Рекомбинантные вирусные векторы с модифицированным тропизмом и пути их применения для нацеленного введения генетического материала в клетки человека - RU2020101279A
Код документа: RU2020101279A
Формула
1. Рекомбинантный вирусный капсидный белок, содержащий эпитоп, который является гетерологичным по отношению к капсидному белку,
где гетерологичный эпитоп или его часть специфически связывают паратоп антитела, и
где вирусный капсидный белок образует рекомбинантный вирусный капсид с пониженным или устраненным природным тропизмом.
2. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по п. 1, где длина эпитопа составляет по меньшей мере 1 аминокислоту.
3. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по п. 1 или 2, содержащий замену, вставку или делецию в аминокислотном положении, связанном с природным тропизмом вирусного капсида, так что рекомбинантный вирусный капсидный белок образует вирусный капсид с пониженным вплоть до устраненного природным тропизмом.
4. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по пп. 1-3, где вирусный капсидный белок получен с помощью гена капсида аденоассоциированного вируса (AAV), где необязательно гетерологичный эпитоп вставлен в положении, выбранном из группы, состоящей из I587 из AAV2, I585 из AAV6, I590 из AAV8, I453 из AAV9, I589 из AAV9 и любых соответствующих аминокислот серотипа AAV, который инфицирует приматов, где необязательно серотип AAV, который инфицирует приматов, выбран из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 и AAV9.
5. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по п. 4, где аденоассоциированный вирус представляет собой AAV2.
6. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по п. 4, где аденоассоциированный вирус представляет собой AAV6.
7. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по п. 4, где аденоассоциированный вирус представляет собой AAV8.
8. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по п. 4, где аденоассоциированный вирус представляет собой AAV9.
9. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по любому из пп. 1-8, где
(i) вирусный капсидный белок представляет собой генетически модифицированный капсидный белок VP1 AAV2, и эпитоп вставлен после аминокислоты в положении I453 или I587 и/или заменяет ее;
(ii) вирусный капсидный белок представляет собой генетически модифицированный капсидный белок VP1 AAV6, и эпитоп вставлен после аминокислоты в положении I585 и/или заменяет ее;
(iii) вирусный капсид представляет собой генетически модифицированный капсидный белок VP1 AAV8, и эпитоп вставлен после аминокислоты в положении I590 и/или заменяет ее;
(iv) вирусный капсидный белок представляет собой генетически модифицированный капсидный белок VP1 AAV9, и эпитоп вставлен после аминокислоты в положении I453 или I589 и/или заменяет ее.
10. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по любому из пп. 1-9, где вирусный капсидный белок кодируется геном капсида AAV2, модифицированным для экспрессии эпитопа, фланкированого аминокислотами N587 и R588 капсидного белка VP1 AAV2.
11. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по любому из пп. 1-9, где вирусный капсидный белок получен с помощью гена капсида AAV6, и эпитоп вставлен непосредственно после аминокислоты Q585.
12. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по любому из пп. 1-9, где вирусный капсидный белок получен с помощью гена капсида AAV8, и где эпитоп вставлен непосредственно после аминокислоты N590 капсидного белка VP1 AAV8.
13. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по любому из пп. 1-9, где вирусный капсидный белок получен с помощью гена капсида AAV9, эпитоп вставлен в капсидный белок после аминокислоты в положении G453 или A589 капсидного белка VP1 AAV9 и/или заменяет ее, и где капсидный белок при этом содержит дополнительную мутацию.
14. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по п. 13, где дополнительная мутация представляет собой W503A.
15. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по любому из пп. 1-14, где эпитоп содержит аминокислотную последовательность EQKLISEEDL, при этом эта аминокислотная последовательность или ее часть специфически связывает паратоп антитела, и необязательно.
16. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по любому из пп. 1-15, где эпитоп содержит аминокислотную последовательность EQKLISEEDL, при этом эта аминокислотная последовательность или ее часть специфически связывает паратоп антитела, и
где аминокислотная последовательность EQKLISEEDL фланкирована по меньшей мере 5 смежными аминокислотами капсидного белка AAV и функционально связана с ними.
17. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по п. 16, где вирусный капсидный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:2, аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:4, аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:25, аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:26, или аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:27.
18. Рекомбинантный вирусный капсидный белок по любому из пп. 1-17, где рекомбинантный вирусный капсидный белок или вирусный капсид, содержащий рекомбинантный вирусный капсидный белок, не способны инфицировать клетку-мишень в отсутствие полиспецифической связывающей молекулы, содержащей паратоп антитела, где необязательно в отсутствие полиспецифической связывающей молекулы, содержащей паратоп антитела, эффективность трансдукции вирусного капсидного белка или вирусного капсида, содержащего рекомбинантный вирусный капсидный белок,
(i) понижена на по меньшей мере 10%,
(ii) понижена на по меньшей мере 20%,
(iii) понижена на по меньшей мере 30%,
(iv) понижена на по меньшей мере 40%,
(v) понижена на по меньшей мере 50%,
(vi) понижена на по меньшей мере 60%,
(vii) понижена на по меньшей мере 70%,
(viii) понижена на по меньшей мере 80%,
(ix) понижена на по меньшей мере 90% или
(x) устранена.
19. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный вирусный капсидный белок по любому из пп. 1-18.
20. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 19, где нуклеотидная последовательность кодирует рекомбинантный вирусный капсидный белок, который содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:2, аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:4, аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:25, аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:26, или аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:27.
21. Рекомбинантный вирусный вектор, содержащий представляющий интерес нуклеотид, заключенный в рекомбинантный вирусный капсид по п. 20, где необязательно рекомбинантный вирусный капсид является мозаичным капсидом.
22. Рекомбинантный вирусный вектор по п. 21, где представляющий интерес нуклеотид находится под контролем промотора, выбранного из группы, состоящей из вирусного промотора, бактериального промотора, промотора млекопитающего, промотора птицы, промотора рыбы, промотора насекомого и любой их комбинации.
23. Рекомбинантный вирусный вектор по п. 22, где представляющий интерес нуклеотид находится под контролем промотора, отличного от человеческого.
24. Рекомбинантный вирусный вектор по п. 23, где представляющий интерес нуклеотид фланкирован последовательностями ITR AAV.
25. Рекомбинантный вирусный вектор по любому из пп. 21-24, где представляющим интерес нуклеотидом является репортерный ген.
26. Рекомбинантный вирусный вектор по п. 25, где репортерный ген кодирует зеленый флуоресцентный белок.
27. Рекомбинантный вирусный вектор по любому из пп. 21-24, где представляющий интерес нуклеотид выбран из группы, состоящей из суицидного гена, нуклеотида, кодирующего антитело или его фрагмент, нуклеотида, кодирующего систему CRISPR/Cas или ее часть(части), нуклеотида, кодирующего антисмысловую РНК, нуклеотида, кодирующего siRNA, и их комбинации.
28. Композиция, содержащая (а) рекомбинантный вирусный вектор по любому из пп. 21-27 и (b) полиспецифическую связывающую молекулу, содержащую паратоп антитела, который специфически связывает эпитоп, где необязательно полиспецифическая связывающая молекула дополнительно содержит перенацеливающий лиганд, который специфически связывает рецептор, экспрессируемый на клетке-мишени, где полиспецифическая связывающая молекула необязательно является биспецифической связывающей молекулой.
29. Композиция по п. 28, где вирусный вектор и полиспецифическая связывающая молекула присутствуют в соотношении 1:4.
30. Композиция по п. 28 или 29, где паратоп антитела представляет собой Fv-домен.
31. Композиция по п. 30, где Fv-домен непосредственно слит с константным доменом тяжелой цепи.
32. Композиция по любому из пп. 28-31, где перенацеливающий лиганд представляет собой антитело или его часть.
33. Композиция по любому из пп. 28-32, где полиспецифическая связывающая молекула представляет собой биспецифическое антитело, и
где каждый из паратопа и перенацеливающего лиганда содержит отдельный Fv-домен, слитый с первым и вторым константным доменом тяжелой цепи.
