Связывающие молекулы - RU2007106728A

Реферат

1. Способ получения антитела, имеющего только тяжелые цепи V_H, в трансгенном млекопитающем, предусматривающий этап экспрессии гетерологичного локуса тяжелой цепи V_H в млекопитающем, где локус тяжелой цепи V_H содержит константную область тяжелой цепи, которая не кодирует домен C_H1, при этом при экспрессии указанный локус способен формировать антитела, имеющие только тяжелые цепи, определенного класса или классов.

2. Способ получения антитела верблюда, имеющего только тяжелые цепи V_H (V_HH), в трансгенном млекопитающем, предусматривающий этап экспрессии локуса тяжелой цепи V_H (V_HH) верблюда в млекопитающем, где локус тяжелой цепи V_HH содержит константную область тяжелой цепи, которая не кодирует домен C_H1, при этом при экспрессии указанный локус способен формировать антитела, имеющие только тяжелые цепи, определенного класса или классов.

3. Способ по пп.1 и 2, в котором локус тяжелой цепи V_H или тяжелой цепи V_H (V_HH) верблюда содержит один или более генных сегментов V.

4. Способ по п.3, в котором указанные один или более генных сегментов V выбраны или сконструированы для получения улучшенных показателей растворимости.

5. Способ по п.4, в котором указанные один или более генных сегментов V получают у человека.

6. Способ по п.1 или 2, в котором константная область тяжелой цепи содержит один или более изотипов гена константной области Cα тяжелой цепи.

7. Способ по п.1 или 2, в котором константная область тяжелой цепи содержит один или несколько изотипов гена константной области Cε тяжелой цепи.

8. Способ по п.1 или 2, в котором константная область тяжелой цепи содержит один или несколько изотипов гена константной области Cδ тяжелой цепи.

9. Способ по п.1 или 2, в котором константная область тяжелой цепи содержит один или несколько изотипов гена константной области Cγ тяжелой цепи.

10. Способ по п.1 или 2, в котором константная область тяжелой цепи содержит один или несколько изотипов гена константной области Cμ тяжелой цепи.

11. Способ по п.1 или 2, в котором константная область тяжелой цепи содержит более одной из следующих константных областей тяжелой цепи: Cα, Cε, Cδ, Cγ, Cμ .

12. Способ по п.1 или 2, в котором локус тяжелой цепи V_H содержит вариабельную область, содержащую по меньшей мере один генный сегмент V верблюда или другого животного, по меньшей мере один генный сегмент D и по меньшей мере один генный сегмент J, где генный сегмент V, генный сегмент D и генный сегмент J способны к рекомбинации с образованием VDJ-кодирующей последовательности.

13. Способ по п.12, в котором локус тяжелой цепи содержит двадцать или более генных сегментов D.

14. Способ по п.12, в котором локус тяжелой цепи содержит пять или более генных сегментов J.

15. Способ по п.12, в котором по меньшей мере один генный сегмент D и по меньшей мере один генный сегмент J получены от верблюда.

16. Способ по п.12, в котором по меньшей мере один генный сегмент D и по меньшей мере один генный сегмент J получены от позвоночного, не исключая верблюда.

17. Способ по п.16, в котором по меньшей мере один генный сегмент D и по меньшей мере один генный сегмент J получены от млекопитающего.

18. Способ по п.12, в котором по меньшей мере один генный сегмент D и по меньшей мере один генный сегмент J получены от человека.

19. Способ по п.1 или 2, в котором петля CDR3 получена от одного вида позвоночного животного.

20. Способ по п.19, в котором петля CDR3 получена либо от верблюда, либо от человека.

21. Способ по п.1 или 2, в котором локус тяжелой цепи V_H или тяжелой цепи V_H (V_HH ) верблюда дополнительно содержит рекомбинантную последовательность (rss), способную к рекомбинации генного сегмента J непосредственно с геном константной области тяжелой цепи.

22. Способ по п.1 или 2, в котором ген константной области тяжелой цепи гетерологичного локуса тяжелой цепи является геном верблюда.

23. Способ по п.1 или 2, в котором ген константной области тяжелой цепи гетерологичного локуса тяжелой цепи происходит от позвоночного, не являющегося верблюдом.

24. Способ по п.23, в котором ген константной области тяжелой цепи гетерологичного локуса тяжелой цепи является человеческим.

25. Способ по п.1 или 2, в котором константная область не происходит от тяжелой цепи.

26. Способ по п.1 или 2, в котором B-клеточное созревание по существу является нормальным.

27. Антитело, имеющее только тяжелые цепи, или его фрагмент или смесь классов антител, имеющих только тяжелые цепи, полученные или получение которых возможно согласно способу по любому из пп.1-26.

28. Антитело, имеющее только тяжелые цепи, по п.27, которое представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент.

29. Антитело, имеющее только тяжелые цепи, по п.28, где фрагмент представляет собой домен V_H или связывающий домен V_H (V_HH) верблюда.

