Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления - RU2216547C2

Чертежи

Описание

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии и касается композиции для полимеризационной иммобилизации в полимерных носителях олигонуклеотидов, белков, нуклеиновых кислот или любых других молекул, содержащих в своей структуре активные группы, в том числе амино- или сульфгидрильные группы, а также способа иммобилизации различных молекул, в том числе олигонуклеотидов, белков, нуклеиновых кислот или любых других молекул, содержащих в своей структуре активные группы, в том числе амино- или сульфгидрильные группы, в составе пористого полимера, получаемого на основе предлагаемой композиции в условиях реакции присоединения или замещения (радикального, нуклеофильного, электрофильного и т.д.) в момент синтеза полимера при фото- и химическом инициировании полимеризации.

Предлагаемая композиция, а также способ иммобилизации молекул в полимерном носителе с использованием этих композиций могут быть использованы в различных приложениях, в том числе для изготовления микрочипов, находящих применение в молекулярной биологии при секвенировании и картировании ДНК, детектировании мутаций и целого ряда медицинских приложений.

Уровень техники
Известно, что при синтезе полимеров методом радикальной полимеризации независимо от способа ее инициирования (фото-, термическое, радиационное или химическое инициирование) используются циклические соединения или соединения, содержащие кратные связи [1]. 1. А.М. Шур, Высокомолекулярные соединения, М.: Высшая школа, 1981, с. 82-143.

Реакция протекает по радикальному цепному механизму через стадии инициирования, роста цепи и обрыва цепи. Такая природа радикальной полимеризации создает благоприятные условия для включения различных молекул, в том числе олигонуклеотидов, белков, нуклеиновых кислот, содержащих в своей структуре амино-, сульфгидрильную или другие активные группы, в структуру полимера. Возможны по меньшей мере два пути включения:
1. Участие молекул, содержащих в своей структуре амино-, сульфгидрильную или другие активные группы, в реакции передачи цепи с образованием аминильных, тиильных или других активных радикалов. Данные радикалы способны включаться в структуру полимера как на стадии роста цепи так и на стадии обрыва цепи при межмолекулярной рекомбинации [2, 3, 4]. 2. A. Good and J.C. Thynne, J. Chem. Soc., 1967, p.684; 3. C.J. Micheida and D.H. Campbel, J.Amer.Chem. Soc., 1976, 98, p.6728; 4. C.J. Micheida and D.H. Campbel, Tetrahedron Letters, 1977, p.577.

2. Участие молекул, содержащих в своей структуре амино-, сульфгидрильную или другие активные группы, в реакции нуклеофильного присоединения с ненасыщенными соединениями [5], существующими на разных стадиях полимеризации, а именно с исходными мономерами, растущими ненасыщенными макрорадикалами и ненасыщенными макромолекулами. 5. Общая органическая химия. Т.3, Азотсодержащие соединения./Под. ред. Н.К. Кочеткова, М.: Химия, 1982, с. 61-62.

Сущность изобретения
Сущность изобретения заключается в том, что предлагаются:
композиция для иммобилизации молекул, в том числе олигонуклеотидов, белков и нуклеиновых кислот, содержащих в своей структуре активные группы, в том числе амино- и/или сульфгидрильные группы, в полимерных носителях (полимерах) в условиях реакции присоединения или замещения (радикального, нуклеофильного, электрофильного и т.д.) в момент синтеза полимера при фото- и химическом инициировании полимеризации; и
способ иммобилизации молекул, в том числе олигонуклеотидов белков и нуклеиновых кислот, содержащих в своей структуре активные группы, в том числе амино- и/или сульфгидрильные группы, в полимерных носителях (полимерах) в условиях реакции присоединения или замещения (радикального, нуклеофильного, электрофильного и т. д. ) в момент синтеза полимера при фото- и химическом инициировании полимеризации.

Предлагаемая композиция и способ иммобилизации различных молекул в полимерном носителе с использованием этой композиции будут использоваться в различных приложениях, в том числе для изготовления микрочипов.

