом для улучшения распределения вводимой дозы. Большинство исследователей используют радиоактивно меченное антитело мыши в сочетании с немеченым антителом, которое является мышиным или химерным (гибридным). С точки зрения токсикологии считалось выгодным метить радиоактивной меткой мышиное антитело из-за меньшего периода его полувыведения по сравнению с химерным антителом. Моноклональное антитело с более продолжительным периодом полувыведения дает более длительное время пребывания радиоактивного иммуноконъюгата в крови и костном мозге и, вероятно, таким образом, порождает большую токсичность. Поскольку антитело само по себе почти не вызывает токсичности, немеченые антитела как мышиное, так и химерное, используют для улучшения распределения дозы, как утверждается, за счет насыщающего антигена на нормальных клетках и тканях тела (cf. Kaminski, US Patent No. 5595721; Wiseman et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39: 181-194, 2001).

Применение моноклональных антител в целевой радиотерапии раковых заболеваний (радиоиммунотерапия; RAIT) привело к замечательным клиническим результатам в случае гематологических заболеваний, таких как неходжкинская лимфома (NHL). В настоящее время в попытках минимизации системной токсичности циркулирующих радионуклидов и активации опухолей к действию радиации проверяются новые стратегии. Первая из упомянутых задач решается за счет предварительного нацеливания, а вторая путем комбинированной терапии с использованием лекарственных средств для повышения чувствительности к действию радиоактивного излучения. См. Govindan, S.V et al., Current Trends, Pharmaceutical Science and Technology Today3: 90-98, 2000.

Противоопухолевая активность RAIT имеет место в основном благодаря сопутствующей радиоактивности присоединенной к антителу радиоактивной метки, которая испускает непрерывные, экспоненциально уменьшающиеся порции излучения низкой интенсивности при внесении дозы извне. Четыре продукта, содержащие радиоактивно меченные антитела, были доведены до состояния коммерческих препаратов для применения в радиоиммунотерапии NHL. Эти препараты включают в себя¹³¹I-тозитумомаб (Bexxar™),⁹⁰Y-ибритумомаб тиуксетан (Zevalin™),⁹⁰Y-эпратузумаб (hLL2) и¹³¹I-Lym-1. Более подробный обзор указанных продуктов см. Goldenberg D.M., Critical Reviews in Oncology/Hematology39: 195-201, 2001, и Goldenberg D.M., J. Nucl. Med. 43: 693-713, 2002.

Как Bexxar (Corixa Corp., Seattle, WA), так и Zevalin (IDEC-Y2B8; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA) являются мышиными моноклональными антителами (Mab), направленными против антигена CD20, который экспрессируется на поверхности нормальных и злокачественных B-лимфоцитов. Bexxar применяется как мышиное моноклональное антитело IgG2a с добавлением «холодного» (не содержащего радиоактивных веществ) мышиного антитела, тогда как Zevalin содержит меченое мышиное антитело, а также добавленный к продукту холодный человеческий/мышиный химерный ритуксимаб (Rituxan™, IDEC-Genentech). Для улучшения нацеливания на опухоль оба продукта предусматривают предварительную терапию дозированным холодным антителом, которая включает в себя 1-ч вливание 450 мг немеченого антитела Bexxar и 4-6 ч вливание 450 мг ритуксимаба с Zevalin. Оба продукта вызывают более высокую и более продолжительную ответную реакцию по сравнению с простыми антителами, но, помимо этого, они обладают ограничивающей дозу токсичностью, преимущественно миелотоксичностью. Zevalin был утвержден Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами (FDA) для лечения рецидивирующей низкоуровневой или измененной B-клеточной неходжкинской лимфомы. Радиоактивно меченному анти-CD-20-моноклональному антителу должна предшествовать доза холодных антител, чтобы оптимизировать локализацию на опухоли. Фактически в случае введения предварительной дозы характерные числа локализации для поглощения Zevalin¹¹¹индий отдельными участками опухоли падают с 78% до 15% (Wiseman et al., ibid).

Эпратузумаб (⁹⁰Y-эпратузумаб) представляет собой гуманизированное антитело IgG₁, направленное против анти-CD22-антигена. Антиген быстро интернализуется при связывании антитела. Сообщалось, что простое антитело эффективно как при фолликулярной, так и при значительной диффузной B-клеточной лимфоме (Leonard J.P. et al., Epratuzumab (hLL2, anti-CD22 humanized monoclonal antibody) is an active and well-tolerated therapy for refractory/relapsed diffuse large B-cell non-Hodgkin's lymphoma (NHL), Blood (Suppl) 96:578a [abstr. 2482], 2000; Press O.W. et al., Immunotherapy of Non-Hodgkin's Lymphomas, Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program), p. 221-40, 2001). Не ожидается, что эпратузумаб вызывает увеличение количества человеческих антител против человеческих антител (HAHA), что делает его пригодным для повторного дозирования. Исходные мышиные антитела mLL2 помечены¹³¹I, причем они эффективны в отношении разнообразных подтипов B-клеточных лимфом (Linden O. et al. Clin. Cancer Res.5:3287s-3291s, 1999). После интернализации антитело, меченное¹³¹I, дегалогенируется, и радионуклид выделяется из клетки. Радиоактивные металлы, такие как иттрий, удерживаются в клетке при интернализации (Sharkey R.M., et al. Cancer Immunol. Immunother.44:179-88, 1997). Более короткий физический период полураспада⁹⁰Y в определенной степени компенсирует более длинный период полувыведения эпратузумаба и обеспечивает целесообразность их сочетания.

RAIT, как правило, назначают в виде единичного вливания. Однако у подхода, связанного с разделением радиоиммунотерапии на несколько порций, существуют теоретические преимущества, т.к. разделение улучшает ситуацию с неоднородностью поглощенной дозы, как подчеркнуто в O'Donoghue J.A., Dosimetric Principles of Targeted Radiotherapy, в Radioimmunotherapy of Cancer, A.R. Fritzberg (ed.), Marcel Dekker, Inc., 1-20, New-York, Basel, 2000. Помимо этого, существуют экспериментальные данные, подтверждающие, что терапевтический эффект может быть улучшен путем разделения большого однократного введения меченого антитела на ряд более мелких введений (Schlom J. et al. J. Natl. Cancer Inst.82:763-71, 1990). Подходы, включающие в себя два вливания, а также многократные вливания, были изучены клинически с использованием мышиных антител (DeNardo G.L., et al. Cancer Biother. Radiopharm.13:239-54, 1998; Vose J.M., et al. J. Clin. Oncol.18:1316-23, 2000).

Сообщалось о внутриопухолевой изменчивости в отношении экспрессии антигена CD22. Было найдено, что в свежих образцах опухолей пяти пациентов 52-89% клеток лимфомы содержат антиген для анти-CD22-Mab HD6 (Press O.W. et al. Cancer Res. 49:4906-12, 1989). Одно из заявленных преимуществ радиоиммунотерапии с использованием источников β-излучения с широким диапазоном заключается в их способности убивать антиген-отрицательные клетки опухоли, которые находятся в непосредственной близости от целевых клеток. Путем определения величины экспрессии антигена клетками опухоли перед проведением терапии можно изучить клиническую актуальность данной концепции при назначении радиоиммунотерапии с применением⁹⁰Y-меченного эпратузумаба против CD22.

Для подтверждения теоретических преимуществ разделения дозы на порции были предприняты исследования и опубликованы экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу этого. Данные исследования были направлены на изучение осуществимости разделенной на порции радиоиммунотерапии с использованием радиоактивно меченного гуманизированного антитела. Было найдено, что после предварительного приема 100 мг гуманизированного Mab CD22, т.е. эпратузумаба, меченного¹¹¹In для дозиметрических целей, последующие разделенные на порции дозы эпратузумаба, меченного⁹⁰Y, при величине каждой порции до 7,5 мКи/м², раз в неделю в течение периода до 2-3 недель приводят к приемлемой и эффективной радиоиммунотерапии (Linden et al., Cancer Biother Radiopharm 2002; 17:490 [abstract 47]). Хотя эти клинические исследования и предполагают, что разделенная на порции терапия радиоиммуноконъюгатов осуществима, однако не было проведено сравнение с введением высокой однократной дозы радиоиммуноконъюгата с точки зрения безопасности и эффективности. Поскольку первая «дозиметрическая» доза с¹¹¹In содержала 100 мг антитела и каждая последующая инъекция также содержала дозу этого простого антитела, то также было невозможно определить, не вызывают ли эти дозы, при общем количестве эпратузумаба не менее 300 мг, эффект предварительного введения дозы, как предполагалось в других цитированных исследованиях, включающих антитела CD20. Следовательно, из данных исследований невозможно было понять, является ли необходимым для подобной радиоиммунотерапии любое введение предварительной дозы, в особенности с антителами CD22.

В настоящем изобретении в противоположность другим опубликованным исследованиям и патенту Каминского (Патент Соединенных Штатов № 5595721), было обнаружено, что есть возможность не применять введение предварительной дозы для насыщения антигенных участков нормальных тканей и селезенки, как это делалось в предыдущей технике. Конкретно описанное здесь изобретение показывает, что нет необходимости во введении высокой предварительной дозы антитела, как это было принято в предыдущем уровне техники.

Сущность изобретения

Соответственно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы разработать способы лечения заболеваний у млекопитающих путем введения терапевтической композиции, для которой не осуществляется предварительное введение не меченного радиоактивной меткой антитела, фрагмента или слитого белка.

Помимо этого, цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы сделать упомянутые выше композиции не только простыми и легкими для применения, но к тому же сделать так, чтобы они сами по себе оставались терапевтически активными и имели сходную степень эффективности, не имея в своем составе высоких доз простых антител, воздействующих на опухоль.

Еще одной целью изобретения является разработка способов, которые более эффективны в лечении агрессивной неходжкинской лимфомы, в противоположность предыдущей технике, которая давала результаты только для неактивных форм лимфомы.

Эти и другие цели настоящего изобретения достигнуты в соответствии со способом реализации настоящего изобретения путем предоставления способа лечения заболевания у млекопитающих, включающего в себя одновременное или последовательное введение млекопитающим терапевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и, по меньшей мере, одно конъюгированное антитело или его фрагмент, или слитый белок конъюгированного антитела или его фрагмент, и при этом не осуществляется введение предварительной дозы не меченных радиоактивной меткой антитела, фрагмента или слитого белка. Неконъюгированное антитело, фрагмент или слитый белок необязательно добавляют к конъюгированному антителу, фрагменту или слитому белку в качестве поддерживающей терапии для того, чтобы опухолевым клеткам не удалось избежать роли мишени для основной терапии.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на способ лечения таких заболеваний, как злокачественные заболевания, связанные с B-клетками. Кроме этого упомянутый способ пригоден для лечения аутоиммунных заболеваний, а также злокачественных заболеваний, связанных с T-клетками.

