Способ получения 19-эпидианемицина и штамм @ @ атсс 39205,используемый для получения 19-эпидианемицина - SU1296010A3

Код документа: SU1296010A3

Описание

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотика.

Целью изобретения является создание способа получения нового антибиотика и штамма, продуцирующего данный антибиотик.

Штамм Streptomyces hygroscopicus выделен из образца почвы, взятого в Вашингтоне, Д.С. Депонирован в American Туре Culture Collection под номером АТСС 39205.

Культурально-морфологические признаки .

Агар на дрожжево-солодовом экстра- кте. Рост хороший, рыжевато-коричневый с желтоватыми краями мембран, умеренно приподнятый, складчатый до пленочного, воздушньм мицелий отсутствует . Обратная сторона бледно-желтоватая с коричневыми линиями, растворимый пигмент коричневый.

Агар с овсяной мукой. Рост умеренный , белый, желтоватый до серого, почти серые серии. Тонкий до слегка приподнятого, гладкий) гигроскопичный в некоторых участках воздушный мицелий такой же, как поверхность; обратная сторона бесцветная, кремовая до - серой, почти серые серии; растворимый пигмент бледно-желтоватьш.

Агар с неорганическими слоями и крахмалом. Рост умеренньй до хорошего j желтоватый до серого, почти серые

серии; тонкий до приподнятого, гладкий , но по краям складчатый, гигроскопический на некоторых участках; воздушньш мицелий такой же, как поверхность . Обратная сторона бледно- желтоватая до серой, почти серые серии; растворимый пигмент бледно-желтоватьш .

Агар с глицерин-аспарагином. Рост плохой до умеренного, бесцветньй до кремового (почти серые серии); тонкий , гладкий, воздушный мицелий от-; сутствует. Обратная сторона бесцветная , растчзоримьй пигмент отсутствует

Агар с глюкозой-аспарагином. Рост хороший, белый до кремового, припод- нятьш, складчатый,воздушный мицелий белый, обратная сторона бледно-желтоватая , растворимый пигмент бледно-желтоватый .

Смесь агара Чапека и сахарозного агарз. Рост умеренньй до хорошего; кремовьй, тонкий, гладкий с размытыми краями, нет воздушного мицелия; об

ратная сторона бесцветная до кремовой; растворимьш пигмент кремовый.

Агар Эмерсона. Рост хороший, рьгае- вато-коричневый, приподнятый, гладкий до слегка складчатого; воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона такая же, как поверхность. Растворимый пигмент коричневый. ,

Питательньш агар - рост умеренный, кремовый, слегка приподнятый, гладкий или наблюдающийся в виде отдельных колоний; воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона бледно-желтоватая ,, Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Беннета. Рост хороший, кремовый , умеренно приподнятый, складчатый до ребристого, воздушного мицелия либо нет, либо он рассеянный, бельй; обратная сторона кремовая до бледно- 0 серовато-желтой; растворимый пигмент бледно-желтоватый.

Тирозиновый ajfap Гордона и Смита. Рост плохой до умеренного, желтовато- коричневьй до темно-коричневого, тонкий до слегка приподнятого, гладкий, воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона темно-коричневая; растворимый пигмент коричневьй до черного.

Агар с малатом кальция. Рост умеренный , кремовый, тонкий до слегка приподнятого, гладкий; воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона такая же, как поверхность; раствори- мьй пигмент отсутствует.

Казеиновьй агар. Рост умеренньй до хорошего, кремовый, слегка припод- нятьй, гладкий: до слегка морщинисто5

го, воздушньй мицелий отсутствует. Обратная сторона кремовая; раствори- мьй пигмент розовато-коричневьй.

Желатиновьш агар. Рост хороший, кремовьй, умеренно приподнятьй, глад- кий, у краев складчатьй; воздушньй - мицелий отсутствует; обратная сторона такая же, как поверхность; раствори- мьй пигмент кремовьй.