Для иммобилизации молекул, содержащих в своей структуре активные группы, в том числе амино- или сульфгидрильные группы, в полимерных носителях изобретением предлагается композиция следующего состава:
К=A^a+B^b+C^c+D^d+E^e +F^f
где К - композиция;
А - акриламид, метакриламид, N-[трис(гидроксиметил)метил]акриламид, 2-гидроксиэтилметакрилат или другой мономер на основе производных акриловой, метакриловой, коричной, кротоновой, винилбензойной или других непредельных кислот;
В - N, N'-метиленбисакриламид, N,N'-1,2-дигидроксиэтиленбисакриламид, полиэтиленгликольдиакрилат, их смесь или другой симметричный или несимметричный сшивающий агент на основе производных акриловой, метакриловой, коричной, кротоновой, винилбензойной или других непредельных кислот;
С - олигонуклеотид, нуклеиновая кислота, белок или другая молекула, несущая активную группу, в том числе амино- или сульфгидрильную группу;
D - глицерин, сахароза или полиспирты;
Е - вода, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид и другие полярные и неполярные растворители;
F - персульфат аммония, персульфат калия, метиленовый синий, флуоресцеин, N, N,N', N'-тетраметилэтилендиамин, пероксид водорода, N,N-диметиламинопиридин, триэтиламин, ацетон или любой другой инициатор для химического или фотоинициирования полимеризации.

a, b, c, d, e, f - процентное содержание (X) каждого компонента в композиции (X=m/v•100%, для твердых веществ, или X=v/v•100% для жидких веществ).

3≤а+b≤ 40%; 0≤с≤10%; 0≤d≤95%; 0≤e≤95%, 0≤f≤90%.

Наряду с полимерами иного назначения, указанную выше композицию предлагается использовать для изготовления олигонуклеотидных, белковых, ДНК(РНК) и других биологических микрочипов.

В заявляемой композиции для изготовления биологических микрочипов предлагается использовать следующие компоненты:
Мономеры, составляющие основу формируемого полимерного носителя.

В качестве мономеров, образующих линейный полимер, могут быть использованы производные акриловой, метакриловой, коричной, винилбензойной, кротоновой или других непредельных кислот, в том числе их сложные эфиры и амиды, например, акриламид, метакриламид, N-[трис(гидроксиметил)метил]акриламид, 2-гидроксиэтилметакрилат, метилметакрилат.

В качестве сшивающих агентов для образования трехмерных гелевых структур используются соединения, содержащие в своей структуре два и более непредельных фрагмента, хотя бы один из которых активен в реакциях присоединения или замещения (радикальном, ауклеофильном, электрофильном, и т.д.), например, N, N'-метиленбисакриламид, N, N'-метиленбисметакриламид, N,N'-1, 2-дигидроксиэтиленбисакриламид и т. д. или симметричные и несимметричные эфиры, амиды и смешанные производные акриловой, метакриловой, коричной, кротоновой, винилбензойной или других непредельных кислот.

Общее содержание мономера, образующего линейный полимер, (А) и сшивающего агента (В) в композиции лежит в интервале 3-40% (3<Т<40), а их соотношение находится в пределах 97:3-60:40% (3<С<40).

Различные сочетания и соотношения мономеров позволяют получать полимеры, с заданной величиной пор.

Олигонуклеотиды, белки, нуклеиновые кислоты, несущие в своей структуре активные группы, в том числе амино- и сульфгидрильные группы.

Для иммобилизации олигонуклеотидов, нуклеиновых кислот, белков или других молекул в полимерном носителе в момент его синтеза при химическом и фотохимическом инициировании необходимо, чтобы иммобилизуемые молекулы содержали активные группы, способные вступать в реакции присоединения или замещения (радикального, нуклеофильного, электрофильного и т.д.) с фрагментами формируемого полимера в момент его синтеза. В частности, в качестве таких активных групп изобретением предлагаются амино- и сульфгидрильные группы.

Олигонуклеотиды, содержащие в своей структуре амино- или сульфгидрильные группы, получают в условиях стандартной фосфорамидитной химии с использованием доступных в продаже фосфордиамидитов.

Фрагменты ДНК с амино- или сульфгидрильной группой получают в условиях симметричной или ассиметричной полимеразной цепной реакции с использованием синтетического праймера, несущего терминальную амино- или сульфгидрильную группы [6] или аминированием фрагментов ДНК по методике, приведенной в работе [7] . 6. Yasunaga, S., Kimura, A., Hamaguchi, К., Ronningen, К.S., and Sasazuki, Т., Tissue Antigens, 1996, 47, 37-48; 7. Proudnikov D, Timofeev E, Mirzabekov A., Anal Biochem. 1998, 15; 259 (1), р. 34-41.

Молекулы белков, содержащие свободные амино-, сульфгидрильные и другие активные группы используют для иммобилизации в нативном виде, без дополнительных модификаций.

Содержание молекул с активными группами (С) в композициях варьируется в пределах 0≤ с≤10%.

Среда, используемая для иммобилизации молекул с амино- и сульфгидрильными группами в полимерных носителях.

