Штамм griсноsроrоn каsнiwаyама-продуцент вещества,обладающего стимулирующим действием на репаративные процессы кожи, и способ получения вещества, обладающего стимулирующим действием на репаративные процессы кожи - SU1327791A3

Код документа: SU1327791A3

Описание

Изобретение относится к микробиологии , в частности к микробиологическому производству лекарственных средств.

Цель изобретения - разработка способа получения вещества используемого для стимуляции репаративных процессов ко, и выявление штамма-продуцента , способного вырабатывать вещество , обладающее стимулирующим де ствием на репаративные процессы кожи

Штамм Trichosporon kashiwayama депонирован в коллекции культур НИИ ферментации, Япония, под номером FERM-P 4821 и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Форма и размер (жидкая-среда на солодовом экстракте ММ ) .

После культивирования в течение 3 Суток при наблюдаются клетки, имеющие прямоугольную или овальную . форму и размер (3-4) Х (2-20)мкм, после проведения культивирования в течение 5 сут и более форма клеток становится нерегулярной и, наконец, клетки становятся мйцелиоидными.

Образование псевдомицелия (куль- тзфа на предметном стекле, культу- ральная среда - агар с картофельным экстрактом)с

Клетки псевдогифальные или псевдо мицелиальные, имеют характерные зигзагообразные .артроспоры, но без конидий . I

Аскоспор клетки не

Аскоспоры. имеют.

Баллистоспоры, Баллистоспор клетки не имеют.

Культурапьные признаки.

Колония на агаровой культуральной среде со штриховой разводкой (агаровая культуральная среда на солодовом экстракте МЧО .

Тусклая, белая, волосовидная и грбая поверхность, очень мягкая, без подъемов, но с реснитчатой периферической частью.

Пленка на жидкой культуральной срде (жидкая культуральная среда на солодовом экстракте МЧ ).

Белая, волосовидная, хлопьевидная и прочная пленка.

На 50% (мае/мае) глюкозном агаре рост отсутствует, на 60% (мае/мае) агаровой среде с дрожжевым экстрактом не растет.

Физиологические признаки.

Ферментация углеводов.

Не ферментируют глюкозу, галактозу, сахарозу, лактозу, трегалозу, рафино- зу и инулин.

Ассимиляция источников углерода.

В-глюкоза+, В-гапактоза+, мальтоза- , рафиноза-, сахароза-, лактоза-, лактат натрия+, В-ксилоза+, эритрит-, 1)-маннит+, 1.-сорбоза+, инозитол-, трегалоза-, D-арабиноза-, L-арабино- за-, сукцинат натрия+, цитрат нат- рия+, ацетат натрия+, инулин-, раст- воримый крахмал-, этанол+, глицерин+, целлобиоза-, (+: используется, -: не используется).

Использование нитратов: не используются .

Использование нитритов: не ис- . пользуются.

Использование зтиламина гидрохлорида: не используется.

Разложение глюкозида. (арбутин)-: разлагается.

Образование аналогов крахмала:не образуется.

Образование пигмента: не образуется .

Образование сложных эфиров: образуются .

Реакция с лакмусовым молоком: не коагулирует.

Потребность в витаминах: не тре- бует.

Устойчивость к соли: критическая концентрация 6-8% (мае./об).

Оптимальная температура 25 С.

Оптимальное значение рН 5,0.

Разложение мочевины: не разлагается .

Рост при 37°С: не растет.

Образование кислоты из глюкозы: не образуется.

Устойчивость к цИклогексимиду: резистентен.

Жиры и масла разлагает.

Вьщеляет при культивировании на среде, состоящей из 0,3% (мае./об.) глюкозы, 0,5% (мае./об.) снятого молока и 0,05% (мае./об) дрожжевого экстракта, при рН 4,0-6,0 при 20-30 0 в течение 20 ч биологически активное ве щество, и фильтрат, содержащий данное вещество, имеет следующие свойства.

