Иммунологически привилегированные биоактивные почечные клетки для лечения заболевания почек - RU2020102017A
Код документа: RU2020102017A
Формула
1. Способ получения геномно модифицированной биоактивной почечной клетки (БПК), включающий генетическое модифицирование в БПК отвечающего за иммуногенность геномного гена, который кодирует белок в молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или молекуле MHC класса II.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ген представляет собой ген B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 или HLA-DQB1.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетическое модифицирование гена включает внесение мутации в ген.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что внесение мутации в ген включает делецию гена или его части.
5. Способ по п. 3, включающий внесение мутации в любое сочетание из двух или более из генов B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 и/или HLA-DQB1.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что БПК представляет собой селективную почечную клетку (СПК).
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что СПК находится в популяции СПК.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что СПК представляет собой клетку почечного канальца.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что клетка почечного канальца представляет собой клетку проксимального канальца.
10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что СПК представляет собой эндокринную, сосудистую или гломерулярную клетку.
11. Способ по п. 7, отличающийся тем, что популяция СПК содержит устойчивые к гипоксии и устойчивые к йодиксанолу клетки.
12. Способ по п. 7, отличающийся тем, что популяция СПК содержит клетки, которые экспрессируют синтазу гиалуроновой кислоты 2.
13. Способ по п. 7, отличающийся тем, что популяция СПК содержит клетки, которые способны к рецептор-опосредованному переносу альбумина.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетическое модифицирование гена включает (i) экспрессию редактирующего ген белка в БПК; или (ii) доставку редактирующего ген белка через клеточную мембрану БПК.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что редактирующий ген белок представляет собой нуклеазу «цинковые пальцы» (ZFN), эффекторную нуклеазу, подобную активаторам транскрипции (TALEN), megaTAL или управляемую при помощи гид-РНК эндонуклеазу.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что управляемая при помощи гид-РНК эндонуклеаза представляет собой белок Cas.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что белок Cas представляет собой белок Cas9.
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что генетическое модифицирование гена дополнительно включает (i) экспрессию гид-РНК (гРНК) в БПК; или (ii) доставку гид-РНК (гРНК) через клеточную мембрану БПК.
19. Способ по п. 18, при этом белок Cas9 и гРНК являются частью рибонуклеопротеидного комплекса.
20. Способ по п. 1, дополнительно включающий культивирование БПК для получения потомства с генетической модификацией в гене.
21. Способ по п. 20, при этом потомство имеют меньшую вероятность иммунного отторжения в сравнении с соответствующими клетками, которые не имеют генетическую модификацию в гене.
22. Способ по п. 15, отличающийся тем, что редактирующий ген белок экспрессируется с трансфицированной мРНК.
23. Способ по п. 15, отличающийся тем, что редактирующий ген белок представляет собой рекомбинантный белок и находится в комплексе с гРНК ex vivo.
24. Способ по п. 15, отличающийся тем, что редактирующий ген белок представляет собой рекомбинантный белок, находится в комплексе с гРНК ex vivo, и комплекс белок/гРНК доставляют в клетку путем трансфекции, липофекции, электропорации или микроинъекции.
25. Способ по п. 17, отличающийся тем, что дополнительные элементы нуклеиновой кислоты, кодирующие селективный маркер и/или конкретные мутации гена-мишени, вводят в клетку совместно с комплексом белок Cas9/гРНК.
26. Способ по п. 18, отличающийся тем, что белок Cas экспрессируется с трансфицированной мРНК, и гРНК экспрессируется с плазмидной ДНК.
27. Способ по п. 22, отличающийся тем, что трансфицированная мРНК стабилизирована за счет включения модифицированных нуклеотидных оснований или последовательностей полиаденилирования.
28. Способ по п. 22, отличающийся тем, что трансфицированная мРНК связана с по меньшей мере одним проникающим в клетку пептидом.
29. Способ по п. 16, отличающийся тем, что белок Cas экспрессируется с ДНК вектора.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что экспрессию белка Cas индуцируют в течение по меньшей мере части времени, в течение которого гРНК экспрессируется в клетке.
31. Способ по п. 29, отличающийся тем, что ДНК вектор не интегрируется в геном.
32. Способ по п. 29, отличающийся тем, что ДНК вектор представляет собой эписомный вектор или искусственную хромосому.
33. Способ по п. 29, отличающийся тем, что ДНК вектор представляет собой транспозон.
34. Способ по п. 18, отличающийся тем, что гРНК представляет собой транскрипт с ДНК вектора.
35. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетическое модифицирование гена приводит к уменьшению количества MHC класса I на поверхности клетки.
36. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетическое модифицирование гена приводит к уменьшению количества MHC класса II на поверхности клетки.
37. Способ по п. 1, включающий генетическое модифицирование двух или более генов, при этом по меньшей мере один из генов кодирует белок в молекуле MHC класса I и по меньшей мере один из генов кодирует белок в молекуле MHC класса II.
38. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один из генов представляет собой ген HLA.
39. Способ по п. 1 для получения БПК, предназначенной для использования в качестве лекарственного средства.
40. Способ по п. 1 для получения БПК, предназначенной для лечения хронической почечной недостаточности у пациента.
41. Способ по п. 20, дополнительно включающий размножение потомства клеток.
42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что размножение потомства включает пересев потомства по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 раз.
43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что кинетику роста клеток контролируют при каждом пересеве.
44. Способ по п. 41, отличающийся тем, что количество клеток и жизнеспособность потомства контролируют методом с исключением красителя трипанового синего и методом анализа метаболизма PrestoBlue.
45. Способ по п. 7, отличающийся тем, что СПК экспрессирует CK18.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что СПК экспрессирует GGT1.
47. Способ по п. 41, отличающийся тем, что метаболизм PrestoBlue и продуцирование VEGF и KIM-1 используют в качестве маркеров присутствия жизнеспособного и функционального потомства.
48. Способ по п. 44, отличающийся тем, что функциональность БПК или СПК дополнительно оценивают путем профилирования генной экспрессии или измерения ферментативной активности.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что ферментативную активность измеряют для LAP и/или GGT.
50. Способ по п. 1, отличающийся тем, что БПК получают путем биопсии почки.
51. Популяция генетически модифицированных БПК, получаемых способом по п. 1.
52. Генетически модифицированная БПК, имеющая мутацию в гене, кодирующем белок в молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или молекуле MHC класса II.
53. Генетически модифицированная БПК по п. 52, в которой по меньшей мере часть гена была делетирована, при этом ген представляет собой ген B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 или HLA-DQB1.
54. Способ лечения заболевания почек у пациента, включающий введение популяции БПК пациенту, при этом популяция БПК содержит генетически модифицированные БПК, при этом генетически модифицированные БПК имеют мутацию в гене, кодирующем белок в молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или молекуле MHC класса II.
55. Способ по п. 54, при этом заболевание почек представляет собой хроническую почечную недостаточность.
56. Способ по п. 54, отличающийся тем, что популяция БПК представляет собой популяцию СПК.
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что популяция СПК получена от пациента.
58. Способ по п. 56, отличающийся тем, что популяция СПК получена от одного или более доноров.
59. Способ по п. 56, отличающийся тем, что популяция СПК получена после воздействия гипоксических условий культивирования.
60. Способ по п. 56, отличающийся тем, что популяция СПК получена после разделения в градиенте плотности размноженных почечных клеток.
61. Способ по п. 56, при этом популяция СПК имеет плавучую плотность более примерно 1,0419 г/мл.
62. Способ по п. 56, при этом популяция СПК содержит большую процентную долю одного или более типов клеток и лишена, или содержит меньшее количество, одного или более других типов клеток, в сравнении с исходной популяцией почечных клеток.
63. Инъекционный препарат, включающий
a) термочувствительный стабилизирующий клетки биологический материал и
b) популяцию БПК, при этом популяция БПК включает генетически модифицированные БПК, при этом генетически модифицированные БПК имеют мутацию в гене, кодирующем белок в молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I или молекуле MHC класса II,
при этом термочувствительный стабилизирующий клетки биологический материал представляет собой гидрогель, который
(i) сохраняет практически твердое состояние при температуре примерно 8°C или ниже, при этом практически твердое состояние представляет собой состояние геля,
(ii) сохраняет практически жидкое состояние при температуре около температуры окружающей среды или выше, и
(iii) имеет переходное состояние из твердого тела в жидкость в диапазоне температур от примерно 8°C до температуры окружающей среды или выше.
64. Инъекционный препарат по п. 63, отличающийся тем, что гидрогель содержит внеклеточный матриксный белок рекомбинантного происхождения, получен из внеклеточного матрикса почки, либо другой ткани или органа, или содержит желатин.
65. Инъекционный препарат по п. 64, отличающийся тем, что желатин получен из коллагена типа I, альфа-1.
66. Инъекционный препарат по п. 65, отличающийся тем, что желатин получен из свиного коллагена типа I, альфа-1, или рекомбинантного человеческого коллагена типа I, альфа-1.
67. Инъекционный препарат по п. 63, отличающийся тем, что популяция БПК представляет собой популяцию селективных почечных клеток (СПК), и генетически модифицированные БПК представляют собой генетически модифицированные СПК.
68. Способ лечения заболевания почек у пациента, включающий введение инъекцией препарата по п. 61 пациенту, при этом препарат инъецируют через иглу 18-30 калибра.
69. Способ по п. 68, при этом игла имеет диаметр, соответствующий примерно 27 калибру, примерно 26 калибру, примерно 25 калибру, примерно 24 калибру, примерно 23 калибру, примерно 22 калибру, примерно 21 калибру или примерно 20 калибру.
