Способы получения библиотек двухцепочечных днк и способы секвенирования для идентификации метилированных цитозинов - RU2016132476A
Код документа: RU2016132476A
Формула
1. Способ идентификации метилированных цитозинов в популяции молекул двухцепочечных ДНК, включающий стадии
(i) лигирования двухцепочечных ДНК-адаптеров, по меньшей мере, с одним концом цепи из множества молекул двухцепочечных ДНК и спаривание нитей множества молекул двухцепочечных ДНК для получения множества спаренных адаптер-модифицированных молекул ДНК;
(ii) трансформации любого неметилированного цитозина в спаренных адаптер-модифицированных молекулах ДНК в урацил в спаренных адаптер-модифицированных молекулах ДНК;
(iii) получения комплементарных цепей спаренных и трансформированных адаптер-модифицированных молекул ДНК с использованием нуклеотидов A, G, С и Т, и праймеров, последовательности которых комплементарны, по меньшей мере, части двухцепочечных адаптеров для получения частично трансформированных спаренных двухцепочечных молекул;
(iv) необязательно, амплификации частично трансформированных спаренных молекул двухцепочечных ДНК, полученных на стадии (iii), для получения амплифицированных спаренных молекул двухцепочечных ДНК;
(v) секвенирования спаренных молекул ДНК, полученных на стадии (iii) или на стадии (iv),
где присутствие метилированных цитозинов в данном положении определяется, если цитозин находится в одной из цепей спаренных молекул двухцепочечных ДНК, полученных на стадии (iii) или на стадии (iv), а гуанин находится в соответствующем положении в другой цепи спаренных молекул двухцепочечных ДНК, и/или где присутствие неметилированных цитозинов в данном положении определяется, если урацил или тимин находятся в одной из цепей спаренных молекул двухцепочечных ДНК, полученных на стадии (iii) или на стадии (iv), а гуанин находится в соответствующем положении в другой цепи спаренных молекул двухцепочечных ДНК,
где множество спаренных адаптер-модифицированных молекул ДНК стадии (i), получали
(а) лигированием ДНК Y-адаптера к каждому концу цепей множества молекул двухцепочечной ДНК, причем адаптер, содержит первую цепь ДНК и вторую цепь ДНК,
где 3'-участок первой цепи ДНК, и 5'-участок второй цепи ДНК образуют двухцепочечный участок из-за комплементарности последовательностей,
где концы указанных двухцепочечных участков, образованные 3'-участком первой цепи ДНК, и 5'-участком второй цепи ДНК Y-адаптера, совместимы с концами молекул двухцепочечных ДНК,
(b) синтезом, для каждой из цепей молекул ДНК, полученных на стадии (а), комплементарной цепи с помощью полимеразной элонгации от 3'-конца второй цепи ДНК в молекуле Y-адаптера с использованием каждой из цепей ДНК-молекул, полученных в стадии (а), в качестве матрицы, тем самым спаривая каждую из цепей молекул ДНК, полученных на стадии (а), с синтетической комплементарной цепью с целью получения множества спаренных адаптер-модифицированных молекул ДНК,
где в стадии (а) множество молекул двухцепочечной ДНК являются фрагментами геномной ДНК,
где цепи фрагментов геномной ДНК, являются спаренными для обеспечения множества спаренных фрагментов геномной ДНК,
где спаривание фрагментов геномной ДНК осуществляется с использованием последовательностей штрихкодов, и
где стадию (b) осуществляли с использованием нуклеотидов A, G, С и Т.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии (i) спаривание может быть выполнено до или после лигирования, или одновременно с лигированием.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, по меньшей мере, часть двухцепочечных адаптеров имеет последовательности, общие для всех двухцепочечных адаптеров, используемых на стадии (i).
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед стадией (ii), множество спаренных адаптер-модифицированных молекул ДНК отделяется для создания библиотеки спаренных адаптер-модифицированных молекул ДНК.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансформация неметилированного цитозина в урацил в спаренных молекулах ДНК осуществляется с помощью бисульфита.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что 3'-участок второй цепи ДНК Y-адаптера формирует петлю шпильки гибридизацией между первым и вторым сегментом внутри указанного 3'-участка, где первый сегмент расположен на 3'-конце 3'-области, а второй сегмент расположен в непосредственной близости от 5'-участка второй цепи ДНК.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ДНК Y-адаптера имеет первую последовательность штрихкода в двухцепочечном участке и/или вторую последовательность штрихкода в 3'-участке второй цепи ДНК Y-адаптера.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что ДНК Y-адаптера имеет сайт рестрикции в 5'-участке первой цепи ДНК Y-адаптера.