Агар с кразсмалом. Рост хороший, кремовьй, умеренно приподнятьй, складчатьй , у краев гладкий; воздушный мицелий отсутствует; обратная сторона такая же, кик поверхность; раствори- мьй пигмент кремовьй.

Агар с картофелем и морковью. Рост умеренньй, кремовый, тонкий, гладкий; воздушньй мицелий рассеянньйэ бельй; обратная сторона бесцветная до кремовой; растворимьй пигмент отсутствует.

Агар на водопроводной воде. Рост плохой, бесцветный, до кремового, тонкий, гладкий, в основном погруженный , воздушный мицелий рассеянный, белый, обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует.

Морфологию изучают на агаре с неорганическими солями через 14 дней инкубирования: споровая масса в сери серого цвета; споровые цепи в секции спиралей слегка открыты, небольшого диаметра (6-10 мкм длины и 3-4,5 мкм ширины) 3-6 витков на спираль, 8 - 30 спор на споровую цепь; спорофоры моносподиево разветвленны, иногда му товчато разветвленны; споры овальные до эллиптических, иногда формы палочек ладьеобразные-, 1,2-2,0x0,9- -1,2 мкм, с наростами по данным ска- нирующей электронной микроскопии. Физиолого-биохимические свойства. Меланин не вырабатывает, сероводород образует, желатин ожижает, крахмал гидролизует, нитраты восстанав- ливает до нитритов.

Целлюлозу не разлагает. Молоко просветляет без коагуляции.

Казеин переваривает, малат кальция переваривает, тирозин переваривает .

Усваивает глюкозу, арабинозу, фруктозу , инозитол, маннитол, раффинозу, рамнозу, сахарозу и ксилозу.

Хорошо растет при 21-28 С, умерен ньй рост при 37°С, отсутствует рост при .

Стенки клеток содержат ZZ-диамино пимелиновую кислоту, но не содержат характеристических Сахаров.

Пример 1. Готовят питательну среду следующего состава, г/л: Церилоза20,0

Соевая мука10,0

Растворимые в дистилли-

рованной воде вещества 5,0 Сульфат натрия0,5

Хлорид кобальта0,002

Карбонат кальция 2 В качестве растворимых в воде веществ используют ростстимули- рующие вещества: вытяжки из зерен , рыбную муку, муку хлопковых семян, дрожжевой экстракт. 100 мл среды помещают в 300-мил- лилитровые встряхиваемые колбы и стерилизуют при 120°С и давлении 15 пси в течение 30. мин. После охлаждения среду инокулируЮт суспензией вегета -

10 5 20

50 55 30

тивных,клеток Streptomyces hygrosco- picus АТСС 39205, выращенных на среде АТСС 172-агар. Колбы встряхивают при 28°С на роторном шейкере со смещением 3,7-7,5 см и 150-200 циклов/мин в течение 3-4 дней. Одну колбу используют для инокуляции 5-литрового ферментера , заполненного 3 л питательной среды следующего состава, г/л: церилоза 20,0, соевая мука 10,0, растворимые в дистиллированной воде вещества 5,0, сульфат натрия 0,5,- карбонат кальция 2,0, хлорид кобальта 0,002, рН 6,9-7,0.

В качестве антивспенивающего агента добавляют 1 мл Z61 силикона, и ферментер герметизируют и стерилизи- руют при 120°С в течение 45 мин. Сосуды инокулируют из одной колбы (в расчете на 3% инокулюм), ферментируют в течение 96-168 ч при , перемешивают со скоростью 1700 об/мин, со скоростью подачи воздуха V воздуха на V жидкости в минуту.

После завершения ферментации куль- туральную жидкость фильтруют при натуральном рН с помощью диатомовой земли. Фильтровальную лепешку измельчают в метаноле, фильтруют, растворитель концентрируют в вакууме, разбавляют 2-3 объемами воды, затем дважды экстрагируют 1/3 до 1/2 объемами ра- створителя, например, метилизобутил- кетона. Слои растворителя отделяют от водной фазы испарением или центрифугированием , а затем концентрируют в вакууме до вязкого масла.