В другом предпочтительном варианте осуществления конъюгированные и неконъюгированные антитела, фрагменты и слитые белки согласно изобретению могут быть нацелены на антиген, выбранный из группы, состоящей из CD3, CD4, CD5, CD8, CD11c, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, Ia, HMI.24, HLA-DR, тенасцина, MUC1 и антигенов, ассоциированных с опухолями B-клеток, включая антигены сосудистого эндотелия, такие как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и плацентарный фактор роста (PIGF). В смежных воплощениях конъюгированные и/или неконъюгированные антитела, фрагменты или слитые белки согласно изобретению могут быть одинаковыми или различными. Такие антитела могут быть также человеческими, мышиными, химерными, приматизированными или гуманизированными. Более того, эти антитела, фрагменты или слитые белки могут быть выбраны из группы, состоящей из интактных IgG, F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, scFvs, диантител, триантител или тетраантител и могут сочетаться, по меньшей мере, с одним терапевтическим средством.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, как описано выше, предложен способ, согласно которому пациенты из числа млекопитающих, таких как человек, а также домашние или сопутствующие человеку животные, подвергаются лечению одним или несколькими антителами, сопряженными с одним или несколькими терапевтическими средствами, выбранными из группы, состоящей из лекарственного средства, токсина, иммуномодулятора, хелатообразователя, соединений бора, фотодинамического агента и радионуклидов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления терапевтическая композиция содержит слитый белок или упомянутое сочетание антител или антител с иммуномодуляторами. Объединенные антитела могут включать в себя антитела против различных антигенов, а также антитела против различных эпитопов одного и того же антигена.

Настоящее изобретение предполагает упомянутый выше способ, в котором конъюгированное или неконъюгированное антитело представляет собой моноклональное антитело против CD22, которое вводят млекопитающему парентерально при предпочтительной дозировке 20-600 миллиграммов белка на дозу, более предпочтительно 20-150 миллиграммов белка на дозу и наиболее предпочтительно 20-100 миллиграммов белка на дозу. Дополнительно млекопитающее может получать антитело против CD22 в виде повторного парентерального введения предпочтительно 20-150 миллиграммов белка на дозу и более предпочтительно 20-100 мг белка на дозу. Важно осознавать, что такие дозы даются в качестве действующих терапевтических доз, и не требуется какого бы то ни было введения предварительной дозы как с целью улучшения нацеливания на опухоль, так и для дозиметрических целей, как это делалось ранее, например, Juweid et al., Clin. Cancer Res. 5:3292s-3303s, 1999 (где требовалась предварительная доза 50 мг CD22-Mab, сопряженного с¹¹¹In или другим диагностическим изотопом). В этих исследованиях не было предпринято попыток добиться того, чтобы радиоиммуноконъюгат с различными белковыми дозами антитела был эффективен непосредственно, без режима введения предварительной дозы.

В другом предпочтительном варианте осуществления способ лечения заболевания млекопитающих включает в себя введение млекопитающему терапевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и полиспецифическое поливалентное антитело, фрагмент или конъюгат слитого белка, который связывается, по меньшей мере, с одним целевым антигеном, а также терапевтическое средство, причем не осуществляется предварительное введение дозы антитела, не меченного радиоактивной меткой.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления способ лечения заболевания млекопитающих включает в себя

(a) введение млекопитающему композиции, которая содержит полиспецифическое поливалентное антитело, фрагмент или слитый белок, который связывается, по меньшей мере, с одним целевым антигеном;

(b) необязательно применение очищающего средства, чтобы дать возможность композиции вывести из циркуляции нелокализованные антитела; и

(c) введение млекопитающему фармацевтически эффективного количества терапевтического конъюгата, который связывается с полиспецифическим поливалентным антителом, фрагментом или слитым белком

и при этом не осуществляется предварительное введение дозы антитела, не меченного радиоактивной меткой.

Прочие цели, отличительные особенности и преимущества настоящего изобретения станут ясны из следующего подробного описания и приложенной формулы изобретения.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Если не указано иначе, употребление единственного числа означает «один или более».

1. Определения

В следующем ниже описании используется ряд терминов, причем приведенные ниже определения призваны облегчить понимание настоящего изобретения.

Термин неходжкинская лимфома (NHL) относится к семейству заболеваний, которое включает в себя лимфомы лимфатических узлов, селезенки, других органов и часто костного мозга. Существует, по меньшей мере, 30 различных типов NHL. Два общих типа представляют собой фолликулярную лимфому (низкой степени или неактивную) и агрессивную, диффузную, крупноклеточную лимфому (промежуточной или высокой степени).

Термин антитело в рамках настоящего изобретения относится к полноразмерной (т.е. появившейся естественным путем или образовавшейся в результате процесса рекомбинации фрагмента нормального гена иммуноглобулина) молекуле иммуноглобулина (например, антителу IgG) или к части молекулы иммуноглобулина, проявляющей иммуноглобулиновую активность, такой как фрагмент антитела.

Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, такую как F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, sFv и т.п. Независимо от структуры фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который опознается интактным антителом. Например, фрагмент анти-CD22-моноклонального антитела связывается с эпитопом CD22. Термин «фрагмент антитела» включает в себя также любой синтетический белок или белок, полученный с помощью генной инженерии, который действует как антитело при связывании со специфическим антигеном для формирования комплекса. Например, фрагменты антитела включают в себя выделенные фрагменты, состоящие из вариабельных областей, такие как фрагменты «Fv», состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей молекул рекомбинантных одноцепочечных полипептидов, в которых тяжелые и легкие вариабельные области связаны пептидным линкером («белки scFv»), а также минимальные опознающие фрагменты, состоящие из остатков аминокислот, которые имитируют гипервариабельную область.

Простое или холодное антитело в общем представляет собой целостное антитело, которое не сопряжено (не конъюгировано) с терапевтическим средством. Это происходит потому, что Fc-часть молекулы антитела обеспечивает такие функции эффектора, как связывание комплемента и ADCC (зависимая от антител клеточная цитотоксичность), т.е. функции, запускающие механизмы, которые могут приводить к лизису клеток. Однако возможно, что Fc-часть не потребуется для реализации терапевтической функции с приведением в действие других механизмов, таких как апоптоз. Кроме этого простые антитела представляют собой антитела, не меченные радиоактивной меткой, которые подразумевают как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также определенные рекомбинантные антитела, такие как приматизированные антитела, химерные, гуманизированные или человеческие антитела.

Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит вариабельные области, включая участки, определяющие комплементарность (CDR) антитела, характерного для одного вида живых существ, предпочтительно антитела грызунов, в то время как константные области молекулы антитела являются производными соответствующих областей человеческого антитела. Для применения в ветеринарии константные области химерного антитела могут происходить из антител других видов животных, таких как кошка или собака.

Гуманизированное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором CDR из антитела одних видов, например, антитела грызунов, перенесено из тяжелой и легкой вариабельных цепей антитела грызунов в тяжелые и легкие вариабельные области человеческого антитела. Константные области молекулы антитела происходят из константных областей человеческого антитела.

Человеческое антитело представляет собой антитело, полученное из трансгенных мышей, которые были «спроектированы», для получения специфических антител человека в качестве ответа на введение антигенов. В этой методике элементы расположения тяжелой и легкой цепей человека введены в линию мышей, полученную из линий эмбриональных клеток, которые содержат целевое нарушение местоположений тяжелой и легкой цепей. Трансгенные мыши могут синтезировать человеческие антитела, специфичные для человеческих антигенов, и эти мыши могут быть использованы для получения гибридом, секретирующих человеческие антитела. Способы получения человеческих антител из трансгенных мышей описаны Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature368:856 (1994) и Taylor et al., Int. Immun.6:579 (1994). Кроме этого полностью человеческое антитело может быть сконструировано способами генной или хромосомной трансфекции, а также с помощью технологии фагового дисплея, причем все эти способы известны в технике. См., например, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990) для ознакомления с получением человеческих антител и их фрагментов in vitro из набора вариабельных областей иммуноглобулина неиммунизированных доноров. В данной методике гены вариабельных доменов антител клонируют в каркасе внутри либо мажорного, либо минорного гена покровного белка нитевидного бактериофага, и выводят на поверхность частицы фага в виде функциональных фрагментов антител. Поскольку нитевидные частицы содержат копию ДНК генома фага, состоящую из одной цепи, отбор, основанный на функциональных свойствах антитела, также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, которое проявляет те же свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств B-клетки. Способ фагового дисплея может быть реализован в различных форматах, обзор этих форматов, см., например, Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology3:5564-571 (1993).

Человеческие антитела также могут вырабатываться активированными B-клетками in vitro. См. патенты Соединенных Штатов №№ 5567610 и 5229275, которые во всей полноте включены в настоящую заявку с помощью ссылки.

Терапевтическое средство представляет собой молекулу или атом, которые вводят отдельно, одновременно или последовательно с фрагментом антитела, или же терапевтическое средство конъюгировано с фрагментом антитела, т.е. антителом или фрагментом антитела, или субфрагментом антитела, причем терапевтическое средство применимо для лечения заболевания. Примеры терапевтических средств включают антитела, фрагменты антител, лекарственные препараты, токсины, нуклеазы, гормоны, иммуномодуляторы, хелатообразователи, соединения бора, фотоактивные агенты или красители и радиоактивные изотопы.

Иммуномодулятор представляет собой терапевтическое средство в соответствии с тем, как это определено в настоящем изобретении, которое своим присутствием изменяет, подавляет или стимулирует иммунную систему организма. Как правило, иммуномодулятор, применимый в настоящем изобретении, такой как макрофаги, B-клетки и/или T-клетки, стимулирует размножение иммунных клеток или становится активным в последовательном механизме иммунного ответа.

Иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитела с терапевтическим или диагностическим средством. Диагностическое средство может включать в себя радиоактивную или нерадиоактивную метку и контрастное средство (как например, для создания изображений в магнитном резонансе, компьютерной томографии или ультразвуковой технике), причем радиоактивная метка может быть изотопом, испускающим гамма-, бета-, альфа-излучение, Аугеровские электроны или позитроны.

Вектор экспрессии представляет собой молекулу ДНК, содержащую ген, который экспрессируется в клетке-хозяине. Как правило, экспрессия гена происходит под управлением определенных регуляторных элементов, включая конститутивные или индуцируемые промоторы, тканеспецифические регуляторные элементы и энхансеры. Про такие гены говорят, что они являются «функционально связанными» с регуляторными элементами.