34. Композиция по п. 33, где первая и вторая тяжелые цепи связываются с белком А с разными значениями аффинности связывания.
35. Композиция по любому из пп. 28-32, где полиспецифическая связывающая молекула представляет собой биспецифическое антитело, и
где перенацеливающий лиганд содержит антитело с тетрамерной структурой, содержащее две идентичные тяжелые цепи иммуноглобулина и две идентичные легкие цепи, и
где паратоп, который связывает гетерологичный эпитоп, присоединен к C-концу или N-концу одной или обеих тяжелых цепей и/или к C-концу или N-концу одной или обеих тяжелых цепей.
36. Композиция по п. 35, где паратоп представляет собой scFv, где необязательно scFv содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:37.
37. Композиция по любому из пп. 28-36, где гетерологичный эпитоп содержит аминокислотную последовательность EQKLISEEDL или ее часть, и где паратоп антитела специфически связывает аминокислотную последовательность EQKLISEEDL или ее часть.
38. Композиция по любому из пп. 28-37, где перенацеливающий лиганд специфически связывает белок клеточной поверхности, который представляет собой маркер клеточной поверхности.
39. Композиция по п. 38, где маркер клеточной поверхности представляет собой асиалогликопротеин 1 (ASGR1).
40. Композиция по п. 38, где маркер клеточной поверхности представляет собой CD3.
41. Композиция по п. 38, где маркер клеточной поверхности представляет собой ENTPD3.
42. Композиция по любому из пп. 28-41, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
43. Способ направления рекомбинантного вирусного вектора по любому из пп. 21-27 на клетку-мишень, включающий
приведение в контакт рекомбинантного вирусного вектора с полиспецифической связывающей молекулой,
где полиспецифическая связывающая молекула содержит (i) паратоп антитела, который специфически связывает эпитоп, и (ii) перенацеливающий лиганд, который специфически связывает белок, экспрессируемый на поверхности клетки-мишени.
44. Способ по п. 43, где клетка-мишень находится в условиях in vivo.
45. Способ по п. 43 или 44, где указанное приведение в контакт выполняют ex vivo.
46. Способ доставки представляющего интерес нуклеотида в клетку-мишень, экспрессирующую белок клеточной поверхности, включающий приведение в контакт клетки-мишени с композицией по любому из пп. 28-42, где полиспецифическая связывающая молекула содержит перенацеливающий лиганд, который связывает белок клеточной поверхности.
47. Способ по п. 46, где клетка-мишень находится в условиях in vitro.
48. Способ по п. 46, где клетка-мишень находится в условиях in vivo в субъекте.
49. Способ по п. 48, где субъектом является человек.
50. Способ по любому из пп. 46-49, где клетка-мишень является клеткой человека.
51. Способ по любому из пп. 46-50, где клетка-мишень выбрана из группы, состоящей из клетки печени, клетки головного мозга, Т-клетки, клетки почки, клетки кишечника, клетки поджелудочной железы, раковой клетки и клетки, инфицированной гетерологичным патогеном.
52. Способ по любому из пп. 46-51, где клетка-мишень является клеткой печени человека.
53. Способ по любому из пп. 46-52, где белок клеточной поверхности представляет собой асиалогликопротеиновый рецептор 1 человека (hASGR1).
54. Способ по любому из пп. 46-51, где клетка-мишень является Т-клеткой человека.
55. Способ по п. 54, где белок клеточной поверхности представляет собой CD3.
56. Способ по любому из пп. 46-51, где белок клеточной поверхности представляет собой рецептор глюкагона человека (hGCGR).
57. Способ по любому из пп. 46-50, где клетка-мишень является клеткой кишечника.
58. Способ по любому из пп. 46-50, где клетка-мишень является клеткой поджелудочной железы.
59. Способ по п. 57 и 58, где белок клеточной поверхности представляет собой ENTPD3.
