Улучшенная секреция нейбластина - RU2005138368A

Реферат

1. Способ продуцирования биологически активного полипептида нейбластина, включающий культивирование клетки, содержащей экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую промоторную последовательность, функциональным образом связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид и полипептид нейбластин, причем указанная нуклеотидная последовательность не кодирует про-участок нейбластина.

2. Способ по п.1, где сигнальный пептид представляет собой гетерологичный сигнальный пептид.

3. Способ по п.1, где сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид млекопитающего.

4. Способ по п.3, где сигнальный пептид представляет собой человеческий сигнальный пептид, крысиный сигнальный пептид, мышиный сигнальный пептид, свиной сигнальный пептид, обезьяний сигнальный пептид, собачий сигнальный пептид, кошачий сигнальный пептид, бычий сигнальный пептид или лошадиный сигнальный пептид.

5. Способ по п.1, где сигнальный пептид выбран из группы, состоящей из сигнального пептида ростового фактора, сигнального пептида гормона, сигнального пептида цитокина и сигнального пептида иммуноглобулина.

6. Способ по п.5, где сигнальный пептид выбран из группы, состоящей из сигнальных пептидов TGFβ (трансформирующего ростового фактора-β), сигнальных пептидов GDF (фактора роста и дифференциации), сигнальных пептидов IGF (инсулиноподобного ростового фактора), сигнальных пептидов BMP (костного морфогенетического белка), сигнальных пептида нейротрофина, сигнального пептида PDGF (тромбоцитарного ростового фактора) и сигнального пептида EGF (эпидермального ростового фактора).

7. Способ по п.5, где сигнальный пептид выбран из сигнального пептида гормона, причем указанный гормон выбран из группы, состоящей из гормона роста, инсулина, ADH (антидиуретического гормона), LH (лютеинизирующего гормона), FSH (фолликулостимулирующего гормона), АСТН (адренокортикотропного гормона), MSH (меланоцит-стимулирующего гормона), TSH (тиротропин-стимулирующего гормона), Т3, Т4 и DHEA (дигидроэпиандростерона).

8. Способ по п.5, где сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид интерлейкина.

9. Способ по п.5, где сигнальный пептид выбран из группы, состоящей из сигнального пептида нейртурина, сигнального пептида GDNF (глиального нейротрофического фактора), сигнального пептида персефина и сигнального пептида NGF (ростового фактора нейронов).

10. Способ по п.1, где сигнальный пептид выбран из группы, состоящей из сигнального пептида альбумина, модифицированного сигнального пептида альбумина и сигнального пептида гормона роста.

11. Способ по п.10, где сигнальный пептид выбран из группы, состоящей из сигнального пептида крысиного альбумина, модифицированного сигнального пептида крысиного альбумина и сигнального пептида человеческого гормона роста, такого как сигнальный пептид крысиного альбумина и сигнальный пептид человеческого гормона роста.

12. Способ по п.1, где сигнальный пептид представляет собой синтетический сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид, содержащий SEQ ID NO:70.

13. Способ по п.1, где сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид иммуноглобулина.

14. Способ по п.13, где сигнальный пептид выбран из группы, состоящей из мышиного lgSP (SEQ ID NO 4), крысиного lgSP (SEQ ID NO 6), свиного lgSP (SEQ ID NO 5), обезьяньего lgSP (SEQ ID NO 2 или 3), человеческого lgSP (SEQ ID NO 1).

15. Способ по п.13, где lgSP представляет собой мышиный lgSP (SEQ ID NO 4).

16. Способ по п.13, где lgSP представляет собой человеческий lgSP (SEQ ID NO 1).

17. Способ по п.1, где сигнальный пептид представляет собой нативный сигнальный пептид нейбластина.

18. Способ по п.17, где сигнальный пептид представляет собой нативный сигнальный пептид человеческого нейбластина.

19. Способ по п.1, где полипептид нейбластин выбран из группы, состоящей из зрелого NBN, выбранного из нейбластина, имеющего последовательность, идентифицированную как аминокислоты 1-140 из SEQ ID NO 10 или аминокислоты 1-144 из SEQ ID NO 11 или 12, SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17 или 18, усеченного по N-концу NBN, мутантного NBN или мутантного и усеченного по N-концу NBN.

20. Способ по п.19, где полипептид нейбластин представляет собой зрелый NBN, выбранный из группы, состоящей из нейбластина, имеющего последовательность, идентифицированную как SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 16, 17, или 18.

21. Способ по п.20, где полипептид нейбластин представляет собой человеческий зрелый 113 NBN (SEQ ID NO 14).