Рекомбинантный хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой, которая содержит либо вектор клонирования, либо вектор экспрессии. Помимо этого, данный термин включает в себя такие прокариотические или эукариотические клетки, а также трансгенных животных, которые были созданы с помощью генной инженерии, с тем, чтобы в их хромосомах или геноме содержался клонированный ген (гены) хозяйской клетки или клеток клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают в себя клетки миеломы, такие как клетки SP2/0 и клетки NSO, а также клетки яичника китайского хомячка (CHO), линии клеток гибридомы и другие клетки-хозяева млекопитающих, применимые для экспрессирования антител. Для экспрессирования Mab и других слитых белков частично применима человеческая линия клеток PER.C6, описанная в WO 0063403 A2, которая вырабатывает рекомбинантные белки в количестве от 2 до 200 раз большем, чем обычные линии клеток млекопитающих, такие как линии клеток CHO, COS, Vero, Hela, BHK и SP2. Специальные трансгенные животные с измененной иммунной системой особенно применимы для получения полностью человеческих антител.

В рамках настоящего изобретения термин слитый белок антитела представляет собой рекомбинантно полученную связывающую антиген молекулу, в которой соединены два или несколько одинаковых или различных одноцепочечных антител или сегментов фрагментов антител с одинаковой или различной специфичностью. Валентность слитого белка показывает, каким количеством связывающих плеч или участков по отношению к одному антигену или эпитопу обладает слитый белок, т.е. является ли он моновалентным, бивалентным, трехвалентным или мультивалентным. Мультивалентность слитого белка, являющегося антителом, означает, что он может иметь преимущество многократного взаимодействия в процессе связывания с антигеном, повышая, таким образом, авидность связывания с антигеном. Специфичность показывает, насколько большое число антигенов или эпитопов способен связать слитый белок, являющийся антителом, т.е. является ли он моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим, мультиспецифическим. При использовании этих определений природное антитело, например IgG, является бивалентным, т.к. оно имеет два связывающих плеча, но моноспецифическим, т.к. оно связывается с одним эпитопом. Моноспецифические мультивалентные белки слияния имеют более чем один связывающий участок для эпитопа, но связываются только с одним эпитопом, например диантитело с двумя связывающими участками, которые взаимодействуют с одним и тем же антигеном. Белки слияния могут включать в себя компонент одного антитела, мультивалентное или мультиспецифическое сочетание компонентов различных антител или несколько копий одного и того же компонента антитела. Слитый белок может дополнительно содержать антитело или фрагмент антитела и терапевтическое средство. Примеры терапевтических средств, которые являются подходящими для слитых белков, включают в себя иммуномодуляторы («слитый белок антитело-иммуномодулятор») и токсины («слитый белок антитело-токсин»). Один предпочтительный токсин включает в себя рибонуклеазу (РНКазу), предпочтительно рекомбинантную РНКазу.

Мультиспецифическое антитело представляет собой антитело, которое может одновременно связываться, по меньшей мере, с двумя мишенями, которые различаются по своей структуре, например, двумя различными антигенами, двумя различными эпитопами на одном антигене, или с гаптеном и/или антигеном или эпитопом. Одинаковая специфичность будет иметь место для антигенов или эпитопов B-клеток, T-клеток, миелоидных клеток, плазмацитов и мастоцитов. Еще одна специфичность могла бы наблюдаться на том же типе клеток для других антигенов, таких как CD3, CD4, CD5, CD8, CD11c, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, Ia, HMI.24, HLA-DR, тенасцин, MUC1 и антигены, ассоциированные с опухолями B-клеток, включая антигены сосудистого эндотелия, такие как VEGF и PIGF. Мультиспецифические, мультивалентные антитела представляют собой конструкции, которые содержат более чем один участок связывания, причем участки связывания отличаются по своей специфичности. Например, диантитело, в котором один участок связывания взаимодействует с одним антигеном, а другой участок - с другим антигеном.

Биспецифическое антитело представляет собой антитело, которое может связываться одновременно с двумя мишенями, которые обладают различной структурой. Биспецифические антитела (bsAb) и биспецифические фрагменты антител (bsFab) имеют, по меньшей мере, одно плечо, которое специфически связывается, например, с антигеном или эпитопом B-клетки, T-клетки, миелоидной клетки, плазмацита и мастоцита, и, по меньшей мере, еще одно отличающееся плечо, которое специфически связывается с направленным на мишень конъюгатом, который имеет в своем составе терапевтическое или диагностическое средство. Разнообразные биспецифические белки слияния можно получить, применяя молекулярную инженерию. В одной форме биспецифический белок слияния является моновалентным, состоящим, например, из scFv с одним участком связывания для одного антигена и фрагмента Fab с одним участком связывания для второго антигена. В другой форме биспецифический белок слияния является дивалентным, состоящим, например, из IgG с участком связывания для одного антигена и двух scFv с двумя участками связывания для второго антигена.

Антитела, которые созданы наподобие собачьих или кошачьих, представляют собой рекомбинантные белки, в которых принадлежащие грызунам (или другим видам) области моноклональных антител, определяющие комплементарность, перенесены из тяжелых и легких вариабельных цепей иммуноглобулина грызунов (или других видов) соответственно в вариабельные области иммуноглобулина собак или кошек.

Антитела, которые созданы наподобие антител человекообразных приматов, представляют собой рекомбинантные белки, в которых области моноклонального антитела, определяющие комплементарность и принадлежащие приматам, отличным от человека (например, обезьянам), были перенесены из тяжелых и легких вариабельных цепей иммуноглобулина грызунов (или других видов) в вариабельные области иммуноглобулина приматов, отличных от человека.

Домашние животные включают в себя крупных животных, таких как лошади, крупный рогатый скот, овцы, козы, ламы, альпаки и свиньи, а также сопутствующих человеку животных. В предпочтительном варианте осуществления домашнее животное представляет собой лошадь.

Сопутствующие человеку животные включают в себя животных, которые содержатся в качестве комнатных животных. В основном это собаки и кошки, хотя к этой группе также относятся небольшие грызуны, такие как морские свинки, хомяки, крысы и хорьки, а также приматы, такие как обезьяны. В предпочтительном варианте осуществления сопутствующее животное представляют собой собаку или кошку.

Термин «очищающее средство» относится к антителу, которое заполняет участки связывания целевого фрагмента, причем целевой фрагмент может представлять собой антитело, фрагмент антитела, связывающийся с антигеном, или целевой фрагмент, который не является антителом. В более предпочтительном способе очищающее средство представляет собой моноклональное антитело, которое является антиидиотипическим по отношению к моноклональному антителу конъюгата, используемому на первой стадии, как описано в заявке Соединенных Штатов Сер.№ 08/486166. В другом предпочтительном варианте осуществления очищающее средство замещено многочисленными остатками углеводов, таких как галактоза, которые дают возможность быстро вывести очищающее средство из циркуляции за счет асиалогликопротеиновых рецепторов в печени.

2. Получение моноклональных антител, включая химерные, гуманизированные и человеческие антитела

Моноклональные антитела (Mab) являются однородной популяцией антител к отдельному антигену, причем антитела содержат только один тип участков, связывающих антиген, и связываются лишь с одним эпитопом на антигенной детерминанте.

Моноклональные антитела грызунов к отдельным антигенам могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. См., например, Kohler and Milstein, Nature256:495 (1975) и Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [здесь и далее «Coligan»]. Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены путем инъекции мышам состава, включающего в себя антиген, подтверждения наличия выработки антител за счет взятия образца сыворотки, удаления селезенки для получения B-лимфоцитов, объединения B-лимфоцитов с клетками миеломы для получения гибридом, клонирования гибридом, отбора положительных клонов, которые вырабатывают антитела к антигену, культивирования клонов, которые вырабатывают антитела к антигену, и выделения антител из культур гибридомы.

Моноклональные антитела могут быть выделены из культур гибридомы и очищены с помощью целого ряда хорошо разработанных методик. Эти методики выделения включают в себя аффинную хроматографию с протеин-А сефарозой, эксклюзионную хроматографию с исключением по размеру и ионообменную хроматографию. См., например, Coligan на стр. 2.7.1-2.7.12 и стр. 2.9.1-2.9.3. См., также, Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" в METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).

После первоначального появления антител к иммуногену антитела можно секвенировать и впоследствии получать их согласно рекомбинантным методикам. Гуманизация и химеризация мышиных антител и фрагментов антител хорошо известны специалистам в данной области. Например, гуманизированныемоноклональные антитела получают, перенося мышиные, определяющие комплементарность области из тяжелой и легкой вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в человеческие вариабельные области и затем замещая человеческие остатки в областях каркаса мышиных эквивалентов. Применение компонентов антител, полученных из гуманизированныхмоноклональных антител, устраняет потенциальные проблемы, связанные с иммуногенностью мышиных константных областей.

Общие методики клонирования вариабельных областей мышиного иммуноглобулина описаны, например, в публикации Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:3833 (1989), которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки. Методики создания химерных антител хорошо известны специалистам в данной области. В качестве примера Leung et al., Hybridoma13:469 (1994) описывают получение химеры LL2 путем сочетания последовательностей ДНК, закодированных V_κ- и V_H-доменами моноклонального антитела LL2, т.е. антитела против CD22, с соответствующими человеческими областями константных регионов κ и IgG₁. Кроме этого данная публикация предоставляет последовательность нуклеотидов вариабельных областей легкой и тяжелой цепи LL2, т.е. соответственно V_κ и V_H. Методики получения гуманизированныхMab описаны, например Jones et al., Nature321:522 (1986), Riechmann et al., Nature332:323 (1988), Verhoeyen et al., Science239:1534 (1988), Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech.12:437 (1992) и Singer et al., J. Immun.150:2844 (1993), причем каждый из этих источников включен в настоящую заявку с помощью ссылки.

Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит вариабельные области, включая CDR, полученные из антител одного вида животных, как например, из антител грызунов, в то время как остальная часть молекулы антитела, т.е. константные области, получены из человеческих антител. Соответственно, химерное моноклональное антитело также может быть гуманизировано заменой мышиной FR в вариабельных областях химерного моноклонального антитела одной или несколькими различными человеческими FR. Конкретно, мышиные CDR переносят из тяжелой и легкой вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в соответствующие вариабельные области человеческого антитела. Поскольку простое перенесение мышиных CDR в человеческие FR часто приводит к снижению или даже потере характерного для антитела сродства, для сохранения исходного сродства мышиного антитела могут потребоваться дополнительные изменения. Это может сопровождаться заменой одного или многих человеческих остатков в областях FR их мышиными аналогами для получения антитела, которое обладает хорошим сродством в отношении связывания со своим эпитопом. См., например, Tempest et al., Biotechnology9:266 (1991) и Verhoeyen et al., Science239:1534 (1988). Сродство гуманизированных, химерных и человеческих Mab к конкретному эпитопу может быть увеличено мутагенезом CDR с тем, чтобы более низкая доза антитела могла быть столь же эффективна, как и более высокая доза с меньшим сродством Mab до мутагенеза. См., например, WO0029584A1.