Бесклеточный очищенный фильтрат надосадочной жидкости культурально- го продукта содержит небольшие ко

личества а шнокислот, сахаридов и липидов. При проведении количественного анализа фильтрата оказалось что суммарный азот составляет 0,005 0,015%, а суммарный фосфор - 0,004 -0,014%.

Характер и состояние.

Фильтрат представляет собой прозрачную жидкость цветом от бесцвет- ного до слабо желтоватого и имеет слабый запах.

Пробы на подтверждение.

20 мл фильтрата упаривают на водной бане до уменьшения объема при- близительно до 50 мл. Затем к концентрату добавляют 1 мл раствора ни гидриновой пробы. После нагревания смеси в течение 30 мнн жидкость пре обретает фиолетовую окраску.

5 МП азотной кислоты добавляют к концентрату полученному проведением упариванием по известной методике, и смесь кипятят в течение 20 мин. Посл охлаждения смеси ее нейтрализуют 10%-ным раствором гидроокиси натрия Затем к смеси добавляют 2 мл раствора аммоний-молибдатной пробы. Если смесь нагревают, жидкость приобретает желтоватую окраску. Если к жид- кости добавляют 10%-ный раствор гидроокиси натрия, она становится бесцветной .

К 5 мл фильтрата добавляют 10 мг индоЛа и 2 мл хлористоводородной кис лоты, и смесь встряхивают достаточное время. Когда смесь затем нагревают в течение 10 мин, жидкость становится красной.

Физические характеристики:

Удельный вес

( )1,000-.1,015

Коэффициент пре1 ,330-1,340

4,5-5,5

Остаток после испарения ,%0,5-2,0 Содержание воды (согласно методу сушки при атмосферном давлении)% 98,7 Белки (коэффициент 6,25)Следы Содержание липидов (согласно методу экстракции в аппарате Сокслета),%0,2 Содержание волокон,% О

. ломления (п ) рН (25°С) .

. 5

- jo

25 зо

Содержание золы,% 0,1 Содержание сахара,% 1,0 Суммарное содержание сухого вещества,% (в пересчете на воду) 1,3 Содержание азота в ами-- ноформе, мг.% 10 Кислотность по титрованию , число МП 1 н щелочи , оттитрованных для нейтрализации 100 г образца0,6

Содержание азота в форме летучих оснований, м.%1

Содержание мышьяка (в виде ASjOj) Не выявлено (предел детектирования 0,1 ч/мин

Содержание тяжелых металлов (в виде РЬ) Не выявлено

(предел детектирования 1 ч/мин) Суммарное содержание ртутиНе выявлено

(предел детектирования

0,01 ч/мин)

Содержание кадмия Не выявлено (предел детектирования

0,01 ч/мин) Содержание кальция, мг.%14,7

Содержание фосфора , мг.%9,8 Содержание муравьиной кислоты Не выявлено (предел детектирования 0,1%)

Содержание уксусной кислотыНе выявлено (предел детектирования 0,01%). Содержание бутиро- вой кислотыНе выявлено (предел детектирования 0,01%) Содержание молочной кислоты, %0,06

Содержание лимонной

кислоты,%

Число жилых клеток

E.coli

Staphylococcus aureus

Число грибов Число дрожжей Содержание пропионо- вой кислоты

одержание витамиа В

одержание витамиа В, мг.%

уммарное содержание итамина С

одержание витамина В,

Содержание витамина В

0,02

Менее 30 клеток на 1 мл /-/

/-/

/-// мл /-// мл

Содержание сорбиновой кислоты

Бензойная кислота, г/кг

Сложный эфир п-гидро- ксибензойной кислоты

Не выявлено (предел детектирования 5 0,02 г/кг)

Не выявлено (пред ел детектиро- 20 вания 0,005 г/кг)

0,42

Не выявлено (предел детектирования .30 0,005 г/кг)

Не выявлено (предел детектирования 0,01 мг.%)

0,02

Не выявлено (предел детектирования 2 мг.%)

не выявлено (предел де- тектироваг ния 5 мкг.%) Не выявлено (предел де- тектирова- .- ния 0,05 мкг.%)