Антибиотик можно вьщелять экстрагированием культуральной жидкости при нормальном рН метилизобутилкетб- ном, удалением растворителя и концентрированием до вязкого масла. Масло суспензируют в гептане и порцию обрабатывают силикагелем 60. Силика- гельную лепешку элюируют хлороформом, смесью хлороформа: этилацетат и этил- ацетатом. После концентрирования этилацетатной фракции получают неочи- щенньш продукт, и.з которого 19-эпи- дианемицин кристаллизуется в виде смеси натрий/калиевой сол11.

В результате исследований с помощью тонкослойной хроматографии неочищенного продукта в системахj каждая из которых разделяет смесь дианеми- цина и 19-эпидианемицина, обнаружен только 19-эпидианеми1и1Н (таблица).

Зтилацетат- 0,3 0,4

Хлороформ:ацетон 1:10,42 0,49

Этилацетат:

гхлороформ 2г1 OJ5 0,22

Аналогичные результаты получают при использовании следующих сред,

Среда М, содержащая, г/л: целлкхпо- за 10,0, кукурузный крахмал 10,0, соевая мука 10,0, твердый продукт из кукурузы, усвояемый 5,0, хлорид натрия 5,0, карбонат кальция 1..0, вода до 1 л. рН 6,9-7,0.

Среда М, содержащая, г/л: за 10,0j крахмал 20,0, дрожжевой экстракт 5jO, хлорид кобальта 0,002, NZ амин А 5,0, карбонат кальция IjO, вода до 1 л, рН 6,9-7,0,

Пример2. Инокулюм выращивают во встряхиваемых колбах, содержащих Oj7 л среды с. Z 13 М, в течение 3-5 дней при и используют для инокулирования 6434,5-литрового ферментера , содержащего 4542 л среды CZ13 М, На одну емкость используют приблизительно 1 л (0,05%) инокулюма„ Продукт ферментации после 4 дней собирают приблизительно Б количестве 4164 Ло Бульон экстрагируют 1/5 объема метилизобутилкетона при нейтральном рН, выделяют на экстракторе и раствсй итель упаривают в вакууме до масла« Получают 30,3 л концентрата

Полученное масло концентрируют далее в циклонном испарителе до сиропа . После концентрирования полученное масло суспендируют в гептане, переме- пшвают с силикагелем, затем фильтруют через слой силикагеля и повторно про- мьгоают гептаном. Антибиотик элюируют последовательно хлороформоТ., смесью хлороформ-этилацетат, этилацетатом и 50%-ным .ацетономв этилацетате. Активные фракции объединяют, концентрируют и повторно хроматографируют для выделения антибиотика. Пропускание активных элюатов вниз через гранули- рованньй уголь Дарко дает возможность удалить посторонние примеси и повы20

2,5

12960106

сить выход. Получают 40 г кристаллического 19-эпидианемицина.

Пример 3. Приблизительно 4164 л фермента1щонной среды Stri. hy- groscopicus АТСС 39205 получают по примеру 2. Весь бульон экстрагируют 1/5 объемом метилизобутилТсетона и экстракт концентрируют в вакууме до коричневого масла (приблизительно 3,79 л). Концентрат выливают в 11,4 перемешиваемого гептана и полученную взвесь фильтруют через слой диатомовой земли,

Полученньй фильтрат обрабатывают 3 кг силикагеля 60 в колонне (70- 230 мешей). Силикагель промывают пор- цийми по 11,4 л гептана, хлороформа, ацетона и метанола. Эти фракции исследуют тонкослойной хроматографией и обнаруживают, что 19-эпидианемицин находится преимущественно во фракциях из ацетона и хлороформа.