Другим способом получения антител согласно изобретению является их выработка в молоке трансгенного домашнего скота. См., например, Colman A., Biochem. Soc. Symp., 63:141-147, 1998; патент Соединенных Штатов 5827690, причем оба источника полностью включены в настоящую заявку с помощью ссылки. Получают две конструкции ДНК, которые содержат, соответственно, сегменты ДНК, кодирующие сдвоенные тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина. Сегменты ДНК клонируют в вектор экспрессии, который содержит промоторную последовательность, которая предпочтительно экспрессируется в эпителиальных клетках млекопитающих. Примеры включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, промоторы из генов казеина кролика, коровы и овцы, коровий ген α-лактоглобулина, овечий ген β-лактоглобулина и мышиный ген белка кислой сыворотки. Предпочтительно включенный фрагмент фланкирован на его 3'-конце за счет родственной последовательности генома из молочно-специфического гена. Это обеспечивает полиаденилированный участок и транскрипт-стабилизирующие последовательности. Кассеты экспрессии одновременно вводят в пронуклеусы оплодотворенных яйцеклеток млекопитающих, которые затем имплантируют в матку реципиентной женской особи и оставляют для вынашивания. После рождения потомство отбирают по признаку наличия обоих трансгенов с помощью анализа по Саузерну. Для того чтобы антитело имелось в наличии, оба гена тяжелой и легкой цепи должны экспрессироваться одновременно в одной и той же клетке. Молоко трансгенных женских особей анализируют на наличие и функциональность антитела или фрагмента антитела, используя известные стандартные иммунологические методики. Антитела могут быть выделены из молока с применением известных стандартных способов.

Полностью человеческие антитела согласно изобретению, т.е. человеческие анти-CD20-Mab или другие человеческие антитела, такие как анти-CD19-, анти-CD22-, анти-CD21- или анти-CD23-Mab для комбинированной терапии с гуманизированными, химерными или человеческими антителами против CD20, могут быть получены из трансгенных животных, не являющихся человеком. См., например, Mendez et al., Nature Genetics15:146-156 (1997); патент Соединенных Штатов № 5633425, причем оба источника полностью включены в настоящую заявку с помощью ссылки. Например, человеческое антитело может быть восстановлено из трансгенной мыши, обладающей локусами человеческого иммуноглобулина. Гуморальная иммунная система мыши гуманизируется с помощью инактивации эндогенных генов иммуноглобулина и введения локусов человеческого иммуноглобулина. Локусы человеческого иммуноглобулина являются чрезвычайно сложными и содержат большое число отдельных сегментов, которые в общей сложности занимают почти 0,2% генома человека. Чтобы убедиться, что трансгенная мышь способна вырабатывать соответствующий ассортимент антител, следует ввести в геном мыши большие части человеческих локусов тяжелой и легкой цепи. Это совершается в ступенчатом процессе, который начинается с формирования искусственных дрожжевых хромосом (YAC), содержащих локусы либо тяжелой, либо легкой цепи человеческого иммуноглобулина в эмбриональной конфигурации. Поскольку каждая вставка имеет объем приблизительно 1 млн н., конструкция YAC требует гомологичной рекомбинации перекрывающихся фрагментов локусов иммуноглобулина. Две YAC, одна из которых содержится в тяжелой цепи, а другая - в легкой цепи, отдельно вводят в мышь путем слияния YAC-содержащих сферобластов дрожжей со стволовыми эмбриональными клетками мыши. Затем клоны стволовых эмбриональных клеток мыши путем микроинъекции вводят в мышиные бластоциты. Полученных в итоге химерных мужских особей мыши подвергают отбору в отношении их способности передавать YAC через их зародышевые клетки и разводят с мышами, у которых наблюдается недостаток выработки мышиных антител. Разведение двух трансгенных штаммов, один из которых содержит человеческие локусы тяжелой цепи, а другой - человеческие локусы легкой цепи, создает потомство, у которого вырабатываются человеческие антитела в качестве ответа на иммунизацию.

Дополнительные современные методы получения биспецифических Mab включают в себя созданные рекомбинантные Mab, которые содержат дополнительные остатки цистеина, с тем, чтобы они связывались сильнее по сравнению с более обычными изотипами иммуноглобулина. См., например, FitzGerald et al., Protein Eng. 10(10): 1221-1225, 1997. Другой подход состоит в том, чтобы создать рекомбинантные слитые белки, в которых соединены два или более различных одноцепочечных антитела или сегментов фрагмента антитела с необходимой двойной специфичностью. См., например, Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997. Большое количество биспецифических слитых белков может быть получено при использовании молекулярной инженерии. В одной форме биспецифический слитый белок является моновалентным, состоящим, например, из scFv с одним участком связывания для одного антигена и фрагмента Fab с одним участком связывания для второго антигена. В другой форме биспецифический слитый белок является дивалентным, состоящим, например, из IgG с двумя участками связывания для одного антигена и двух scFv с двумя участками связывания для второго антигена.

Биспецифические слитые белки, которые связывают два или более различных одноцепочечных антитела или фрагмента антител, получают подобным же образом. Рекомбинантные способы могут быть использованы для получения большого количества слитых белков. Например, слитый белок, содержащий фрагмент Fab, может быть получен из гуманизированногомоноклонального антитела против CD20 и scFv, который получен из мышиного анти-diDTPA. Гибкий линкер, такой как GGGS, связывает scFv с константной областью тяжелой цепи антитела против CD20. С другой стороны, scFv может быть связан с константной областью легкой цепи еще одного гуманизированногоантитела. Подходящие линкерные последовательности, необходимые для внутрикаркасного присоединения тяжелой цепи Fd к scFv, вводят в VL- и VK-домены с помощью реакций PCR. Кодирующий scFv фрагмент ДНК затем встраивают в стадийный вектор, содержащий последовательность ДНК, которая кодирует CH1-домен. Итоговую конструкцию scFv-CH1 вырезают и встраивают в вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую VH-область антитела против CD20. Итоговый вектор может быть использован для трансфицирования подходящей клетки-хозяина, такой как клетка млекопитающего, для экспрессии биспецифического слитого белка.

Примеры подобных бивалентных и биспецифических антител могут быть найдены в заявках на патент Соединенных Штатов 60/399707, поданной 1 августа 2002 г, 60/360229, поданной 1 марта 2002 г, 60/388314, поданной 14 июня 2002 г и 10/116116, поданной 5 апреля 2002 г, причем все заявки включены в настоящую заявку с помощью ссылки.

3. Получение фрагментов антител

Фрагменты антител, которые распознают конкретные эпитопы, могут быть получены по известным методикам. Фрагменты антител представляют собой связывающие антигены части антител, такие как F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, sFv и т.п. Другие фрагменты антител включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, фрагменты F(ab)'₂, которые могут быть получены путем расщепления молекулы антитела пепсином, а также фрагменты Fab', которые можно получить за счет восстановления дисульфидных мостиков фрагментов F(ab)'₂. Альтернативно могут быть созданы библиотеки экспрессии, экспрессирующие Fab' (Huse et al., 1989, Science 246:1274-1281), чтобы иметь возможность быстрой и легкой идентификации моноклональных фрагментов Fab' с желаемой специфичностью. Настоящее изобретение охватывает антитела и фрагменты антител.

Молекулы Fv с одной цепью (scFv) содержат VL-домен и VH-домен. VL- и VH-домены объединяются для образования целевого участка связывания. Два этих домена дополнительно ковалентно связаны пептидным линкером (L). Молекула scFv обозначается либо как VL-L-VH, если VL-домен является N-терминальной частью молекулы scFv, либо как VH-L-VL, если VH-домен представляет собой N-терминальную часть молекулы scFv. Способы получения молекул scFv и разработки подходящих пептидных линкеров описаны в патенте Соединенных Штатов № 4704692, патенте Соединенных Штатов № 4946778, см. также R.Raag и M.Whitlow, "Single Chain Fvs." FASEB 9:73-80 (1995) и R.E. Bird and B.W. Walker, Single Chain Antibody Variable Regions, TIBTECH 9:132-137 (1991). Данные источники включены в настоящую заявку с помощью ссылки.

Фрагмент антитела может быть получен протеолитическим гидролизом полноразмерных антител или путем экспрессии в E.Coli или другом хозяине ДНК, кодирующей фрагмент. Фрагмент антитела может быть получен путем расщепления полноразмерных антител пепсином или папаином с помощью общепринятых способов. Например, фрагмент антитела может быть получен ферментативным расщеплением антитела с помощью пепсина с образованием фрагмента 5S, который обозначают F(ab')₂. Этот фрагмент за счет расщепления дисульфидных связей может быть расщеплен далее с образованием моновалентного фрагмента 3.5S Fab' с помощью реагента, восстанавливающего тиоловую группу, и необязательно блокирующей группы для сульфогидрильных групп. С другой стороны, ферментативное расщепление с использованием папаина непосредственно приводит к образованию двух моновалентных фрагментов Fab и фрагмента Fc. Эти способы описаны, например Goldenberg, патенты Соединенных Штатов №№ 4036945 и 4331647, причем указанные патенты полностью включены в настоящую заявку с помощью ссылки. См., также Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960); Porter, Biochem. J.73:119 (1959), Edelman et al., в METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 1, p. 422 (Academic Press 1967) и Coligan на стр. 2.8.1-2.8.10 и 2.10.-2.10.4.

Другая форма фрагментов антител представляет собой пептид, который кодирует одиночную область, определяющую комплементарность (CDR). CDR представляет собой сегмент вариабельной области антитела, комплементарный по структуре эпитопу, с которым связывается антитело, причем CDR является более изменчивым, чем остальная часть вариабельной области. Соответственно, CDR часто называют гипервариабельной областью. Вариабельная область включает в себя три CDR. Пептиды CDR могут быть получены путем конструирования генов, которые кодируют CDR представляющего интерес антитела. Такие гены получают, например, используя полимеразную цепную реакцию для синтеза вариабельной области из РНК клеток, которые вырабатывают антитело. См., например, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995); and Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995).