Содержание пантогеновой кислоты,

мг.%

Содержание холина

Содержание фолиевой кислоты

Содержание ниацина

Суммарное содержание каротина

Значение рН Аминокислотный состав аминокислоты в 100 г образца (цистин: метод окисления надмуравьиной кислотой, триптофан: анализ с помощью микроорганизмов)

Аргинин

Лизин

Гистидин

Фенилаланин

Тирозин

Лейцин

ИзолейцинМетионин

Валин

Алании

Глицин

Пролин

(предел детектирования 0,03%)

Не выявлено (предел детектирования 1 мкг.%) Не выявлено (предел детектирования , 0,03 мг.%)

Не выявлено (предел де- тектирова- ния 0,02 мг.%) 4,9

менее 0,01 менее 0,01 менее 0,01 Менее 0,01 Менее 0,01 Менее 0,01 Менее 0,01 Менее 0,01 Менее 0,01 Менее 0,01 Менее 0,01 Менее 0,01 Глутаминовая кислота Менее 0,01 СеринМенее 0,01

ТреонинМенее 0,01

Аспарагиновая кислотаМенее 0,01 Триптофан Менее 0,01 ЦистинМенее р,01 Бесклеточная стерильная надосадоч- ная жидкость может быть использована в качестве дерматологического лекарственного аппарата и без концентрирования . Однако предпр чтительно концентрировать бесклеточную стерильную надосадочную жидкость. Кроме того, возможно применение концентрата с высокой степенью концентрирования, превьшающей 25, или сухого продукта . Подобный концентрат, имеющий высокую степень концентрации или

сухой продукт, может использоваться -В качестве дерматологического лекарственного препарата. Кроме того, дерматологический препарат может быть получен смешиванием подобного концентрата , сильного концентрата или сухого продукта с кремом, мазевой основой или другим носителем.

Результаты испытания на токсичность с использованием куриного эмбриона показывают, бесклеточный стерильный концентрат (степень концентрирования 4) токсичностью не обладает . Результаты кожной аллергической пробы на теле человека и пробы на непрерывное раздражение кожи человека показывают, что концентрат совершенно нетоксичен для кожи человека . Результаты пробы на раздражение слизистой оболочки глаза кролика показывают, что концентрат не является раздражителем совсем. Результаты антибиотической пробы показывают , что концентрат не содержит антибиотических веществ.

Дерматологический препарат оказывает лечебный эффект в отношении кожных пятен, потрескавшейся кожи, контактных дерматитов и обожженой кожи.

Проба на излечение кожных пятен.

Отбирают 621 женщин, имеющих кожные пятна на лице, за исключением пациентов имеющих заболевание печени или гинекологические нарушения , а также беременных , поступивших в дерматологические гос- пит.али для излечения кожных пятен. После промывания лица кожные лоры отдерматит , предположительно вызван причинами, не связанными с данным лечением. Доля пациенток, для которых наблюдается значительное или ум

5 ренное улучшение, составляет 80%. К ме того, у 60% из 365 женщин, у кот рых состояние существенно улучшилось , пятна на коже исчезли полностью .

0 Проба на излечение трещин кожи и мелких морщинок.

Для банной пробы отбирают 962 же щин из числа поступивтчих в дерматол

J5 гические госпитали (150 женщин в в расте 25-30 лет, 218 женщин в возрасте 30-35 лет,- 248 в возр те 35-40 лет, 172 женщины в возра те 40-50 лет и 174 женщины в возрас

20 те свыше 45 лет). После промывания кожи лица поры- кожи открываются озо ном и паром, на кожу лица плотно на кладывают марлю, пропитанную концен ратом (степень концентрирования 2)

.бесклеточной надосадочной жидкости и марлю покрывают лентой из пленки Saran-Wrap. Облучение инфракрасными лучами проводят в течение 15-20 мин для улучшения проникания концентра30 та в кожу. Обнаружено, что после одной обработки потрескавшаяся кожа значительно улучшилась у 698 женщин (73%), сравнительно улучшалась у женщин (16%), состояние не из35 менилось у 72 женщин (7,2) и состояние не ухудшилось ни у одной из женщин, остается 36 женщин (4%). Учитвая тот факт, что растрескивание кожи развивается в конечном