9. Способ идентификации метилированных цистеинов в популяции двухцепочечных молекул ДНК, включающий стадии
(i) лигирования двухцепочечных ДНК-адаптеров, по меньшей мере, с одним концом цепи из множества молекул двухцепочечных ДНК и спаривание нитей множества молекул двухцепочечных ДНК для получения множества спаренных адаптер-модифицированных молекул ДНК;
(ii) трансформации любого неметилированного цитозина в спаренных адаптер-модифицированных молекулах ДНК в урацил в спаренных адаптер-модифицированных молекулах ДНК;
(iii) получения комплементарных цепей спаренных и трансформированных адаптер-модифицированных молекул ДНК с использованием нуклеотидов A, G, С и Т, и праймеров, последовательности которых комплементарны, по меньшей мере, части двухцепочечных адаптеров для того, чтобы обеспечить частично трансформированные спаренные двухцепочечные молекулы;
(iv) необязательно, амплификации частично трансформированных спаренных молекул двухцепочечных ДНК, полученных на стадии (iii), для получения амплифицированных спаренных молекул двухцепочечных ДНК;
(v) секвенирования спаренных молекул ДНК, полученных на стадии (iii) или на стадии (iv),
где присутствие метилированных цитозинов в данном положении определяется, если цитозин находится в одной из цепей спаренных молекул двухцепочечных ДНК, полученных на стадии (iii) или на стадии (iv), а гуанин находится в соответствующем положении в другой цепи спаренных молекул двухцепочечных ДНК, и/или где присутствие неметилированных цитозинов в данном положении определяется, если урацил или тимин находятся в одной из цепей спаренных молекул двухцепочечных ДНК, полученных на стадии (iii) или на стадии (iv), а гуанин находится в соответствующем положении в другой цепи спаренных молекул двухцепочечных ДНК,
где множество спаренных адаптер-модифицированных молекул ДНК стадии (i) получали
(а) контактом популяции молекул двухцепочечных ДНК с ДНК Y-адаптером, где адаптер содержит первую цепь ДНК и вторую цепь ДНК,
где 3'-участок первой цепи ДНК, и 5'-участок второй цепи ДНК образуют двухцепочечный участок из-за комплементарности последовательностей и где концы указанного двухцепочечного участка совместимы с концами молекул двухцепочечных ДНК,
где указанный контакт осуществляют в условиях, достаточных для лигирования Y-адаптера к обоим концам молекул двухцепочечных ДНК, с получением, таким образом, множества Y-адаптер-содержащих молекул ДНК,
(b) контактом каждой цепи указанных Y-адаптер-содержащих молекул ДНК с праймером для элонгации, который содержит 3'-участок, комплементарный второй цепи ДНК молекулы Y-адаптера в условиях, достаточных для гибридизации праймера для элонгации со второй цепью Y-адаптера, и который, после гибридизации со второй цепью ДНК молекулы Y-адаптера, создает выступающие концы,
(c) контактом молекулы, полученной на стадии (b), со шпилечным адаптером, где указанный шпилечный адаптер, содержит участок петли шпильки и выступающие концы, которые совместимы с выступающими концами в молекулах, полученных на стадии (b), в условиях, достаточных для лигирования шпилечного адаптера с молекулами, полученными на стадии (b),
(d) преобразованием каждой из цепей молекул ДНК, полученных на стадии (с) в молекулу двухцепочечной ДНК с помощью полимеразы путем элонгации праймера для элонгации, используемого на стадии (b)
где стадия лигирования к шпилечному адаптеру (с) и стадия элонгации (d) могут быть осуществлены в любом порядке или одновременно,
где в стадии (i) множество двухцепочечных молекул ДНК являются фрагментами геномной ДНК для получения множества адаптер-модифицированных фрагментов геномной ДНК, и
где спаривание в стадии (i) осуществляется с помощью последовательностей штрихкодов.