Помимо этого, могут быть использованы другие способы расщепления антител, как, например, отделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легких-тяжелых цепей, дальнейшее расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические методики, в той степени, в которой полученные фрагменты сохраняют способность к связыванию с антигеном, который распознается целым антителом.

4. Мультиспецифические и мультивалентные антитела

Описанные в настоящей заявке антитела, имеющие одинаковые специфичности, а также другие антитела, имеющие отличающиеся специфичности, также могут быть получены в виде мультиспецифических антител (содержащих, по меньшей мере, один участок связывания с эпитопом или антигеном CD20 и, по меньшей мере, один участок связывания с другим эпитопом на CD20 или другим антигеном) и мультивалентных антител (содержащих многочисленные участки связывания с одним и тем же эпитопом или антигеном).

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу или фрагменту антитела, которые обладают, по меньшей мере, одной областью связывания, которая специфически связывается с маркером целевой клетки, и, по меньшей мере, еще одной областью связывания, которая специфически связывается с нацеливаемым конъюгатом. Нацеливаемый конъюгат содержит определенную долю носителя, который содержит или несет, по меньшей мере, один эпитоп, распознаваемый, по меньшей мере, одной областью связывания биспецифического антитела или фрагмента антитела.

Как указано выше, для получения биспецифических антител или фрагментов антител может быть использовано большое количество рекомбинантных методик.

В настоящем изобретении также рассматриваются мультивалентные антитела. Такой связывающий мишень мультивалентный белок создан путем соединения первого и второго полипептидов. Первый полипептид содержит первую одноцепочечную молекулу Fv, ковалентно связанную с первой подобной иммуноглобулину областью, которая предпочтительно представляет собой участок вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина. Второй полипептид содержит вторую одноцепочечную молекулу Fv, ковалентно связанную со второй подобной иммуноглобулину областью, которая предпочтительно представляет собой участок вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Как первая, так и вторая одноцепочечная молекула Fv образуют целевой участок связывания, причем первая и вторая подобные иммуноглобулину области объединяются с образованием третьего участка, связывающего мишень.

Одноцепочечная молекула Fv, имеющая конфигурацию VL-L-VH, в которой L представляет собой линкер, может объединяться с другой одноцепочечной молекулой Fv, имеющей конфигурацию VH-L-VL, с образованием бивалентного димера. В этом случае VL-домен первой молекулы scFv и VH-домен второй молекулы scFv объединяются с образованием одного участка, связывающего мишень, в то время как VH-домен первой молекулы scFv и VL-домен второй молекулы scFv объединяются с образованием другого связывающего мишень участка.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой биспецифический, трехвалентный нацеливающий белок, содержащий две разнородные, нековалентно соединенные полипептидные цепи, которые образуют три участка связывания, два из которых имеют сродство к одной мишени, а третий имеет сродство к гаптену, который может быть получен и присоединен к носителю для образования диагностического и/или терапевтического средства. Связывающий белок предпочтительно имеет два одинаковых связывающих антигенных участка, а также отличающийся связывающий антигенный участок. Биспецифические трехвалентные нацеливающие агенты имеют два различных scFv, причем один scFv содержит два V_H-домена из одного антитела, связанных коротким линкером с V_L-доменом другого антитела, и второй scFv содержит два V_L-домена из первого антитела, соединенных коротким линкером с V_H-доменом другого антитела. Способы получения мультивалентных, мультиспецифических агентов из V_H- и V_L-доменов обеспечивают то, что отдельные цепи, синтезированные из плазмидной ДНК в организме хозяина, состоят целиком из V_H-доменов (V_H-цепи) или целиком из V_L-доменов (V_L-цепи) таким образом, чтобы любой мультивалентный и мультиспецифический агент мог быть получен с помощью нековалентной ассоциации одной V_H-цепи с одной V_L-цепью. Например, при формировании трехвалентного, триспецифического агента V_H-цепь будет состоять из последовательности аминокислот трех V_H-доменов, каждый из которых соответствует антителу с отличающейся специфичностью, соединенных пептидными линкерами переменной длины, а также из V_L-цепи, которая будет состоять из комплементарных V_L-доменов, соединенных пептидными линкерами, которые подобны линкерам, использованным для V_H-цепи. Поскольку V_H- и V_L-домены антител соединены антипараллельно, в предпочтительном способе согласно изобретению V_L-домены в V_L-цепи расположены в порядке, обратном V_H-доменам в V_H-цепи.

5. Диантитела, триантитела и тетраантитела

Антитела согласно изобретению также могут быть использованы для получения функциональных биспецифических одноцепочечных антител (bscAb), которые также называют диантителами и которые могут быть выработаны в клетках млекопитающих с использованием рекомбинантных методик. См., например, включенную в настоящее изобретение ссылку Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025, 1995. Например, bscAb получают путем объединения через глицин-сериновый линкер двух одноцепочечных фрагментов Fv, применяя рекомбинантные методики. V-домены легкой цепи (V_L) и тяжелой цепи (V_H) двух интересующих антител выделяют, используя стандартные способы PCR. Молекулы ДНК, комплементарные V_L и V_H, которые получены из каждой гибридомы, затем соединяют для образования одноцепочечного фрагмента в двухстадийном синтезе PCR. Первая стадия PCR вводит линкер (Gly₄-Ser₁)₃, а вторая стадия соединяет ампликоны V_L и V_H. Каждую из одноцепочечных молекул затем клонируют в бактериальный вектор экспрессии. После амплификации одну из одноцепочечных молекул отделяют и субклонируют в другой вектор, содержащий вторую интересующую одноцепочечную молекулу. Итоговый фрагмент bscAb субклонируют в эукариотический вектор экспрессии. Функциональную экспрессию белка можно осуществить трансфицированием вектора в клетки яичника китайского хомячка. Биспецифические слитые белки получают сходным образом. Биспецифические одноцепочечные антитела и биспецифические слитые белки включены в рамки настоящего изобретения.

Например, гуманизированное, химерное или человеческое моноклональное антитело против CD22 может быть использовано для получения антиген-специфических диантител, триантител и тетраантител. Моноспецифические диантитела, триантитела и тетраантитела селективно связываются с нацеленными антигенами и, поскольку возрастает число участков связывания в молекуле, увеличивается сродство к целевой клетке и наблюдается более продолжительное время пребывания в желаемом местоположении. В случае диантител используют содержащий две цепи полипептид V_H гуманизированногоCD22-Mab, присоединенный к полипептиду V_K гуманизированногоCD22-Mab линкером из пяти аминокислотных остатков. Каждая цепь образует одну половину гуманизированного CD22-диантитела. В случае триантител используют содержащий три цепи полипептид V_H гуманизированногоCD22-Mab, присоединенный к полипептиду V_K гуманизированногоCD22-Mab без линкера. При этом каждая цепь образует одну треть hCD22-триантитела.

Предпочтительное применение биспецифических диантител, описанных в настоящей заявке, заключается в предварительном нацеливании CD22-положительных опухолей для последующей целевой доставки диагностических или терапевтических средств. Эти диантитела селективно связываются с целевыми антигенами, обеспечивая увеличенное сродство и более продолжительное время пребывания в желательном местоположении. Кроме того, диантитела, связанные с неантигеном, быстро выводятся из организма, и воздействие на нормальные ткани сводится к минимуму. Диагностические и терапевтические средства могут включать в себя изотопы, лекарственные препараты, токсины, цитокины, гормоны, факторы роста, конъюгаты, радионуклиды и металлы. Например, металлический гадолиний используют для ЯМР-томографии. Примерами радионуклидов являются²²⁵Ac,¹⁸F,⁶⁸Ga,⁶⁷Ga,⁹⁰Y,⁸⁶Y,¹¹¹In,¹³¹I,¹²⁵I,¹²³I,^99mTc,^94mTc,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁷⁷Lu,⁶²Cu,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,²¹²Bi,²¹³Bi,³²P,¹¹C,¹³N,¹⁵O,⁷⁶Br и²¹¹At. Прочие радионуклиды также подходят в качестве диагностических и терапевтических средств, в особенности радионуклиды в энергетическом диапазоне от 60 до 4000 кэВ.

Кроме этого совсем недавно появилось сообщение о тетравалентном тандемном диантителе (названном тандабом) с двойной специфичностью (Cochlovius et al., Cancer Research (2000) 60:4336-4341). Биспецифический тандаб является димером, состоящим из двух идентичных полипептидов, причем каждый из них содержит четыре вариабельных области двух различных антител (V_H1, V_L1, V_H2, V_L2), соединенных в такой ориентации, которая облегчает при самоассоциации образование двух потенциальных участков связывания для каждой из двух различных специфичностей.

6. Конъюгированные мультивалентные и мультиспецифические антитела

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой конъюгированное мультивалентное антитело. Дополнительные аминокислотные остатки могут быть добавлены к N- или C-концевым частям первого или второго полипептида. Дополнительные аминокислотные остатки могут содержать пептидный маркер, сигнальный пептид, цитокин, энзим (например, энзим, активирующий пролекарство), гормон, пептидный токсин, такой как экзотоксин pseudomonas, пептидное лекарство, цитотоксический белок или другие функциональные белки. В рамках настоящего изобретения функциональный белок представляет собой белок, который обладает биологической функцией.

В одном варианте осуществления лекарства, токсины, радиоактивные соединения, энзимы, гормоны, цитотоксические белки, хелаты, цитокины и другие функциональные агенты могут быть конъюгированы со связывающимся с мишенью мультивалентным белком, предпочтительно путем ковалентного присоединения к боковым цепям аминокислотных остатков мультивалентного связывающегося с мишенью белка, например, к амино, карбоксильной, фенильной, тиоловой или гидрокси-группам. С этой целью могут быть использованы различные общепринятые линкеры, например диизоцианаты, диизотиоцианаты, эфиры бис(гидроксисукцинимида), карбодиимиды, эфиры имида малеиновой кислоты и гидроксисукцинимида, глутаральдегид и т.п. Конъюгация агентов с мультивалентным белком предпочтительно не оказывает значительного влияния на специфичность связывания белка или его сродство к мишени. В рамках настоящего изобретения под функциональным агентом подразумевается агент, имеющий биологическую функцию. Предпочтительным функциональным агентом является цитотоксический агент.

В других вариантах осуществления направляемая биспецифическим антителом доставка терапевтических средств или полимерных пролекарств к мишеням in vivo может быть объединена с доставкой радионуклидов с помощью биспецифического антитела, причем таким способом достигается сочетание химиотерапии и радиоиммунотерапии. Каждый из видов терапии может быть связан с нацеливаемым конъюгатом и назначен в одно и то же время, или же радионуклид может быть назначен в качестве составной части первого нацеливаемого конъюгата, а лекарство назначено на более поздней стадии в качестве составной части второго нацеливаемого конъюгата.