30. Антитело, имеющее только тяжелые цепи, по п.29, где в VH связывающем домене отсутствует удлиненная верблюдоподобная CDR3 петля.

31. Антитело, имеющее только тяжелые цепи, по п.29, где VH связывающий домен содержит удлиненную верблюдоподобную петлю CDR3.

32. Вектор, содержащий гетерологичный локус тяжелой цепи, как определено по любому из пп.1-26.

33. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.32.

34. Трансгенное животное, экспрессирующее гетерологичный локус тяжелой цепи, как определено по любому из пп.1-26.

35. Трансгенное животное по п.34, которое имеет пониженную способность экспрессии генов эндогенных антител.

36. Применение антитела, имеющего только тяжелые цепи, или его фрагмента по любому из пп.27-31 при получении лекарственного препарата для иммунотерапии.

37. Применение антитела, имеющего только тяжелые цепи, или его фрагмента по любому из пп.27-31 в качестве диагностического средства, реагента, абзима или ингибитора.

38. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело, имеющее только тяжелые цепи, или его фрагмент, по любому из пп.27-31 и фармакологически приемлемый носитель.

39. Способ получения и селекции антител, имеющих только тяжелые цепи, по любому из пп.27-31, содержащий этапы, на которых

(a) инъецируют антиген трансгенному животному по п.34 или 35;

(b) выделяют клетку или ткань, экспрессирующую представляющее интерес антигенспецифическое антитело, имеющее только тяжелые цепи;

(c) получают гибридому из клетки или ткани из этапа (b);

(d) необязательно, клонируют мРНК антитела, имеющего только тяжелые цепи, из указанной гибридомы для последующего продуцировния в системе гетерологичной экспрессии, такой как система млекопитающих, растений, насекомых, микробов, грибов или в альтернативной системе;

(e) клонируют домен V_H из этапа (c);

(f) экспрессируют домен (домены) V_H отдельно или в виде слитого белка в бактериальной, дрожжевой или альтернативной системе экспрессии.

40. Способ получения и селекции связывающего домена V_H по любому из пп.27-31, содержащий этапы, на которых

(a) инъецируют антиген трансгенному животному по п.34 или 35;

(b) выделяют клетку или ткань, экспрессирующую представляющее интерес антигенспецифическое антитело, имеющее только тяжелые цепи;

(c) клонируют локус V_H из мРНК, полученной из выделенной клетки или ткани;

(d) отображают кодированный белок, используя фаговую или аналогичную библиотеку;

(e) идентифицируют антигенспецифический домен (домены) V_H; и

(f) экспрессируют домен (домены) V_H отдельно или в виде слитого белка в бактериальной, дрожжевой или альтернативной системе экспрессии.

41. Связывающий полипептидный комплекс, содержащий димер первой тяжелой цепи и второй тяжелой цепи, в котором

каждая тяжелая цепь содержит связывающий домен, эффекторный участок и домен димеризации; причем связывающий домен в первой тяжелой цепи может иметь такую же специфичность или специфичность, отличную от специфичности связывающего домена второй тяжелой цепи; эффекторный участок первой тяжелой цепи может иметь такую же функцию или функцию, отличную от функции эффекторного участка второй тяжелой цепи.

42. Связывающий полипептидный комплекс по п.41, в котором домены димеризации являются идентичными.

43. Связывающий полипептидный комплекс по п.41 или 42, в котором указанный один или несколько доменов димеризации содержат по меньшей мере домены C_H2, C_H3 и необязательно С_H4 константной области антитела, полученной из гена тяжелой цепи иммуноглобулинов любого класса.

44. Полипептидный комплекс, содержащий пару тяжелых цепей и пару эффекторных (легких) цепей, в котором

тяжелые цепи пары связаны друг с другом;

одна из эффекторных (легких) цепей связана с одной из тяжелых цепей, а другая из эффекторных (легких) цепей связана с другой тяжелой цепью;

каждая тяжелая цепь содержит связывающий домен, домен димеризации и эффекторный участок;

эффекторная (легкая) цепь содержит комплементарный домен сборки, имеющий прикрепленный к ней эффекторный участок; и

эффекторный домен тяжелой цепи и комплементарный домен сборки эффекторной (легкой) цепи связаны друг с другом посредством нековалентного взаимодействия.

45. Связывающий полипептидный комплекс по п.44, в котором домен димеризации содержит по меньшей мере константные области C_H2, C_Н3 и необязательно C_Н4 антитела, полученные из гена тяжелой цепи иммуноглобулина любого класса.

46. Полипептидный комплекс по п.41 или 44, в котором эффекторный участок эффекторной (легкой) цепи представляет собой фермент, токсин, связывающий домен, агент, стабилизирующий сыворотку, клетку или агент визуализации.

47. Полипептидный комплекс по п.41 или 44, в котором эффекторный участок тяжелой цепи представляет собой фермент, токсин, связывающий домен, агент, стабилизирующий сыворотку, или агент визуализации.