22. Способ по п.1, где полипептид нейбластин выбран из группы, состоящей из 116 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 115 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 114 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 113 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 112 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 111 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 110 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 109 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 108 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 107 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 106 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 105 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 104 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 103 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 102 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 101 С-концевой аминокислоты человеческого нейбластина, 100 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина и 99 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина.

23. Способ по п.1, где полипептид нейбластин выбран из группы, состоящей из усеченного по N-концу нейбластина, имеющего 106, 104, 102 или 99 С-концевых аминокислот из SEQ ID NO 10.

24. Способ по п.1, где полипептид нейбластин выбран из группы, состоящей из 116 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 113 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина, 104 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина и 116 С-концевых аминокислот человеческого нейбластина.

25. Способ по п.1, где усеченный по N-концу нейбластин имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO 19.

26. Способ по п.1, где усеченный по N-концу нейбластин содержит 99 аминокислот из SEQ ID NO 20.

27. Способ по п.1, где полипептид нейбластин содержит аминокислотную последовательность, происходящую от аминокислот 8-113 из SEQ ID NO 14, причем этот вариантный полипептид нейбластин включает одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из аминокислоты, не являющейся аргинином, в положении 14 аминокислотной последовательности указанного вариантного полипептида, аминокислоты, не являющейся аргинином, в положении 39 аминокислотной последовательности указанного вариантного полипептида, аминокислоты, не являющейся аргинином, в положении 68 указанного вариантного полипептида, и аминокислоты, не являющейся аспарагином, в положении 95 указанного вариантного полипептида, причем положения указанных аминокислот пронумерованы в соответствии с полипептидной последовательностью SEQ ID NO 14.

28. Способ по п.27, где указанная замена в положении 14, 39 или 68 представляет собой лизин.

29. Способ по п.1, где вектор представляет собой плазмиду.

30. Способ по п.1, где вектор представляет собой вирусный вектор.

31. Способ по п.1, где вектор представляет собой экспрессирующий вектор млекопитающего.

32. Способ по п.30, где вектор представляет собой репликационно-дефективную лентивирусную частицу.

33. Способ по п.32, где указанную векторную частицу получают из лентивирусного вектора, содержащего лентивирусный 5'-LTR (длинный концевой повтор), сайт связывания тРНК, сигнал упаковки, промотор, функциональным образом связанный с полинуклеотидным сигналом, кодирующим указанный сигнальный пептид и указанный пептид нейбластина, точку начала синтеза второй цепи ДНК и лентивирусный 3'-LTR.

34. Способ по п.30, где вектор выбран из группы, состоящей из ретровируса, такого как HIV (вирус иммунодефицита человека), SIV (вирус иммунодефицита обезьян), FIV (вирус иммунодефицита кошек), EIAV (вирус инфекционной анемии лошадей), AAV (адено-ассоциированный вирус), аденовируса, вируса герпеса и MoMLV (вируса мышиной лейкемии Молони).

35. Способ по п.1, где промотор выбран из группы, состоящей из: промотора убиквитина, промотора CMV (цитомегаловируса), промотора JeT, промотора SV40, промотора фактора-1-альфа элонгации (EF1-α), бета-актина цыпленка, PGK (фосфоглицераткиназы) и МТ-1 (металлотионенина-1).

36. Способ по п.34, где промотор представляет собой индуцируемый/репрессируемый промотор, такой как: Tet-On, Tet-Off, рапамицин-индуцируемый промотор, Мх1 и RU486.

37. Способ по любому из пп.1-36, где клетка является клеткой-хозяином от млекопитающего.

38. Способ по п.37, где указанное млекопитающее выбрано из группы, состоящей из грызуна, кролика, собаки, кошки, свиньи, обезьяны, человека.

39. Способ по п.37, где указанная клетка выбрана из группы, состоящей из СНО (яичников китайских хомячков), НЕК293, COS (африканской зеленой мартышки), РС12, HiB5, RN33b, нейрональных клеток, эмбриональных клеток, ARPE-19, иммортализованных фибробластных клеток, С2С12, HeLa, HepG2, клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE), клеток полосатого тела, нейронов, астроцитов, интернейронов.

40. Способ по п.39, где клетка представляет собой клетку СНО.

41. Нуклеиновая кислота, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид и полипептид нейбластин, где указанная полинуклеотидная последовательность не кодирует про-участок нейбластина, причем указанный сигнальный пептид и указанный пептид нейбластина такие, как определено в любом из пп.1-40.

42. Нуклеиновая кислота по п.41, содержащая а) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:64, 66 или 68 или б) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды SEQ ID NO:65, 67 или 69.