В другом варианте осуществления цитотоксический агент может быть конъюгирован с полимерным носителем, и полимерный носитель впоследствии может быть конъюгирован с мультивалентным связывающим мишень белком. Подробнее о данном способе см. Ryser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3867-3870 (1978), патенты Соединенных Штатов №№ 4699784 и 4046722, причем данные источники включены в настоящее изобретение с помощью ссылки. Конъюгация предпочтительно не влияет на специфичность связывания или сродство мультивалентного связывающего белка.

7. Применение приматизированных, гуманизированных, химерных и человеческих антител для лечения и диагностики

Приматизированные, гуманизированные, химерные и человеческие моноклональные антитела, т.е. анти-CD20-Mab и прочие описанные здесь антитела, в соответствии с настоящим изобретением подходят для применения в терапевтических или диагностических методиках. Соответственно, настоящее изобретение предлагает введение приматизированных, гуманизированных, химерных и человеческих антител согласно изобретению по отдельности, в виде простых антител или назначенных в качестве мультимодальной терапии, временно соответствующих режиму дозирования, но не конъюгированных с терапевтическим средством. Эффективность простых анти-CD20-Mab может быть увеличена сочетанием простых антител с одним или несколькими другими простыми антителами, т.е. Mab к специфическим антигенам, таким как CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, B7, Ia, HM1.24, тенасцин, MUC1 или HLA-DR, а также с антиангиогенными антителами (например, антителами VEGF и PIGF), с одним или несколькими иммуноконъюгатами анти-CD20 или антителами к этим перечисленным антигенам, объединенными с терапевтическими средствами, которые включают в себя лекарства, токсины, иммуномодуляторы, гормоны, терапевтические радионуклиды и т.д., с одним или несколькими терапевтическими средствами, которые включают лекарства, токсины, иммуномодуляторы, гормоны, терапевтические радионуклиды и т.д., введенные одновременно или последовательно с Mab или соответствующие предписанному режиму дозирования. Предпочтительные антигены B-клеток включают в себя антигены, эквивалентные человеческим антигенам CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD46, CD52, CD74, CD80 и CD5. Предпочтительные антигены T-клеток включают в себя антигены, эквивалентные человеческим антигенам CD4, CD8 и CD25 (рецептор IL-2). Эквивалент антигена HLA-DR может использоваться в лечении как B-клеточных, так и T-клеточных расстройств. Особенно предпочтительными антигенами B-клеток являются антигены, эквивалентные человеческим антигенам CD19, CD21, CD22, CD23, CD74, CD80 и HLA-DR. Особенно предпочтительными антигенами T-клеток являются антигены, эквивалентные человеческим антигенам CD4, CD8 и CD25. CD46 представляет собой антиген на поверхности раковых клеток, который блокирует комплемент-зависимый лизис (CDC).

Дополнительно настоящее изобретение предлагает введение иммуноконъюгата для терапевтического применения при B-клеточных лимфомах, а также других заболеваниях и расстройствах. Иммуноконъюгат, как описано в настоящем изобретении, представляет собой молекулу, содержащую компонент антитела и терапевтическое средство, включая пептид, который может нести терапевтическое средство. Иммуноконъюгат сохраняет иммунологическую активность входящего в него антитела, т.е. фрагмент антитела после конъюгации обладает приблизительно той же или слегка пониженной способностью связывать родственный антиген, как и до конъюгации.

Помимо этого, настоящее изобретение предлагает введение иммуноконъюгата для терапевтического применения при миелоидных лейкемиях, в случае которых мишенями являются CD33, CD45, CD66, а также другие антигены, ассоциированные с гранулоцитами.

Большое количество терапевтических средств может быть с успехом конъюгировано с антителами согласно изобретению. Перечисленные здесь терапевтические средства представляют собой такие средства, которые также применимы для отдельного введения с простыми антителами, как это описано выше. Терапевтические средства включают в себя, например, химиотерапевтические лекарственные препараты, такие как алкалоиды барвинка, антрациклины, эпидофилотоксины, таксаны, антиметаболиты, алкилирующие средства, антибиотики, ингибиторы Cox-2, антимитотические и апоптотические средства, в особенности доксорубицин, метотрексат, таксол, CPT-11, камптотеканы, а также других представителей перечисленных и прочих классов противораковых средств и т.п. Другие лекарственные средства противораковой химиотерапии, применимые для получения иммуноконъюгатов и слитых белков, включают в себя азотистые иприты, алкилсульфонаты, нитрозомочевины, триазены, аналоги фолиевой кислоты, ингибиторы COX-2, аналоги пиримидина, аналоги пурина, координационные комплексные соединения платины, включая оксалиплатин, гормоны и т.п. Подходящие химиотерапевтические средства описаны в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19^th Ed. (Mack Publishing Co., 1995) и в GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7^th Ed. (MacMillan Publishing Co., 1985), а также в переработанных изданиях указанных публикаций. Другие подходящие химиотерапевтические средства, такие как экспериментальные лекарственные препараты, известны специалистам в данной области.

Дополнительно может быть конъюгирован хелатообразователь, такой как DTPA, DOTA, TETA или NOTA или подходящий пептид, к которому присоединена обнаруживаемая метка, или цитотоксическое средство, такое как тяжелый металл или радионуклид. Например, терапевтически применимый иммуноконъюгат может быть получен путем объединения фотоактивного агента или красителя с композитным антителом. Для обнаружения и лечения больных участков с помощью направления на эти участки подходящего света применялись флуоресцентные композиции, такие как флуорохром и другие хромогены или чувствительные к видимому свету красители, такие как порфирины. Подобный подход в терапии был назван фотооблучением, фототерапией или фотодинамической терапией (Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain22:430 (1986)). Кроме того, для осуществления фототерапии моноклональные антитела были соединены с фотоактивированными красителями. Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983); idem., Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:8744 (1986); idem., Photochem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422 (1989); Pelegrin et al.,Cancer67:2529 (1991). Однако в эти более ранние исследования не входило применение способов эндоскопической терапии, в особенности с применением фрагментов или субфрагментов антител. Таким образом, настоящее изобретение подразумевает терапевтическое применение иммуноконъюгатов, содержащих фотоактивный агент или красители.

Токсин, такой как экзотоксин Pseudomonas, также может входить в комплекс или представлять собой терапевтически активную часть слитого белка, являющегося антителом для анти-CD20 согласно изобретению. Прочие токсины, включая рицин, абрин, рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, энтеротоксин-A стафилококков, антивирусный белок фитолакки, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas, соответствующим образом используют для получении подобных конъюгатов или других слитых белков. См., например, Pastan et al., Cell47:641 (1986) и Goldenberg, CA - A Cancer Journal for Clinicians44:43 (1994). Другие токсины, которые подходят для применения в настоящем изобретении, известны специалистам в данной области и раскрыты в патенте Соединенных Штатов № 6077499, который полностью включен в настоящую заявку с помощью ссылки.

Иммуномодулятор, такой как цитокин, также может быть конъюгирован или может являться терапевтически активной частью слитого белка, или же его можно вводить вместе с гуманизированныманти-CD20 или остальными антителами лимфомы согласно изобретению. Подходящие для настоящего изобретения цитокины включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, интерфероны и интерлейкины, как описано ниже.

8. Получение иммуноконъюгатов

Любое из антител или антител, являющихся слитыми белками согласно изобретению, может быть конъюгировано с одним или несколькими терапевтическими средствами. Как правило, к каждому антителу или фрагменту антитела присоединено одно терапевтическое средство, но к тому же самому антителу или фрагменту антитела может быть присоединено более чем одно терапевтическое средство. Слитый белок, представляющий собой антитело согласно изобретению, содержит два или несколько антител или их фрагментов, причем каждое из антител, составляющих данный слитый белок, может содержать терапевтическое средство. Дополнительно одно антитело или несколько антител из числа входящих в состав слитого белка, представляющего собой антитело, могут иметь более чем одно присоединенное терапевтическое средство. Более того, терапевтические средства не должны быть одинаковыми, но они могут представлять собой различающиеся терапевтические средства. Например, к одному и тому же слитому белку можно присоединить лекарственный препарат и радиоактивный изотоп. В частности, IgG может содержать радиоактивную метку¹³¹I и быть прикрепленным к лекарственному препарату. Атом¹³¹I может быть включен в тирозин из состава IgG, и лекарство может быть присоединено к эпсилон-аминогруппе лизина из состава IgG. Терапевтические средства также могут быть прикреплены к восстановленным группам SH и к углеводной части цепей.

Биспецифические антитела согласно изобретению применимы в методиках предварительного нацеливания и обеспечивают предпочтительный путь для доставки двух терапевтических средств пациенту. Заявка на изобретение Соединенных Штатов серийный номер 09/382186 раскрывает способ предварительного нацеливания при использовании биспецифического антитела, в котором биспецифическое антитело мечено¹²⁵I и доставляется пациенту с последующим введением дивалентного пептида, меченного^99mTc. Такой способ доставки приводит к отличным соотношениям¹²⁵I и^99mTc в опухолевых/нормальных тканях, демонстрируя, таким образом, применимость двух диагностических радиоактивных изотопов. Для того чтобы пометить антитела и антитела, являющиеся слитыми белками, может быть использовано любое сочетание известных терапевтических средств. Специфичность связывания компонента антитела конъюгата Mab, эффективность терапевтического средства или диагностического средства, а также эффекторную активность Fc-части антитела можно определить стандартным тестированием конъюгатов.

Терапевтическое средство может быть присоединено к шарнирной области восстановленного компонента антитела с помощью образования дисульфидной связи. В качестве альтернативы такие пептиды могут быть прикреплены к компоненту антитела с применением гетеробифункционального кросс-линкера, такого как N-сукцинил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer56:244 (1994). Общие методики формирования такого рода конъюгатов хорошо известны в технике. См., например, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press, 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by ChemicalMethods", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc., 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press, 1995). С другой стороны, терапевтическое средство может быть конъюгировано через углеводный фрагмент в Fc-области антитела. Углеводная группа может быть использована для повышения заполнения тем же пептидом, который связан с тиоловой группой, или же углеводный фрагмент может быть использован для связывания отличающегося пептида.

Способы присоединения пептидов к компонентам антител через углеводные фрагменты антител хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Shih et al., Int. J. Cancer 41:832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990); и Shih et al., патент Соединенных Штатов № 5057313, причем все перечисленные источники полностью включены в данную заявку при помощи ссылки. Общий способ включает в себя взаимодействие компонента антитела, содержащего окисленный углеводный фрагмент с несущим полимером, который имеет, по меньшей мере, одну свободную амино-функцию и который заполнен большим количеством пептидов. Эти реакции первоначально приводят к связыванию за счет образования основания Шиффа (имина), причем иминная связь может быть стабилизирована восстановлением во вторичный амин с образованием конечного конъюгата.