60. Способ инактивации вирусного капсидного белка, включающий
(a) вставку нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный эпитоп, в последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вирусный капсидный белок, с образованием нуклеотидной последовательности, кодирующей генетически модифицированный капсидный белок, содержащий гетерологичный эпитоп, и
(b) культивирование упаковывающей клетки в условиях, достаточных для продуцирования вирусных векторов, где упаковывающая клетка содержит нуклеотидную последовательность.
61. Способ получения вирусного вектора, включающий культивирование упаковывающей клетки в условиях, достаточных для продуцирования вирусных векторов, где упаковывающая клетка содержит плазмиду, кодирующую рекомбинантный капсидный белок по любому из пп. 1-18.
62. Способ по п. 60 или 61, где упаковывающая клетка дополнительно содержит плазмиду-помощника и/или плазмиду для переноса, содержащую представляющий интерес нуклеотид.
63. Способ по любому из пп. 60-62, дополнительно включающий выделение самокомплементарных векторов на основе аденоассоциированного вируса из культурального супернатанта.
64. Способ по любому из пп. 60-63, дополнительно включающий осуществление лизиса упаковывающей клетки и выделение однонитевых векторов на основе аденоассоциированного вируса из клеточного лизата.
65. Способ по любому из пп. 60-64, дополнительно включающий
a. удаление клеточного дебриса,
b. обработку супернатанта, содержащего вирусные векторы, ДНКазой I и MgCl2,
c. концентрирование вирусных векторов,
d. очистку вирусных векторов и
e. любую комбинацию a.-d.
66. Вирусный вектор, полученный согласно способу по любому из пп. 60-65.
67. Упаковывающая клетка для получения вирусного вектора, содержащая плазмиду, кодирующую капсидный белок по любому из пп. 1-18.
68. Связывающая молекула, содержащая паратоп, который связывает SEQ ID NO:6, где паратоп содержит последовательности HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3 из scFv, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной под SEQ ID NO:28.
69. Связывающая молекула по п. 68, где паратоп антитела представляет собой Fv-домен.
70. Связывающая молекула по п. 69, где Fv-домен непосредственно слит с константным доменом тяжелой цепи.
71. Связывающая молекула по любому из пп. 68-70, где связывающая молекула представляет собой биспецифическое антитело и дополнительно содержит перенацеливающий лиганд, и
где каждый из паратопа и перенацеливающего лиганда содержит отдельный Fv-домен, слитый с первым и вторым константным доменом тяжелой цепи.
72. Связывающий белок по п. 71, где первая и вторая тяжелые цепи связываются с белком А с разными значениями аффинности связывания.
73. Связывающий белок по любому из пп. 68-69, где связывающая молекула представляет собой биспецифическое антитело и дополнительно содержит перенацеливающий лиганд, и
где перенацеливающий лиганд содержит антитело с тетрамерной структурой, содержащее две идентичные тяжелые цепи иммуноглобулина и две идентичные легкие цепи, и
где паратоп присоединен к C-концу или N-концу одной или обеих тяжелых цепей и/или к C-концу или N-концу одной или обеих тяжелых цепей.
74. Связывающий белок по п. 73, где паратоп представляет собой scFv, где необязательно scFv содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:37.
75. Связывающий белок по любому из пп. 69-72, дополнительно содержащий перенацеливающий лиганд, который представляет собой антитело или его часть.
76. Связывающий белок по п. 75, где перенацеливающий лиганд специфически связывает белок клеточной поверхности, который представляет собой маркер клеточной поверхности.
77. Связывающий белок по п. 76, где маркер клеточной поверхности представляет собой асиалогликопротеин 1 (ASGR1).
78. Связывающий белок по п. 76, где маркер клеточной поверхности представляет собой CD3.
79. Связывающий белок по п. 76, где маркер клеточной поверхности представляет собой GCGR.
80. Связывающий белок по п. 76, где маркер клеточной поверхности представляет собой ENTPD3.
81. Композиция, содержащая (а) рекомбинантный вирусный вектор по любому из пп. 21-27 и (b) связывающий белок по любому из пп. 68-81.
82. Композиция по п. 81, где вирусный вектор и полиспецифическая связывающая молекула присутствуют в соотношении 1:4.
83. Композиция по п. 81 или 82, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