Ацетоновую фракцию (180 г) хроматографируют на колонке 8x100 см, набитой силикагелем Мегск 60 (230- 400 мешей) в этилацетате. В качестве элюирующего растворителя используют этилацетат. Скорость потока составляет 70 мл/мин и отбирают фракции приблизительно по 1 л каждая. Эти фракции исследуют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля Analtech GF, проявленных в этилацетате . Эти пластины проявляют, опрыскивая ванилиновым реагентом (3 г ванилина в 75 мл этанола и 25 мл 85%-ной фосфорной кислоты) и нагревая до . В этих условиях 19-эпидианемицин появляется в виде пурпурного пятна.

Фракции, содержащие 19-эпидианемицин , объединяют и выпаривают. Полученньй концентрат растворяют в 1 л хлороформа, промывают 1 л подкисленной воды (рН 4), затем 1 л буфера 5% двухосновного фосфата натрия (рН 9), сушат- над безводньм сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают. Полученный концентрат помещают в ацетон и добавляют небольшое количество (приблизительно 10%) воды, после чего 19-эпидианемицин кристаллизуется в виде натриевой соли. Кристаллы собирают фильтрованием и сушат в вакууме при комнатной температуре. Выход составляет 23 г натриевой соли.

Хлороформовую фракцию после обработки силикагелем (280 г) повторно растворяют в 1 л хлороформа и пропускают через колонку 7x120 см, набитую

гранулированным активированным углем в хлороформе. Ее элюируют хлороформом со скоростью 20 мл/мин и собирают фракции по 300 мл. Фракции, содержащие антибиотик, объединяют и концентрируют . Концентрат кристаллизуют в виде натриевой соли для ацетоновой фракции. Выход 14 г. Второй раз получают еще 10 г неочищенного материала.

Натриевая соль 19-эпидианемицина плавится при 193-205°С.

им,

157;

УФА,о.« 232

i.p +11,0° (, метанол).

Вычислено, %: С 63,49; Н 8,73; О (по разности) 27,78.

C-,.H,,0,,Na.

Найдено, %: С 63,10; Н 8,86; О 28,04.

Свободную кислоту получают, промывая хлороформовый раствор натриев соли подкисленной водой (рН 4), а затем выпаривая хлороформ. Кристаллизация этого соединения не происходит и оно получается в стеклообразн виде.

Вычислено, %: С 65,10; Н 9,06; О (по разности) 25,84. С/п Н gO .

1°|.

232 нм Е 163 (, метанол)

Редактор С.Патрушева

Составитель Г.Смирнова ТехредЛ.Сердюкова Корректор Л.Пилипенко

Заказ 631/64 . Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

60108

Найдено, %: С 64,45;Н 8,84; О 26,61.

Антибиотик обладает антикокцидоз- ным и антибактериальнымдействием, а также повышает скоростьроста,эффективность усвоения кормакрупного рогатого скота.

Формула изобретения

1.Способ получения 19-эпидианемицина , заключающийся в том, что штамм Streptomyces hygroscopicus АТСС 39205 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли,

в аэробных условиях и выделяют целевой продукт путем экстракции ферментационного бульона метилизобутилке- тоном.

2.Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и и с я тем, что в качестве источника углерода используют церилозу, а в качестве источника азота - соевую муку.

3.Штамм Streptomyces hygroscopicus АТСС 39205 (American Type Culture Collection), используемый для получения 19-эпидианемицина.

Реферат

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотика. Цель изобретения - создание способа получения нового антибиотика 19-эпидианемицина и штамма, продуцирующего данный антибиотик . Штамм Streptomyces hygrosco- picus эыделен из образца почвы. Депонирован в American Туре Culture Collect ., номер АТСС 39205. Штамм культивируют в жидкой питательной среде, содержащей церилозу в качестве источника углерода, соевую муку в качестве источника азота и минеральные соли. Выделяют целевой продукт путем экстракции ферментационного бульона ме- тилизобутилкетоном. 2 с.п. ф-лы, 1 3 . п. ф-1щ. СО с ьо со Oi О4