Область Fc отсутствует в том случае, если антитело, использованное в качестве составной части иммуноконъюгата, представляет собой фрагмент антитела. Однако имеется возможность ввести углеводный фрагмент в вариабельную область легкой цепи полноразмерного антитела или фрагмента антитела. См., например, Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995); Hansen et al., патент Соединенных Штатов № 5443953 (1995), Leung et al., патент Соединенных Штатов № 6254868, причем все перечисленные источники полностью включены в настоящую заявку с помощью ссылки. Созданный углеводный фрагмент используют для прикрепления терапевтического или диагностического средства.

9. Фармацевтически приемлемые носители

Приматизированные, гуманизированные, химерные или человеческие меченные радиоактивной меткой антитела для доставки пациенту должны представлять собой отдельно взятые Mab, иммуноконъюгаты, слитые белки, или же они могут содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, один или несколько дополнительных ингредиентов или какое-либо сочетание перечисленного.

Рецептура антитела, представляющего собой иммуноконъюгат согласно изобретению, может быть составлена в соответствии с известными способами для получения пригодных с фармацевтической точки зрения композиций, с помощью которых иммуноконъюгат или простое антитело включают в состав смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Стерильный буферный солевой раствор на основе фосфатов представляет собой один из примеров подходящего с фармацевтической точки зрения носителя. Другие подходящие носители хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS 5^th Edition (Lea & Febiger 1990) и Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18^th Edition (Mack Publishing Company 1990), а также переработанные издания указанных источников.

Иммуноконъюгат или простое антитело согласно изобретению могут входить в состав для парентерального применения, такой как состав для внутривенного введения путем, например, инъекции болюсов или непрерывного вливания. Составы для инъекции могут быть реализованы в виде лекарственных форм разового дозирования, например, в виде ампул или упаковок, содержащих несколько доз, с добавленным консервантом. Составы могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии на водной или масляной основе, а также могут содержать сотавообразующие средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. С другой стороны, действующее начало может быть представлено в форме порошка для смешивания перед применением с подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой.

Для регулирования продолжительности воздействия терапевтического конъюгата или простого антитела могут применяться дополнительные фармацевтические способы. Препараты с регулируемым выделением могут быть получены при использовании полимеров для образования комплексов или адсорбции иммуноконъюгата или простого антитела. Например, биосовместимые полимеры включают в себя матрицы из поли(этилен-со-винилацетата) и матрицы из полиангидридного сополимера димера стеариновой кислоты и себациновой кислоты. Sherwood et al., Bio/Technology10:1446 (1992). Скорость выделения иммуноконъюгата или антитела из такой матрицы зависит от молекулярной массы иммуноконъюгата или антитела, количества иммуноконъюгата или антитела в матрице и размера диспергированных частиц. Saltzman et al., Biophys. J.55:163 (1989); Sherwood et al., supra. Другие твердые лекарственные формы описаны в Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5^th Edition (Lea & Febiger 1990) и Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18^th Edition (Mack Publishing Company, 1990), а также переработанных изданиях указанных источников.

Иммуноконъюгаты, слитые белки, являющиеся антителами, или простые антитела также могут вводиться млекопитающим подкожно или другими парентеральными путями. Более того, введение может осуществляться путем длительного вливания или путем однократного или многократного введения болюсов. В целом дозировка вводимого человеку иммуноконъюгата, слитого белка или простого антитела будет зависеть от таких факторов, как возраст пациента, вес, рост, пол, общее состояние здоровья и история предшествующих заболеваний. Как правило, желательно обеспечить реципиента такой дозой иммуноконъюгата, слитого белка, являющегося антителом, или простого антитела, которая находится в диапазоне приблизительно от 1 до 20 мг/кг на одно внутривенное вливание, хотя при соответствующих обстоятельствах также могут вводиться более низкие или более высокие дозы. Данная доза может при необходимости даваться повторно, например, раз в неделю в течение 4-10 недель, предпочтительно раз в неделю в течение 8 недель, и более предпочтительно раз в неделю в течение 4 недель. Дозы могут даваться менее часто, как например, раз в две недели в течение нескольких месяцев. Дозы могут вводиться различными парентеральными путями с соответствующим изменением величины дозы и схемы введения.

Для терапевтических целей иммуноконъюгаты, слитые белки или простые антитела вводят млекопитающим в терапевтически эффективном количестве. Подходящим пациентом согласно изобретению, как правило, является человек, хотя предполагаются также пациенты животного происхождения. Говорят, что препарат антитела введен в «терапевтически эффективном количестве», если введенное количество является физиологически значимым. Средство является физиологически значимым, если его присутствие приводит к обнаруживаемым изменениям в физиологии млекопитающего-реципиента. В частности, препарат антитела согласно изобретению является физиологически значимым, если его присутствие вызывает противоопухолевую реакцию или смягчает признаки или симптомы состояния при аутоиммунном заболевании. Физиологически значимым результатом может быть также возбуждение гуморального и/или клеточного иммунного ответа у млекопитающего-реципиента.

10. Способы лечения

Настоящее изобретение предлагает применение антител согласно изобретению в качестве первичной композиции для лечения заболеваний, таких как злокачественные заболевания, связанные с B-клетками, злокачественные заболевания, связанные с T-клетками, или лимфомы другого типа. Кроме этого настоящее изобретение также применимо для лечения аутоиммунных заболеваний. В частности, описанные в настоящем изобретении композиции особенно применимы для лечения различных аутоиммунных заболеваний, а также вялотекущих форм B-клеточных лимфом, агрессивных форм B-клеточных лимфом, хронических лимфатических лейкемий, острых лимфатических лейкемий и макроглобулинемии Вальденстрема, множественной миеломы. Кроме этого могут подвергаться лечению T-клеточные заболевания, такие как T-клеточная лейкемия или грибовидный микоз. Например, компоненты и иммуноконъюгаты гуманизированногоантитела против CD22 могут применяться для лечения как вялотекущих, так и агрессивных форм неходжкинской лимфомы. Аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из острой идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, хронической идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, дерматомиозита, хореи Сиденгама, миастении gravis, системной красной волчанки, волчаночного нефрита, ревматического полиартрита, полигландулярных синдромов, буллезного пемфигоида, сахарного диабета, болезни Шенлейн-Геноха, пост-стрептококкового нефрита, эритрита, синдрома Такаясу, болезни Аддисона, ревматоидного артрита, множественного склероза, саркоидоза, язвенного колита, множественной эритемы, нефропатии IgA, узелкового полиартрита, анкилозирующего спондилита, синдрома Гудпасчера, тромбоангиита, синдрома Шегрена, первичного билиарного цирроза, тиреоидита Хасимото, тиреотоксикоза, склеродермии, активного хронического гепатита, полимиозита/дерматомиозита, полихондрии, pamphigus vulgaris, гранулематоза Вегенера, мембранной нефропатии, бокового амиотрофического склероза, сухотки спинного мозга, височного артрита/полимиалгии, злокачественной анемии, быстро прогрессирующего гломерулонефрита, псориаза и фиброзирующего альвеолита.

Лечебные композиции содержат, по меньшей мере, одно гуманизированное, химерное или человеческое моноклональное антитело, которое присутствует само по себе или в сочетании с другими антителами, такими как другие гуманизированные, химерные или человеческие антитела, терапевтические средства или иммуномодуляторы. В частности, также предполагается комбинированная терапия с применением полностью человеческих антител, причем она производится описанными выше способами.

Конъюгированные антитела к одному и тому же или к отличному эпитопу или антигену могут быть также объединены с одним или несколькими антителами согласно изобретению. Например, гуманизированное, химерное или человеческое конъюгированное антитело против CD22 может быть объединено с другим приматизированным, гуманизированным, химерным или человеческим конъюгированным антителом против CD22, причем приматизированное, гуманизированное, химерное или человеческое конъюгированное антитело против CD22 может быть объединено с иммуноконъюгатом анти-CD22. С другой стороны, как описано выше, подобные разнообразные сочетания могут быть осуществлены с различными антителами, связанными с лимфомой. Слитый белок приматизированного, гуманизированного, химерного или человеческого антитела против CD22 и токсин или иммуномодулятор, или слитый белок, по меньшей мере, двух различных B-клеточных антител (например, mAb CD20 и CD22) также могут быть использованы в настоящем изобретении. Как уже было описано выше, может быть сконструировано большое количество отличающихся сочетаний антител, нацеленных, по меньшей мере, на два различных антигена, которые связаны с B-клетками или другими лимфомами или аутоиммунными расстройствами, либо частично конъюгированных с терапевтическим средством или иммуномодулятором, либо только в сочетании с другими терапевтическими средствами, такими как цитотоксические лекарственные препараты или радиация.

В рамках настоящего изобретения термин «иммуномодулятор» включает в себя цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, такие как факторы некроза опухолей (TNF), и гемопоэтические факторы, такие как интерлейкины (например, интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12 и IL-18), колониестимулирующие факторы (например, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) и колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF)), интерфероны (например, интерфероны -α, -β и -γ), фактор роста стволовых клеток, обозначенный «фактор S1», эритропоэтин и тромбопоэтин. Примеры подходящих иммуномодуляторных фрагментов включают в себя IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, интерферон-γ, TNF-α и т.п. С другой стороны, пациенты могут получать конъюгированные антитела против CD20 и отдельно вводимый цитокин, который может вводиться до, одновременно или после введения простых или конъюгированных антител против CD20. Как обсуждалось выше, антитело против CD22 также может быть конъюгировано с иммуномодулятором. Кроме этого иммуномодулятор может быть конъюгирован с гибридным антителом или фрагментами гибридного антитела или с субфрагментами (одноцепочечными связывающими белками или sFv'), состоящими из одного или нескольких антител или субфрагментов, связывающих различные антигены.

Мультимодальные способы лечения согласно изобретению дополнительно включают в себя иммунотерапию конъюгированными антителами против CD22, которая дополнена введением антител против CD20, CD19, CD21, CD74, CD80, CD23, CD46 или HLA-DR (включая инвариантную цепь) в форме слитых белков или в качестве иммуноконъюгатов. Эти антитела включают в себя поликлональные, моноклональные, приматизированные, химерные, человеческие или гуманизированныеантитела, которые распознают, по меньшей мере, один эпитоп на своих антигенных детерминантах. Антитела против CD19 и против CD22 известны специалистам в данной области. См., например, Ghetie et al., Cancer Res. 48: 2610 (1988); Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother. 32:364 (1991); Longo, Curr. Opin. Oncol. 8:353 (1996) и патенты Соединенных Штатов №№ 5798554 и 6187287, полностью включенные в настоящую заявку с помощью ссылки.