крывают воздейст вием озона и пара,и на40 счете в мелкие морщинки, можно счи- область нахождения пятен наносят тать, что концентрат, являющийся

марлю, пропитанную концентратом (степень концентрирования 2) бесклеточной надосадочной жидкости. Нанесенную марлю покрывают лентой пленки марки Saran-Wrap и производят облучение инфракрасными лучами для улучшения проникновения концентрата в кожу. Эту обработку проводят раз в неделю и продолжают в течение 3 мес..Обнаружено , что состояние сильно улучшилось у 363 женщин (58,4%), состояние сравнительно улучшилось у 122 женщин (19,8%), никакого улучшения у 133 женщин (21,4%), состояние ухудшилось у одной женщины (0,01%) и контактный дерматит возник у остальных двух женщин (0,03%). Контактный

дерматит, предположительно вызван причинами, не связанными с данным лечением. Доля пациенток, для которых наблюдается значительное или умеренное улучшение, составляет 80%. Кроме того, у 60% из 365 женщин, у которых состояние существенно улучшилось , пятна на коже исчезли полностью .

Проба на излечение трещин кожи и мелких морщинок.

Для банной пробы отбирают 962 женщин из числа поступивтчих в дерматологические госпитали (150 женщин в возрасте 25-30 лет, 218 женщин в возрасте 30-35 лет,- 248 в возрасте 35-40 лет, 172 женщины в возрасте 40-50 лет и 174 женщины в возрасте свыше 45 лет). После промывания кожи лица поры- кожи открываются озоном и паром, на кожу лица плотно накладывают марлю, пропитанную концентратом (степень концентрирования 2)

.бесклеточной надосадочной жидкости и марлю покрывают лентой из пленки Saran-Wrap. Облучение инфракрасными лучами проводят в течение 15-20 мин для улучшения проникания концентрата в кожу. Обнаружено, что после одной обработки потрескавшаяся кожа значительно улучшилась у 698 женщин (73%), сравнительно улучшалась у женщин (16%), состояние не изменилось у 72 женщин (7,2) и состояние не ухудшилось ни у одной из женщин, остается 36 женщин (4%). Учитвая тот факт, что растрескивание кожи развивается в конечном

эффективным с точки зрения лечения растрескивания кожи, оказывает профилактический эффект, препятствуя 45 образованию мелких морщинок.

Проба на лечебный эффект в отношении контактных дерматитов.

Выбрана женщина, 21 год, страдающая сыпью и жжением на веках обоих гл аз, возникающими на следуюш 1й день после смены теней для век фирма А на тени для век фирмы Б, диагноз - контактный дерматит. Дерматологом на пораженные участки нанесена марля, пропитанная концентратом (степень концентрирования 2) бесклеточной надосадочной жидкости. Не использовалось никаких стероид0

913277911.0

пых препаратов, противовоспалитель- шом перемешиваемом ферментационном ных и антигистаминовых веществ.Паци- аэротенке. Затем культивацию прово- ентке представлено около 20 мл кон- дят при в течение 70 ч в усло- центрата, концентрат наносят на 30 мин виях аэрации и перемешивания. Посдважды в сутки, т.е. утром и вечером,5 завершения ферментации культу- .Спустя 48 ч после начала лечения ральную жидкость пропускают через прекратилось жжение, а спустя 96 ч фильтровальный аппарат модели после начала лечения сьть по сущест- МР 293-16 производства фирмы (Най- ву исчезла. Спустя 1 неделю сыпь не гай Секухин Коге К.К. (фильтровальнаблюдается совсем; О ная бумага GL-90 производства фирПроба на лечение ожогов.мы Тое Роси, 0,5 мкм) и через фильтЖенщина 47 лет, имеющая ожог, ровальный агрегат модели МР-293-4 возникший в результате обваривания производства той же фирмы (мембран- горячей водой, на наружной части ный фильтр-ТМ-2 производства фирмы