В качестве среды для полимеризационной иммобилизации молекул предлагаются вода, водные растворы поливинилового спирта, сахарозы, N,N-диметилформамида, диметилсульфоксида или других полярных водорастворимых и неполярных соединений, а также безводные диметилсульфоксид, N,N-диметилформамид и формамид и т. д. Содержание воды (E) в композиции варьируется в пределах 0-95% (v/v), компонента (D) 0-95% (m/v; v/v).

В растворы для полимеризации могут быть добавлены различные соединения, например, глицерин, для получения композиции различной вязкости, позволяющие варьировать размер гелевых элементов микрочипа при фиксированном диаметре пина робота.

Инициаторы для химического и фотоинициирования.

Для инициирования радикальной полимеризации при синтезе полимерного носителя предлагается использовать инициаторы и промоторы полимеризации, растворимые в воде и органических средах, а именно: персульфат аммония, персульфат калия, пероксид водорода, соли двухвалентного железа, N,N,N', N'-тетраметилэтилендиамин, триэтиламин, перекись бензоила, динитрил-азобисизомасляной кислоты, N, N-диметиламинопиридин, ацетон, метиленовая синь, флуоресцеин.

Для модификации поверхности стекла с целью ковалентного связывания полимерного носителя с поверхностью предлагаются следующие реагенты: 3-(триметоксисилил)пропилметакрилат, 3-(триметоксисилил)пропилметакриламид, N-[3-(триметоксисилил)пропил]акриламид, (3-глицидилоксипропил)триметоксисилан.

Такой спектр модифицирующих агентов позволяет получать надежную связь полимера со стеклом в широком диапазоне рН среды (2-12) и температуры (-10^oС-100^oС).

Различные сочетания компонентов композиции позволяют получать полимерные носители, пористость которых может варьироваться в широких пределах и позволяет использовать данные носители для многих приложений, в частности для изготовления биочипов.

Изобретением предлагается способ иммобилизации молекул, в том числе олигонуклеотидов, белков и нуклеиновых кислот, содержащих в своей структуре активные группы, в составе линейного или трехмерного пористого полимера, получаемого на основе композиции состава:
К=A^a+B^b+C^c+D^d+E^e+F^f
где К - композиция;
А - акриламид, метакриламид, N-[трис(гидроксиметил)метил]акриламид, 2-гидроксиэтилметакрилат или другой мономер на основе производных акриловой, метакриловой, коричной, кротоновой, винилбензойной или других непредельных кислот;
В - N,N' - метиленбисакриламид, N,N'-1,2-дигидроксиэтиленбисакриламид, полиэтиленгликольдиакрилат, их смесь или симметричный или несимметричный сшивающий агент на основе производных акриловой, метакриловой, коричной, кротоновой, винилбензойной или других непредельных кислот;
С - олигонуклеотид, нуклеиновая кислота, белок или другая молекула, несущая активную группу, в том числе амино или сульфгидрильную группу;
D - глицерин, сахароза или полиспирты;
Е - вода, N, N-диметилформамид, диметилсульфоксид и другие полярные и неполярные растворители;
F - персульфат аммония, персульфат калия, метиленовый синий, флуоресцеин, N, N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, пероксид водорода, N,N-диметиламинопиридин, триэтиламин, ацетон или любой другой инициатор для химического или фотоинициирования полимеризации.

a, b, c, d, e, f - процентное содержание (X) каждого компонента в композиции (X=m/v• 100%, для твердых веществ, или X=v/v•100% для жидких веществ).

3≤а+b≤40%; 0≤с≤10%; 0≤d≤95%; 0≤ e≤95%, 0≤f≤90%.

Предпочтительно для целей данного изобретения полимер получают полимеризацией смесей (А+В) из сочетаний акриламида, метакриламида, N-[трис(гидроксиметил)метил] акриламида, N, N'-метиленбисакриламида, N,N'-(1,2-дигидроксиэтиленбисакриламида, полиэтиленгликольдиакрилата.

Предпочтительно, когда молекулы, в том числе олигонуклеотиды, белки и нуклеиновые кислоты, содержащие в своей структуре активные группы, в том числе амино- и/или сульфгидрильные группы, реагируют с фрагментами формируемого полимерного носителя (полимера) в момент его синтеза в условиях реакции присоединения или замещения (радикального, нуклеофильного, электрофильного и т.д.) при фото- или химическом инициировании полимеризации.