В другой форме мультимодальной терапии пациенты получают конъюгированные антитела и/или иммуноконъюгаты в сочетании со стандартной противораковой химиотерапией. Например, «CVB» (1,5 г/м² циклофосфамида, 200-400 мг/м² этопозида и 150-200 мг/м² кармустина) представляет собой способ, применяемый для лечения неходжкинской лимфомы. Patti et al., Eur. J. Haematol. 51:18 (1993). Другие подходящие сочетания химиотерапевтических способов лечения хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Freedman et al., "Non-Hodgkin's Lymphomas", в CANCER MEDICINE, VOLUME 2, 3^rd Edition, Holland et al., (eds.), pages 2028-2068 (Lea & Febiger 1993). В качестве иллюстрации первое поколение химиотерапевтических способов лечения неходжкинской лимфомы (NHL) промежуточной степени включает в себя C-MOPP (циклофосфамид, винкристин, прокарбазин и преднизон) и CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон). Применяемый химиотерапевтический способ лечения второго поколения представляет собой m-BACOD (метотрексат, блеомицин, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, дексаметазон и лейковорин), в то время как соответствующий способ лечения третьего поколения представляет собой MACOP-B (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, преднизон, блеомицин и лейковорин). Дополнительно применимые лекарственные средства включают в себя фенилбутират и бростатин-1. В предпочтительной мультимодальной терапии совместно с антителом, иммуноконъюгатом или слитым белком согласно изобретению вводятся как химиотерапевтические препараты, так и цитокины. Цитокины, химиотерапевтические препараты и антитела или иммуноконъюгаты могут вводиться в любом порядке или вместе.

Радионуклиды, пригодные в качестве терапевтических средств, которые в основном распадаются с излучением бета-частиц, включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, Ac-225, P-32, P-33, Sc-47, Fe-59, Cu-64, Cu-67, Se-75, As-77, Sr-89, Y-90, Mo-99, Rh-105, Pd-109, Ag-111, I-125, I-131, Pr-142, Pr-143, Pm-149, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-198, Au-199, Pb-211, Pb-212 и Bi-213. Максимальные энергии распада применимых нуклидов, излучающих бета-частицы, предпочтительно находятся в диапазоне 20-5000 кэВ, более предпочтительно 100-4000 кэВ и наиболее предпочтительно 500-2500 кэВ.

Радионуклиды, пригодные в качестве терапевтических средств, которые в основном распадаются с испусканием Аугеровских частиц, включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m и Ir-192. Максимальная энергия распада этих радионуклидов предпочтительно менее 1000 кэВ, более предпочтительно менее 100 кэВ и наиболее предпочтительно менее 70 кэВ.

Радионуклиды, пригодные в качестве терапевтических средств, которые в основном распадаются с испусканием альфа-частиц, включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 и Fm-255. Энергии распада применимых радионуклидов, излучающих альфа-частицы, предпочтительно составляют 2000-9000 кэВ, более предпочтительно 3000-8000 кэВ и наиболее предпочтительно 4000-7000 кэВ.

Радионуклиды, применимые в терапии, основанной на процессе захвата нейтронов, включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, B-10, Gd-157 и U-235.

Варианты осуществления данного изобретения могут быть дополнительно проиллюстрированы с помощью примеров, которые подробно показывают различные аспекты изобретения. Эти примеры иллюстрируют конкретные элементы изобретения и не призваны ограничивать область действия изобретения.

ПРИМЕРЫ

Антитела

Эпратузумаб представляет собой гуманизированноеантитело LL2, причем он был разработан Immunomedics Inc., Morris Plains, NJ. Процесс гуманизации замещает около 95% мышиной последовательности Ig на человеческую последовательность IgG₁. Эпратузумаб интернализуется при связывании с B-эпитопом антигена CD22 (Stein, R. et al., Cancer Immunol. Immunother.37(5):293-8, 1993), который соответствует третьей области Ig (Kehrl J.H. B6 CD22 Workshop Panel Report в Leukocyte Typing V. White Cell Differentiation Antigens., S.F. Schlossman (ed.), Oxford University Press, p. 523-5, 1995). Интернализация in vitro наблюдалась после пяти минут, и повторная экспрессия 50% антигена, как сообщалось, имела место через 5 часов (Shih L.B. et al. Int J Cancer56 (4):538-45, 1994).

Гуманизированное антитело против CD20, hA20, было разработано Immunomedics Inc., Morris Plains, NJ. Это Mab связывается с CD20 и, в противоположность химерному Mab против CD20, т.е. ритуксимабу, оно представляет собой Mab с трансплантированной CDR, которая содержит меньше мышиного белка, чем химерная форма. Mab hA20 имеет константные области IgG1 (каппа) и такие же человеческие каркасные V-области, как эпратузумаб, т.е. гуманизированноеMab CD22. Гены CDR-трансплантированных VH- и Vκ-цепей hA20 были включены в плазмидный вектор pdHL2, т.е. систему экспрессии на основе DHFR, пригодную для амплификации, и трансфицированы в линию клеток мышиной миеломы Sp2/0 для получения клонов, вырабатывающих hA20. Исследование строения молекулы показывает, что в областях CDR hA20 сходно с ритуксимабом, за исключением различия в одной аминокислоте в области VH. Однако благодаря включению более человеческих конструкций присутствуют различия в областях каркаса VH и Vκ hA20. Антитело hA20, по-видимому, конкурирует с ритуксимабом за связывание с различными клетками лимфомы и имеет сходную с ритуксимабом константу диссоциации, а также аналогичное действие in vivo и in vitro против линий клеток лимфомы человека, экспрессирующих CD20.

Терапия неходжкинской лимфомы (NHL)

Пациентом является мужчина 66 лет с IV стадией диффузной крупноклеточной NHL, повторно заболевший после 3 курсов химиотерапии, которые были проведены в предшествующие два года. Ему вводят дозу, состоящую из двух инъекций⁹⁰Y-DOTA-эпратузумаба (меченого в соответствии с Govinden, см. ссылку выше), разделенных сроком в одну неделю, содержащих 7,5 мКи/м²⁹⁰Y и введенных путем внутривенного вливания вместе с общей дозой белкового антитела 30 мг в каждой инъекции. Спустя шесть недель оказалось, что его шейные лимфатические узлы и имевшееся у него увеличение селезенки заметно уменьшились, пациенту стало легче в отношении проявления симптомов болезни, и он вернулся к работе в течение полного рабочего дня. Поскольку полной ремиссии не было достигнуто, ему была назначена продолжительная терапия, включающая в себя сочетание эпратузумаба (360 мг/м²) и hA20 (250 мг/м²), которые вводят раз в две недели, всего 4 вливания, после чего курс комбинированной терапии с помощью антител повторяют спустя 12 недель. Через три месяца после завершения второго курса лечения с помощью сочетания простых антител CD22 и CD20 у пациента не обнаружили признаков заболевания в ходе радиологического исследования или биопсии костного мозга, и, таким образом, считается, что он полностью излечен. При следующем обследовании спустя 3 месяца он по-прежнему находится в состоянии полной ремиссии в отношении своего заболевания.

Терапия T-клеточной лейкемии

Пациенту со стойкой Т-клеточной лейкемией, подвергшемуся предварительной химиотерапии, проводят вливание 50 мг гуманизированногоMab против CD25, конъюгированного с 20 мКи/м²⁹⁰Y-DOTA, через неделю после которой осуществляют вливание CD25 Mab (гуманизированноеанти-TAC-антитело) в количестве 200 мг/м². Спустя четыре недели анализ крови пациента и биопсия костного мозга показали частичную ремиссию заболевания.

Терапия рефракционного ревматоидного артрита

Пациент с тяжелым прогрессирующим ревматоидным артритом, затрагивающим большое количество суставов, но в особенности колени, и в настоящее время проходящий курс химиотерапии, подвергается лечению однократным вливанием смеси гуманизированныхMab CD4 и CD20 в общем количестве 50 мг, которые мечены⁹⁰Y при дозе 10 мКи/м². Спустя две недели ему вводят дозу простых гуманизированныхантител, состоящую из 100 мг антител CD4 и 250 мг антител CD20, причем это введение повторяют еще раз спустя две недели. Спустя 4 недели пациент почувствовал облегчение артрита, особенно в отношении колен, стал лучше ходить и даже подниматься по лестницам, как было отмечено его врачом, почти без сопутствующего воспаления. Через три месяца повторяют описанный курс терапии, включающий одно вливание смеси антител, меченных радиоактивной меткой, с последующими двумя вливаниями простых антител CD4 и CD20, причем состояние здоровья пациента повторно оценивают через 6 недель. Врач отметил заметное улучшение, так что пациент ощущает только минимальную боль и значительно лучшую подвижность конечностей.

Хотя в предыдущем тексте осуществлялись ссылки на отдельные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что изобретение не ограничивается этими ссылками. Специалисту в данной области понятно, что в описанное изобретение могут быть внесены многочисленные модификации, и предполагается, что подобные модификации находятся в рамках настоящего изобретения, которые определены следующими вариантами осуществления.

Все публикации, заявки на патенты и патенты, цитированные в настоящем описании, полностью включены в заявку с помощью ссылок.

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунотерапии. Предложено применение (i) конъюгированного анти-CD74-антитела и неконъюгированного анти-СD20-антитела, слитого с анти-СD20-антителом белка, который содержит антиген-связывающую молекулу, в которой связаны два или более сегментов одинаковых или различных одноцепочечных антител или фрагментов антител с одинаковой или различной специфичностью, или фрагмент анти-СD20-антитела, либо (ii) конъюгированного анти-СD20-антитела и неконъюгированного анти-СD74-антитела, слитого с анти-СD74-антителом белка, который содержит продуцируемую рекомбинантным путем антиген-связывающую молекулу, в которой связаны два или более сегментов одинаковых или различных одноцепочечных антител или фрагментов антител с одинаковой или различной специфичностью, или фрагмент анти-СD74-антитела, в производстве лекарственного средства для лечения у млекопитающего злокачественного заболевания, связанного с В-клетками, заболевания, связанного с Т-клетками, или аутоиммунного заболевания. Сочетание анти-СD74- и анти-CD-20-антител, как заявлено в настоящем изобретении, обеспечивает повышение эффективности иммунотерапии без побочных токсических эффектов. 38 з.п. ф-лы.

Формула