левого предплечья (ожог II степе- 5 Тое Роси, 0,45 мкм) для удаления ни) с высыпанием и припухлостью вели- твердых частиц и клеток. Получен- чиной с ладонь, а также мелкими пу- ный фильтрат концентрируют в соответ- зырьками, обратилась к дерматологу ствии с методом использования мемб- спустя 1 ч после обваривания. Пора- раны обратного осмоса в аппарате моженный участок немедленно охлаждают20 дели производства фирмы Байоинджи- проточной водой, на пораженный учас- ниринг Ко так, чтобы объем умень- ток наносят марлю, пропитанную кон- шился до 200 л. Полученный концент- центратом (степень концентрирования 2) рат стерилизуют с использованием теп- бесклеточной стерильной надосадоч- лообменника тарельчатого типа ной жидкости и на нее накладывают пер- (производства фирмы Иван Кикай Коге гаментную бумагу. Затем на поражен- К.К.), стерильно упаковывают в ный участок накладывают повязку. стеклянные емкости и хранят в хо- Спустя 24 ч обнаружено, что мелкие лодильнике (5 С). пузырьки совершенно исчезли, хотя П р и м е р 2. Стерилизованный

высыпание и припухлость остались и-30 концентрат, полученный в примере 1, пациентка прекратила жаловаться на сушат вымораживанием и полученный боль.порошок смешивают со стерильной мазеМужчину 30 лет, имеющего ожог в вой основой с получением мази для результате обваривания горячей водь кожи.

на задней части правой ноги (ожог Ц35 П р и м е р 3. Косметический

степени) с высьшанием и припухлое- препарат получают введением 1 г сте- тью размером с куриной яйцо, обраба- рилизованно1 о концентрата, получен- тывают концентратом (степень концент- ,ного в примере 1, в косметическую рирования 2) бесклеточной стериль- основу, состоящую из 1 г стеариной надосадочной жидкости по методи-40 новой кислоты, 7 г пчелиного воска, ке, описанной вьш1е. Спустя 24 ч при- 4 г самоэмульгируемого глицерина мо- пухлость исчезла, хотя высыпание ос- ностеарата, 30 г жидкого парафина, талось, и пациент прекратил жаловать- 0,1 г водного ланолина и 40 г очищен- ся на боль.ной воды, и пластифицированием смеси

т, ,;. в соответствии с традиционными метоТаким образом, концентрат оказы- - w „ диками. Композицию разливают и упа- вает сильно а вьфаженныи лечебный « . v t- эффект в отн ошении ожогов. ковывают в ампулы, и упакованные амПримеров перемешиваемый направляют на.продажу,

ферментационный аэротенк емкостью„ П р и м е р 4. Лекарственный пре1000 л загружают 800 л культураль- ° Р лечения кожных заболеваний ной среды, имеющей описанный вьш1е получают введением подходящих коли- состав, и после стерилизации нагрева- / пиридоксина гйдрохлорида нием и естественного охлаждения Y -оризанола, аллатоина, DL-i-токоэту культуральную среду инокулируют„ (витамина Е) и мятного масла

.; „эз В КОМПОЗИЦИЮ, полученную в примере 3. затравкой, образованной осуществле-

нием предварительной культивации Формула изобретения при 28°С в течение 30 ч в 10 л1 .Штамм Trichosporon kashiwayama

той же культуральной среды в неболь- FEKK-P 4821 (Коллекция культур

11 132779112

FERM, Япония) - продуцент вещества,щей глюкозу Of37,, (мае./об), снятое

обладающего стимулирующим действиеммолоко 0,5% (мае.об), дрожжевой

на репаративные процессы кожи.экстракт 0,05% (мае.об), при рН

2. Сйособ получения вещества, об-4,0-6,0 и температуре 20-30°С, в аэ- ладающего стимулирующим действием.на робных условиях, затем отделяют био- репара тивные процессы кожи, заклю-массу в стерильных условиях и получающийся в том, что штамм Trichospo-ченный стерильный фильтрат при необ- гоп kashiwayama FERM-P 4821 выращи-ходимости концентрируют и/или высушивают в питательной среде, содержа-вают.