Кроме того, олигонуклеотиды, содержащие активные группы, в том числе амино- и/или сульфгидрильные группы, аминированная ДНК, ДНК с включенной сульфгидрильной группой, а также белки перед процессом иммобилизации не подвергаются модификации.

Далее способ характеризуется тем, что иммобилизацию белков в полимерном носителе осуществляют либо по сульфгидрильным группам, либо по аминогруппам, либо по третьим функциональным группам аминокислот.

Далее способ характеризуется тем, что иммобилизацию олигонуклеотидов в полимерном носителе осуществляют либо по 5'-концу олигонуклеотида, либо по 3'-концу олигонуклеотида.

Дополнительно заявленный способ характеризуется тем, что сформированный слой полимера связан с подложкой ковалентно либо ковалентно не связан с указанной подложкой.

Причем указанный сформированный на подложке слой полимера представляет собой трехмерный гель.

Далее сформированный на подложке слой полимера представляет собой сплошной непрерывный слой.

Дополнительно сформированный на подложке слой полимера разделен пустыми промежутками на несколько ячеек, причем каждая из ячеек может содержать либо не содержать иммобилизованные макромолекулы, а макромолекулы иммобилизованные в разных ячейках могут различаться по своей природе и свойствам.

Упомянутые выше ячейки образуют регулярную одномерную или двумерную структуру (массив).

Предпочтительно осуществлять нанесение полимеризационной смеси на подложку при помощи автоматического устройства (робота), снабженного одним или несколькими микродиспенсерами, причем названные микродиспенсеры могут быть микродиспенсерами стержневого типа или бесконтактными микродиспенсерами струйного типа. Более того, в способе могут быть использованы несколько микродиспенсеров, которые образуют регулярную структуру.

Кроме того, одна или несколько подложек с нанесенными на них каплями композиции перед полимеризацией и в процессе нее размещаются в герметичном контейнере в безкислородной инертной атмосфере с контролируемой влажностью.

Способ предполагает, что названный контейнер заполняется одним из следующих газов: N₂, Ar, CO₂,
и газовая среда в контейнере с подложками непрерывно или периодически обновляется.

Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется с помощью фигур, где на
фиг. 1 представляет результаты гибридизации на биочипе олигонуклеотида, меченного флуоресцентным красителем Texas Red (5'-CTCAGTTC-tEXrED), С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ В ГЕЛЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОМ. Олигонуклеотид с 5'-концевой аминогруппой

Композиции:
1 (метакриламид:N, N'-метиленбисакриламид - Т, 5%; С, 5%);
2 (акриламид:N,N'-метиленбисакриламид - Т, 5%; С, 5%).

Фиг. 2 показывает результаты гибридизации на биочипе флуоресцентно меченной пробы с иммобилизованным фрагментом ДНК.

Фрагмент ДНК, выделенный из тимуса теленка и подвергнутый процедуре аминирования, иммобилизуют в геле на основе композиции 3 (В) и гибридизуют с флуоресцентно меченным олигонуклеотидом 5'-CTCAGTTC-TexRed. В качестве контроля иммобилизуют аналогичный фрагмент ДНК, не подвергавшийся аминированию (А). Флуоресценция наблюдается в ряду В. Отсутствие флуоресценции в ряду А показывает, что иммобилизации фрагмента ДНК, не подвергавшегося аминированию, не происходит.

Фиг. 3 показывает результаты иммуноанализа на биочипе. Биочип содержит иммобилизованные в геле (на основе композиции 4) моноклональные антитела к зеленому флуоресцирующему белку (Ab-GFP), α-фетопротеину (Ab-AFP) и иммуноглобулинам G человека (Ab-HIgG), а также иммуноглобулины G человека (HIgG). Концентрация антител в геле, мкг/мл: 630 (ряд 1), 315 (ряд 2), 210 (ряд 3), 130 (ряд 4), 60 (ряд 5), 40 (ряд 6). Антитела проявляли зеленым флуоресцирующим белком (a) и антителами к HIgG, меченными флуоресцеином (б).

Далее изобретение будет пояснено с помощью примеров, иллюстрирующих предпочтительные варианты осуществления изобретения. Эти примеры не должны восприниматься, как ограничивающие объем изобретения. Специалисты в данной области смогут найти многочисленные улучшения, которые также входят в объем притязаний данного изобретения и которые отражены в формуле изобретения.