48. Полипептидный комплекс по п.41 или 44, в котором эффекторный участок представляет собой полипептид, связанный с комплементарным доменом сборки.

49. Полипептидный комплекс по п.41 или 44, в котором константные домены тяжелой цепи представляют собой домены γ, домены ε, домены α или домены μ.

50. Полипептидный комплекс по п.41 или 44, в котором каждая тяжелая цепь включает домен C_H4, константные домены представляют собой домены α, и полипептидный комплекс включает цепь J.

51. Полипептидный комплекс по п.41 или 44, в котором каждая тяжелая цепь включает домен C_H4, константные домены представляют собой домены μ, и полипептидный комплекс включает цепь J.

52. Связывающий полипептидный комплекс, содержащий множество димеров тяжелой цепи и цепь J, в котором

множество димеров тяжелой цепи собраны при помощи цепи J;

каждая тяжелая цепь содержит растворимый связывающий домен и идентичные домены C_H2, C_Н3 и C_H4 μ; и в полипептидном комплексе существует по меньшей мере два растворимых связывающих домена, имеющих разные специфичности.

53. Связывающий полипептидный комплекс по п.52, в котором существует только два связывающих домена различной специфичности.

54. Связывающий полипептидный комплекс по пп.41, 44 или 52, в котором каждая тяжелая цепь дополнительно содержит шарнирный домен между связывающим доменом и доменом димеризации, и шарнироподобный домен между эффекторным участком и доменом димеризации.

55. Полипептидный комплекс по пп.41, 44 или 52, в котором указанный один или несколько связывающих доменов представляют собой домен V_HH.

56. Полипептидный комплекс по пп.41, 44 или 52, в котором связывающий домен представляет собой модифицированный домен V_H из любого организма.

57. Полипептидный комплекс по пп.41, 44 или 52, в котором связывающий домен представляет собой полипептидный комплекс адгезии клеток млекопитающих, полипептидный комплекс адгезии клеток прокариот или полипептидный комплекс адгезии вирусов.

58. Полипептидный комплекс по пп.41, 44 или 52, в котором связывающий домен представляет собой цитокин, фактор роста, рецепторный антагонист или рецепторный агонист или лиганд.

59. Выделенный полинуклеотид, кодирующий одну из цепей полипептидного комплекса согласно любому одному из пп.41-58.

60. Вектор клонирования или экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п.59.

61. Вектор клонирования или экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п.59, кодирующий первую тяжелую цепь, и выделенный полинуклеотид по п.59, кодирующий вторую тяжелую цепь, причем растворимый связывающий домен первой цепи имеет специфичность, отличную от специфичности растворимого связывающий домена второй тяжелой цепи.

62. Вектор клонирования или экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по п.59, кодирующий тяжелую цепь полипептидного комплекса по п.44, и выделенный полинуклеотид по п.59, кодирующий легкую цепь полипептидного комплекса по п.44.

63. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по любому из пп.60-62.

64. Способ получения полипептидного комплекса по любому из пп.41-58, содержащий культивирование клетки-хозяина по п.63 и выделение полипептидного комплекса.

65. Способ получения полипептидного комплекса по любому из пп.41-58, который содержит этапы, на которых

трансформируют клетку-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим первую тяжелую цепь, и вторым полинуклеотидом, кодирующим вторую тяжелую цепь;

выращивают клетку-хозяина в условиях, которые позволяют экспрессию кодирующих последовательностей двух полинуклеотидов; и

получают полипептидный комплекс из клетки-хозяина.

66. Способ по п.65, дополнительно содержащий трансформацию клетки-хозяина полинуклеотидом, кодирующим легкую цепь.

67. Способ по п.66, дополнительно содержащий трансформацию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим первую легкую цепь, и вторым полинуклеотидом, кодирующим вторую легкую цепь, причем растворимый эффекторный домен в первой легкой цепи отличается от растворимого эффекторного домена второй легкой цепи.

68. Способ получения полипептидного комплекса по любому из пп.41-58, в котором эффекторная цепь продуцируется синтетическим способом, таким как химия пептидов или коньюгация.

69. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающий полипептидный комплекс по любому из пп.41-58.

70. Применение связывающего полипептидного комплекса по любому из пп.41-58 при получении лекарственного препарата для профилактики или лечения заболевания.

71. Тяжелая цепь и эффекторная цепь связывающего полипептидного комплекса по любому из пп.41-58 для комбинированного, отдельного или последовательного введения при использовании в иммунотерапии.

72. Способ лечения пациента, содержащий введение связывающего полипептидного комплекса по любому из пп.41-58 или фармацевтической композиции по п.69 пациенту, нуждающемуся в лечении.

73. Применение связывающего полипептидного комплекса по любому из пп.41-58 в качестве диагностического средства, реагента, абзима, ингибитора, цитохимического реагента или диагностического агента.