Ингибиторы рецепторов фактора роста эндотелия сосудов типа 2 - RU2006123945A
Код документа: RU2006123945A
Реферат
1. По существу чистый однодоменный полипептид, который связывается с человеческим KDR, данный полипептид содержит приблизительно от 80 до 150 аминокислот и имеет структурную организацию, включающую в себя
a) по меньшей мере, от пяти до семи бета-цепей или бета-подобных цепей, распределенных между, по меньшей мере, двумя бета-слоями, и
b) по меньшей мере, один петлеобразный участок, соединяющий две цепи, которые представляют собой бета-цепи или бета-подобные цепи, причем указанный петлеобразный участок участвует в связывании KDR,
где однодоменный полипептид связывается с внеклеточным доменом человеческого белка KDR с константой диссоциации (KD) менее 1·10-6 М.
2. Однодоменный полипептид по п.1, где однодоменный полипептид содержит вариабельный домен иммуноглобулина.
3. Однодоменный полипептид по п.2, где вариабельный домен иммуноглобулина выбран из группы, состоящей из человеческого домена VL, человеческого домена VH и верблюжьего домена VHH.
4. Однодоменный полипептид по п.2, где полипептид содержит три петлеобразных участка, которые участвуют в связывании KDR, и где каждый из указанных петлеобразных участков соединяет две бета-цепи.
5. Однодоменный полипептид по п.1, где однодоменный полипептид содержит иммуноглобулин-подобный домен.
6. Однодоменный полипептид по п.5, где иммуноглобулин-подобный домен представляет собой домен фибронектина типа III (Fn3).
7. Однодоменный полипептид по п.1, где домен Fn3 содержит, в направлении от N-конца к C-концу,
a) бета-цепь или бета-подобную цепь A;
b) петлю AB;
c) бета-цепь B;
d) петлю BC;
e) бета-цепь C;
f) петлю CD;
g) бета-цепь D;
h) петлю DE;
i) бета-цепь F;
j) петлю FG; и
k) бета-цепь или бета-подобную цепь G.
8. Однодоменный полипептид по п.7, где петля FG участвует в связывании KDR.
9. Однодоменный полипептид по п.7, где петли BC, DE и FG участвуют в связывании KDR.
10. Однодоменный полипептид по п.9, где каждая из бета-цепей, по существу, состоит из аминокислотной последовательности, которая, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности, соответствующей бета-цепи SEQ ID NO: 5.
11. Однодоменный полипептид по п.10, где каждая из петель AB, CD и EF, по существу, состоит из аминокислотной последовательности, которая, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности, соответствующей петли SEQ ID NO: 5.
12. Однодоменный полипептид по п.1, где однодоменный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 60% идентична последовательности SEQ ID NO: 5.
13. Однодоменный полипептид по п.5, где полипептид содержит три петлеобразных участка, которые участвуют в связывании KDR, причем каждый петлеобразный участок соединяет две цепи, которые представляют собой бета- или бета-подобные цепи.
14. Однодоменный полипептид по любому из пп.1-13, где петля, участвующая в связывании KDR, имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
15. Однодоменный полипептид по любому из пп.1-13, где полипептид присоединен к фрагменту, который уменьшает скорость выведения полипептида у млекопитающего более чем в три раза по сравнению с немодифицированным полипептидом.
16. Однодоменный полипептид по п.15, где фрагмент, который уменьшает скорость выведения, представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля.
17. Однодоменный полипептид по п.16, где фрагмент полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу от 2 до 100 кДа.
18. Однодоменный полипептид по п.16, где фрагмент полиэтиленгликоля ковалентно связан с тиольной группой аминофрагмента однодоменного полипептида.
19. Однодоменный полипептид по п.1, где полипептид присоединен к маркерному фрагменту.
20. Однодоменный полипептид по любому из пп.1-13, где однодоменный полипептид связывается с внеклеточным доменом человеческого белка KDR с константой диссоциации (KD) менее 1·10-7 M и ингибирует KDR-опосредованную активность VEGF.
21. Однодоменный полипептид по любому из пп.1-13, где однодоменный полипептид конкурирует с изоформой VEGF-A, VEGF165, за связывание с KDR.
22. Однодоменный полипептид по любому из пп.1-13, где однодоменный полипептид конкурирует с VEGF-A и VEGF-D за связывание с KDR.
23. Однодоменный полипептид по любому из пп.1-13, где однодоменный полипептид также связывает внеклеточный домен мышиного Flkl с KD менее 1·10-6.
24. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192.
25. Полипептид по п.24, где полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193.
26. Полипептид по п.24, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 194.
27. Полипептид по п.26, где фрагмент полиэтиленгликоля ковалентно связан с цистеиновым остатком в положении 93.