43. Нуклеиновая кислота по п.41 или 42, где нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в хозяине-млекопитающем.

44. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.41-43.

45. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по п.44 и один или более чем один фармацевтически приемлемый адъювант, эксципиент, носитель и/или разбавитель.

46. Выделенная клетка-хозяин, трансдуцированная или трансфицированная вектором по п.44.

47. Клетка по п.46, представляющая собой клетку млекопитающего.

48. Клетка млекопитающего по п.47, где эта клетка способна секретировать нейбластин или его функциональный эквивалент в количествах, превышающих 500 нг/10⁶ клеток/24 ч.

49. Клетка млекопитающего по п.47, выбранная из группы, состоящей из СНО, НЕК293 COS, PC12, HiB5, RN33b, иммортализованных фибробластных клеток, С2С12, HeLa, HepG2, клеточных линий RPE и клеток ARPE-19.

50. Клетка млекопитающего по п.48, выбранная из группы, состоящей из СНО, НЕК293, COS и ARPE-19.

51. Клетка млекопитающего по п.47, выбранная из группы, состоящей из клеток RPE, нейрональных клеток, клеток нейрональных предшественников, стволовых клеток и эмбриональных клеток.

52. Клетка млекопитающего по п.47, прикрепленная к опорному матриксу.

53. Линия упаковывающих клеток, способных продуцировать инфекционную векторную частицу, причем указанная векторная частица содержит геном, происходящий от ретровирусов, содержащий ретровирусный 5'-LTR, сайт связывания тРНК, сигнал упаковки, промотор, функциональным образом связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид и полипептид нейбластин, где указанная нуклеотидная последовательность не кодирует про-участок нейбластина и указанный сигнальный пептид и пептид нейбластин такие, как определено в любом из пп.1-40, и точку начала синтеза второй цепи ДНК, и ретровирусный 3'-LTR.

54. Линия упаковывающих клеток по п.53, где векторная частица является репликационно-дефективной.

55. Линия упаковывающих клеток по п.53, где геном происходит от лентивируса и LTR являются лентивирусными.

56. Имплантируемое устройство для клеточной культуры, содержащее

1) полупроницаемую мембрану, допускающую диффузию ростового фактора через нее, и

2) по меньшей мере одну выделенную клетку-хозяина по п.46.

57. Устройство по п.56, где полупроницаемая мембрана является иммуноизолирующей.

58. Устройство по п.56, где полупроницаемая мембрана является микропористой.

59. Устройство по п.56, которое дополнительно содержит матрикс, находящийся в полупроницаемой мембране.

60. Устройство по п.56, дополнительно содержащее фиксирующий якорь.

61. Применение вектора по п.44 или устройства по любому из пп.56-60 в качестве лекарства.

62. Применение вектора по п.44 для получения лекарства для лечения расстройства нервной системы.

63. Применение по п.62, где расстройство нервной системы выбрано из группы, состоящей из периферической невропатии, включая невропатическую боль, повреждения спинного мозга, отрыва спинномозгового корешка, невралгии тройничного нерва и каузалгии.

64. Применение по п.61, где лекарство предназначено для лечения глазного заболевания, такого как раны и язвы роговицы и ретинопатии.

65. Применение вектора по п.44 для изготовления лекарства для лечения расстройства ЦНС (центральной нервной системы).

66. Применение по п.65, где расстройство ЦНС представляет собой нейродегенеративное заболевание.

67. Применение по п.62, где нейродегенеративное заболевание представляет собой периферическую невропатию, включая невропатическую боль.

68. Полипептид нейбластин, содержащий сигнальный пептид и полипептид нейбластин, причем в этом полипептиде отсутствует про-участок нейбластина.

69. Полипептид по п.68, где полипептид нейбластин соединен с сигнальным пептидом.

70. Полипептид по п.69, где сигнальный пептид связан пептидной связью своим С-концом с N-концом полипептида нейбластина.

71. Полипептид по п.68, где сигнальный пептид представляет собой гетерологичный сигнальный пептид.

72. Полипептид по п.68, где сигнальный пептид такой, как определено в любом из пп.1-40.

73. Полипептид по п.72, где сигнальный пептид выбран из группы сигнальных пептидов, выбранных из нативного сигнального пептида крысиного альбумина, модифицированного сигнального пептида крысиного альбумина и сигнального пептида человеческого гормона роста.

74. Полипептид по любому из пп.68-72, где сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид нейбластин.

75. Полипептид по любому из пп.68-72, где сигнальный пептид представляет собой lgSP.