10. Способ идентификации метилированных цистеинов в популяции двухцепочечных молекул ДНК, включающий стадии
(i) лигирования двухцепочечных ДНК-адаптеров, по меньшей мере, с одним концом цепи из множества молекул двухцепочечных ДНК и спаривание нитей множества молекул двухцепочечных ДНК для получения множества спаренных адаптер-модифицированных молекул ДНК;
(ii) трансформации любого неметилированного цитозина в спаренных адаптер-модифицированных молекулах ДНК в урацил в спаренных адаптер-модифицированных молекулах ДНК;
(iii) получения комплементарных цепей спаренных и трансформированных адаптер-модифицированных молекул ДНК с использованием нуклеотидов A, G, С и Т, и праймеров, последовательности которых комплементарны, по меньшей мере, части двухцепочечных адаптеров для того, чтобы обеспечить частично трансформированные спаренные двухцепочечные молекулы;
(iv) необязательно, амплификации частично трансформированных спаренных молекул двухцепочечных ДНК, полученных на стадии (iii), для получения амплифицированных спаренных молекул двухцепочечных ДНК;
(v) секвенирования спаренных молекул ДНК, полученных на стадии (iii) или на стадии (iv),
где присутствие метилированных цитозинов в данном положении определяется, если цитозин находится в одной из цепей спаренных молекул двухцепочечных ДНК, полученных на стадии (iii) или на стадии (iv), а гуанин находится в соответствующем положении в другой цепи спаренных молекул двухцепочечных ДНК, и/или где присутствие неметилированных цитозинов в данном положении определяется, если урацил или тимин находятся в одной из цепей спаренных молекул двухцепочечных ДНК, полученных на стадии (iii) или на стадии (iv), а гуанин находится в соответствующем положении в другой цепи спаренных молекул двухцепочечных ДНК,
где множество спаренных адаптер-модифицированных молекул ДНК стадии (i) получали
(a) контактом популяции молекул двухцепочечных ДНК с ДНК Y-адаптером, где адаптер содержит первую цепь ДНК и вторую цепь ДНК,
где 3'-участок первой цепи ДНК, и 5'-участок второй цепи ДНК образуют двухцепочечньш участок из-за комплементарности последовательностей и где концы указанного двухцепочечного участка совместимы с концами молекул двухцепочечных ДНК,
где указанный контакт осуществляют в условиях, достаточных для лигирования Y-адаптера к обоим концам молекул двухцепочечных ДНК, с получением, таким образом, множества Y-адаптер-содержащих молекул ДНК,
(b) контактом каждой цепи указанных Y-адаптер-содержащих молекул ДНК с праймером для элонгации, который содержит 3'-участок, комплементарный второй цепи ДНК молекулы Y-адаптера в условиях, достаточных для гибридизации праймера для элонгации второй цепи Y-адаптера, где праймер для элонгации включает 3'-участок, который комплементарен со второй цепью ДНК молекулы Y-адаптера и который, после гибридизации со второй цепью ДНК молекулы Y-адаптера, создает выступающие концы, и где шпилечный адаптер включает участок петли шпильки и выступающие концы, которые совместимы с выступающими концами, образованными после гибридизации праймера для элонгации со второй цепью Y-адаптера,
(с) преобразованием каждой из цепей молекул ДНК, полученных на стадии (b) в молекулу двухцепочечной ДНК с помощью полимеразы путем элонгации праймера для элонгации, используемого на стадии (b)
где стадия лигирования к шпилечному адаптеру (b) и стадия элонгации (с) могут быть осуществлены в любом порядке или одновременно,
где в стадии (i) множество двухцепочечных молекул ДНК являются фрагментами геномной ДНК для получения множества адаптер-модифицированных фрагментов геномной ДНК, и
где спаривание в стадии (i) осуществляется с помощью последовательностей штрихкодов.
11. ДНК Y-адаптер, предназначенный для применения в способе по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что Y-адаптер содержит первую цепь ДНК и вторую цепь ДНК,
где 3'-участок первой цепи ДНК, и 5'-участок второй цепи ДНК образуют двухцепочечный участок из-за комплементарности последовательностей,
где концы указанного двухцепочечного участка, образованного 3'-участком первой цепи ДНК и 5'-участком второй цепи ДНК Y-адаптера совместимы с концами двухцепочечной молекулы ДНК,
где двухцепочечный участок ДНК Y-адаптера включает одну или несколько последовательностей штрихкодов, и
где 3'-участок второй цепи ДНК Y-адаптера образует петлю шпильки гибридизацией между первым и вторым сегментами в пределах упомянутого 3'-участка, где первый сегмент расположен на 3'-конце 3'-участка, а второй сегмент, находится в непосредственной близости от 5'-участка второй цепи ДНК, и/или
где ДНК Y-адаптера содержит, по меньшей мере, одну последовательность штрихкода в одноцепочечном участке Y-адаптера.
12. ДНК Y-адаптер по п. 11, отличающийся тем, что ДНК Y-адаптер имеет сайт рестрикции в 5'-участке первой цепи ДНК Y-адаптера.
13. ДНК Y-адаптер по п. 11 или 12, отличающийся тем, что ДНК Y-адаптер включает, по меньшей мере, одну последовательность штрихкода в одноцепочечном участке Y-адаптера, и в котором 3'-участок второй цепи ДНК Y-адаптера образует петлю шпильки гибридизацией между первым и вторым сегментами в пределах упомянутого 3'-участка, где первый сегмент расположен на 3'-конце 3'-участка, а второй сегмент, находится в непосредственной близости от 5'-участка второй цепи ДНК.
14. Библиотека адаптеров, включающая ДНК Y-адаптеры по любому из пп. 11-13, в которой каждый элемент библиотеки отличим от других по комбинаторной последовательности, расположенной внутри двухцепочечного участка, образованного 3'-участком первой цепи ДНК и 5'-участком второй цепи ДНК адаптера.
15. Набор, содержащий библиотеку Y-адаптеров по п. 14.