Примеры
Пример 1. Иммобилизация олигонуклеотидов, содержащих алифатическую аминогруппу, в полимерном носителе
К раствору метакриламида (или акриламида) и N,N'-метиленбисакриламида в 3М N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамине в воде (1,25 мкл, 40% (m/v), 19:1) приливают раствор олигонуклеотида в воде (2,3 мкл, С=1нмол/мкл) и глицерин (6,45 мкл). Смесь тщательно перемешивают. Раствор наносят с помощью робота "GMS 417 Arrayr" на стекло, обработанное Bind-Silane. Полученный массив капель облучают ультрафиолетом (λ= 312 нм, 30 мин, Т=55^oС) в среде сухого аргона, отмывают в воде (4 ч, Т=60^oС) и высушивают на воздухе (Т=25^oС) в безпылевой атмосфере. В данном примере использованы композиции состава: А - метакриламид (или акриламид) ( 1 и 2), В - N,N'-метиленбисакриламид, С - олигонуклеотид, D - глицерин, Е - вода, F - N,N,N', N'-тетраметилэтилендиамин, a+b=5,00%, с=0,0006%; d=65,00%; e=20,00%, f=10,00%.

Полученный олигонуклеотидный микрочип использовали для проведения гибридизаций, PCR и т.д.

На фиг.1 приведен результат гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе, полученном по вышеприведенной методике.

Пример 2. Иммобилизация аминированной ДНК в полимерном носителе
Методика аналогична приведенной в примере 1.

Для иммобилизации использовали ДНК из тимуса теленка, аминированную по протоколу, приведенному в работе [7]. Концентрация ДНК в полимеризационной смеси С=1мг/мл. В данном примере использована композиция 3 состава: А - метакриламид, B - N,N'-метиленбисакриламид, С - ДНК, D - глицерин, Е - вода, F - N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамин, а+b=5,00%, с=0,00023%; d=65,00%; e= 20,00%, f=10,00%.

На фиг.2 приведен результат гибридизации на ДНК-микрочипе, полученном по вышеприведенной методике.

Пример 3. Иммобилизация белка в полимерном носителе
Методика аналогична приведенной в примере 1.

К раствору полимеризационной смеси приливают раствор нативного белка в боратном буфере (рН 8,3). Концентрация белка в полимеризационной смеси С=630 мкг/мл. Смесь тщательно перемешивают. Раствор наносят с помощью робота "GMS 417 Arrayr" на стекло, обработанное Bind-Silane. Полученный массив капель облучают ультрафиолетом (λ= 312 нм, 40 мин, T=27^oC) в среде сухого аргона. Далее белковые микрочипы отмывают в фосфатном солевом буфере (0, 01 М, рН 7,0), содержащем 0,1% Tween 20, затем выдерживают 1 час в фосфатном солевом буфере (0,01 М, рН 7,0), содержащем и 1% BSA и 5% сахарозы и используют для проведения различных типов анализа.

В данном примере использована композиция ( 4) состава: А - метакриламид, В - N, N'-метиленбисакриламид, С - белок, D - глицерин, Е - вода, F - N,N, N'N'-тетраметилэтилендиамин, а+b= 5,00%, с=0,0001%; d=65,00%; e=20,00%, f= 10,00%.

На фиг. 3 приведены результаты иммуноанализа на микрочипе.

Реферат

Изобретение относится к композиции состава К=А^а+В^b+С^с+D^d+E^e +F^f, где К - композиция; А - акриламид, метакриламид, N-[трис(гидроксиметил)метил]акриламид, 2-гидроксиэтилметакрилат, метилметакрилат или другой мономер на основе производных акриловой, метакриловой, коричной, кротоновой, винилбензойной или других непредельных кислот; В - N, N'-метиленбисакриламид, N,N'-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид, полиэтиленгликольдиакрилат, их смесь или другой симметричный или несимметричный сшивающий агент на основе производных акриловой, метакриловой, коричной, кротоновой, винилбензойной или других непредельных кислот; С - олигонуклеотид, нуклеиновая кислота, белок или другая молекула, несущая активную группу, в том числе амино- или сульфгидрильную группу; D - компоненты среды проведения полимеризационной иммобилизации, а именно глицерин, сахароза, полиспирты; Е - вода, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид и другие полярные и неполярные растворители; F - персульфат аммония, персульфат калия, метиленовый синий, флуоресцеин, N,N, N', N'-тетраметилэтилендиамин, перекись водорода, 4-(N, N-диметиламино)пиридин, триэтиламин, ацетон или любой инициатор для химического или фотоинициирования полимеризации; а, b, с, d, e, f - процентное содержание (Х) каждого компонента в композиции (Х= m/v•100% для твердых веществ или Х= v/v•100% для жидких веществ), 3