28. Полипептид по п.27, где фрагмент полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу в интервале приблизительно от 10 до 60 кДа.
29. По существу чистый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 85% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, где указанный полипептид связывается с KDR и конкурирует с VEGF-A за связывание с KDR.
30. По существу чистый полипептид по п.29, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 85% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO: 6-183, 186-197 и 199.
31. Полипептид по п.30, где указанный полипептид содержит любую из последовательностей SEQ ID NO: 6-183, 186-197 и 199.
32. Полипептид по п.29, где указанный полипептид ингибирует биологическую активность VEGF.
33. Полипептид по п.29, где указанный полипептид связывает указанный KDR с KD, составляющей 50 нМ или менее.
34. Полипептид по п.29, где полипептид связывается с внеклеточным доменом человеческого белка KDR с константой диссоциации (KD) менее 1· 10-7 M и ингибирует KDR-опосредованную активность VEGF.
35. Терапевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп. 1-13, и 24-34, и фармацевтически приемлемый носитель.
36. Способ ингибирования биологической активности VEGF в клетке, предусматривающий контактирование указанной клетки с полипептидом по п.20 в количестве и в течение периода времени, достаточных для ингибирования указанной биологической активности VEGF.
37. Способ лечения субъекта, страдающего от состояния, отвечающего на ингибирование VEGF, причем указанный способ предусматривает введение указанному субъекту эффективного количества полипептида по п.20, где указанный полипептид ингибирует биологическую активность VEGF.
38. Способ по п.37, где указанное состояние представляет собой состояние, характеризующееся неадекватным ангиогенезом.
39. Способ по п.38, где указанное состояние представляет собой гиперпролиферативное состояние.
40. Способ по п.38, где указанное состояние выбрано из группы, состоящей из аутоиммунного нарушения, воспалительного нарушения, ретинопатии и рака.
41. Способ детекции VEGFR-2 в образце, предусматривающий
a) контактирование указанного образца с полипептидом по любому из пп. 1-13 и 24-34, где указанное контактирование осуществляют в условиях, обеспечивающих образование комплекса полипептид-VEGFR-2; и
b) детекцию указанного комплекса и посредством этого детекцию указанного VEGFR-2 в указанном образце.
42. Способ по п.41, где указанную детекцию проводят с использованием метода, выбранного из группы, состоящей из радиографии, иммунологического анализа, флуоресцентной детекции, масс-спектроскопии или поверхностного плазменного резонанса.
43. Способ по п.41, где указанный образец представляет собой биологический образец.
44. Способ по п.41, где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у человека, и где указанный VEGFR-2 представляет собой KDR.
45. Способ по п.41, где указанный полипептид помечен маркирующим фрагментом, обеспечивающим детекцию.
46. Способ по п.45, где указанный маркирующий фрагмент выбран из группы, состоящей из радиоактивного фрагмента, флуоресцентного фрагмента, хромогенного фрагмента, хемилюминесцентного фрагмента или гаптенового фрагмента.
47. Способ по п.41, где указанный полипептид иммобилизован на твердом носителе.
48. Мишень-связывающий полипептид10Fn3 с улучшенными фармакокинетическими свойствами, который содержит
a) домен10Fn3, содержащий приблизительно от 80 до 150 аминокислот, где, по меньшей мере, одна из петель указанного домена10Fn3 участвует в связывании мишени; и
b) ковалентно связанный (PEG) фрагмент полиэтиленгликоля, где указанный полипептид Fn3 связывается с мишенью с KD менее 100 нМ имеет скорость выведения менее 30 мл/ч/кг у млекопитающего.
49. Полипептид10Fn3 по п.48, где фрагмент PEG присоединен к тиольной группе или к аминогруппе.
50. Полипептид10Fn3 по п.48, где фрагмент PEG присоединен к полипептиду Fn3 путем сайт-направленного пэгилирования.
51. Полипептид10Fn3 по п.50, где фрагмент PEG присоединяют к остатку Cys.
52. Полипептид10Fn3 по п.48, где фрагмент PEG присоединен по положению в полипептиде10Fn3, выбранному из группы, состоящей из
a) N-конца;
b) положения, находящегося между N-концом и основной частью N-концевой бета-цепи или бета-подобной цепи;
c) петли, расположенной на стороне полипептида, противоположной мишень-связывающему сайту;
d) положения, находящегося между C-концом и основной частью С-концевой бета-цепи или бета-подобной цепи; и
e) C-конца.
53. Полипептид10Fn3 по п.48, где молекулярная масса фрагмента PEG находится в интервале приблизительно от 2 до 100 кДа.
54. Полипептид10Fn3 по п.48, где полипептид10Fn3 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичную SEQ ID NO: 5.
55. Способ введения полипептида10Fn3 пациенту, позволяющий достичь замедленного высвобождения по сравнению с внутривенным введением, предусматривающий подкожное введение полипептида10Fn3, позволяющее достичь замедленного высвобождения в кровоток по сравнению с внутривенным введением.
56. Способ по п.55, где максимальная концентрация полипептида10Fn3 в сыворотке при подкожном введении составляет менее половины от максимальной концентрации в сыворотке при внутривенном введении равной дозы.
57. Способ по п.55, где полипептид10Fn3 присоединяют к фрагменту, который способствует увеличению полужизни полипептида10Fn3 в сыворотке.
58. Способ по п.57, где фрагмент представляет собой фрагмент полиэтиленгликоля.
59. Способ по п.55, где полипептид10Fn3 содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 60% идентична SEQ ID NO: 5.
60. По существу чистый однодоменный полипептид, который связывается с предварительно выбранным человеческим белком-мишенью и с его гомологом из вида, отличного от человека, причем данный полипептид содержит приблизительно от 80 до 150 аминокислот и имеет структурную организацию, включающую в себя
a) по меньшей мере от пяти до семи бета-цепей или бета-подобных цепей, распределенных между, по меньшей мере, двумя бета-слоями, и
b) по меньшей мере, один петлеобразный участок, соединяющий две цепи, которые представляют собой бета-цепи или бета-подобные цепи, причем указанный петлеобразный участок участвует в связывании с предварительно выбранным человеческим белком-мишенью и с его гомологом,
где однодоменный полипептид связывается с предварительно выбранным человеческим белком-мишенью и с его гомологом с константой диссоциации (KD) менее 5·10-8 М, и где последовательность гомолога, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности, по меньшей мере, 100 аминокислот предварительно выбранного человеческого белка-мишени.
61. Однодоменный полипептид по п.60, где однодоменный полипептид содержит вариабельный домен иммуноглобулина.
62. Однодоменный полипептид по п.61, где вариабельный домен иммуноглобулина выбран из группы, состоящей из человеческого домена VL, человеческого домена VH и верблюжьего домена VHH.
63. Однодоменный полипептид по п.61, где полипептид содержит три петлеобразных участка, которые участвуют в связывании предварительно выбранного человеческого белка-мишени и его гомолога, причем каждый петлеобразный участок соединяет цепи, которые представляют собой бета-цепи или бета-подобные цепи.
64. Однодоменный полипептид по п.60, где однодоменный полипептид содержит иммуноглобулин-подобный домен.
65. Однодоменный полипептид по п.64, где иммуноглобулин-подобный домен представляет собой домен фибронектина типа III (Fn3).
66. Однодоменный полипептид по п.65, где домен Fn3 содержит, в направлении от N-конца к C-концу,
a) бета-цепь или бета-подобную цепь A;
b) петлю AB;
c) бета-цепь B;
d) петлю BC;
e) бета-цепь C;
f) петлю CD;
g) бета-цепь D;
h) петлю DE;
i) бета-цепь F;
j) петлю FG; и
k) бета-цепь или бета-подобную цепь G.
67. Однодоменный полипептид по п.66, где петля FG участвует в связывании белка-мишени.
68. Однодоменный полипептид по п.66, где петли BC, DE и FG участвуют в связывании белка-мишени.
69. Однодоменный полипептид по п.66, где каждая из бета-цепей или бета-подобных цепей, по существу, состоит из аминокислотной последовательности, которая, по меньшей мере, на 80% идентична последовательности соответствующей бета-цепи SEQ ID NO: 5.
70. Нуклеиновая кислота, содержащая последовательность, кодирующую полипептид по п.1.
71. Нуклеиновая кислота по п.70, где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из любой из SEQ ID NO: 6-183, 186-197, 199 и 241-310.
72. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 184 и кодирует полипептид, который связывается с человеческим KDR с KD менее 1·10-6 M.
73. Нуклеотидная последовательность по п.72, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 184 и SEQ ID NO: 185.
74. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.71, функционально связанную с промотором.
75. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п.72.
76. Способ получения полипептида, связывающего KDR, предусматривающий экспрессию нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую полипептид по п.1.
77. Способ по п.76, где нуклеиновая кислота содержит последовательность, кодирующую полипептид, выбранный из группы, состоящей из любой из SEQ ID NO: 6-183, 186-197, 199 и 241-310.
78. Способ по п.76, где нуклеиновая кислота содержит последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 184.
79. Способ по п.76, где нуклеиновая кислота экспрессируется в клетке.
80. Способ по п.76, где нуклеиновая кислота экспрессируется в бесклеточной системе.
