Способ получения антибиотика - SU1134120A3
Код документа: SU1134120A3
Описание
Изобретение относится к микробио логической промышленности и касаетс получения нового антибиотика. Аналогов в патентной и научнотехнической литературе не обнаружен Целью изобретения является получение нового антибиотика. :Эта цель достигается тем, что пр способе получения антибиотика общей формулы CHjCHj где Q - (-СНО), его ацильного эфирного производного сложного эфира и/или производного, где Q - (-CHjOH). штамм Streptomyce fradiae NiREL 12171 культивируют в п тательной среде, содержащей источни ки углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим вьщелением целевого продукта в виде основания и при необходимости переводом его в соль и/или ацильное эфирное производное, и/или сложный эфир, и/или производное , где Q - (CHjOH). Для осуществления способа исполь зуют штамм Streptomyces fradiae NRRL 12171, который хранится в каплекции штаммов Северного региональн го исследовательского центра отдела сельскохозяйственных исследований под номером NRRL 12171 и характеризуется -следуюпрми признаками. , Культурально-морфологические признаки. На агаре Чапека спороносцы имеют изгибы, петли и неправильные короткие спирали небольшого диаметра. Поверхность спор гладкая, сферической формы диаметром 0,61-0,71 мкм. Воздушный мицелий слабо развит, с окраской от белого до серого, чащ отсутствует. Обратная сторона колоний имеет окраску от светло-желтого до умеренно желтого. Меланоидного пигмента не образует. Бульон с триптон-дрожжевым экстрактом (ISP-2). Рост средний, обрат ная сторона колоний желтого цвета, воздушный мицелий и растворимый пиг мент отсутствуют. Среда ISP-4. Рост хороший. Обратная сторона колонии желтая, воздушный мицелий хороший, белого цвета, Рас воримый пигмент отсутствует. Среда ISP-5. Рост хороший. Обратная сторона колонии желтого цвета, воздушный мицелий - следы, серый, растворимый пигмент отсутствует. Среда ISP-7. Рост хороший. Обратная сторона колоний желтая, воздушный мицелий хороший, серый. Растворимый пигмент светло-коричневый. Са-малат. Рост плохой. Обратная сторона колонии белая. Воздушный мицелий- и растворимьй пигмент отсутствуют . Среда Чапека. Рост хороший. Обратная сторона колонии желтого цвета, воздушный мицелий хороший, белый. Растворимый пигмент отсутствует. Томатная паста - овсяная мука. Рост хороший. Обратная сторона колоний желтая. Воздушный мицелий и раствор (1мый пигмент отсутствуют. Физиолого-биохимические свойства. Диапазон рН для роста 6,1-7,8, температура 10-37 С. Устойчив к хлориду натрия в концентрахщи 4%. Усваивает глюкозу, D-фруктозу, D-галактозу, изоинозиг, сахарозу, D-ксилозу; не усваиваетot-арабинозу, D-маннит, раффинозу, салицин, D-рамнозу . Желатину не разжижает, молоко не сбраживает, крахмал гидролизует, нитраты в нитриды восстанавливает. Каталаза положительная, .фосфатаза положительная, уреаза отрицательная. Проявляет антагонистическую активность в отношении ряда грамм-положительных патогенных бактерий и вида Mycoplasma. Пример 1. Лиофилизированную культуру Str. fradiae NRKL 12171 диспергируют в 1-2 кп стерильной воды. Часть этого раствора (0,5 мп) используют для инокуляции 150 МП посевной среды следующегососта- ва, %: Зерновая настойка1,0 Экстракт дрожжей0,5 Мука грубого помола соевых бобов0,5 Карбонат кальция0,3 Соевое масло (неочищенное )0,45 Обессоленная вода97,25 3 Другой вариант приготовления посевного материала заключается в сл ду кнцем. Культуру, сохраняемую в количес ве 1 мл в жидком азоте, быстро отт вают и инкубируют в посевную среду Среду вьвдерживают в 500 миллилитро вых колбах Эрленмейера при 29 С в течение 48 ч в закрытой трясучке п 300 об/мип. Вьщержанную посевную среду (0,5 инокулируют 7 мл ферментационной среды следующего состава, %: Свекольная патока2,0 Зерновая мука1,5 Рыбная мука0,9 Пшеничная клейковина0,9 натрия0,1 ( Ш4)2НР040,04 Карбонат кальция0,2 Соевое масло (неочищенное )3,0 Обессоленная вода 91,36 Инокулированную ферментационную среду инкубируют в 50-мш1лш1итровы бутьтках при 29 С в течение 6 дн н закрытой трясучке при 300 об/мин. Пример 2. Для получения большого объема инокумента берут 60 МП вьдержанной посевной среды, инокулируют ее в 38 МП среды, соде жащей, %: Зерновая настойка 1,0 Солевая масляная мука0,5 Дрожжевой экстракто 5 Карбонат кальция0,3 Соевое масдо (неочищенное )0,5 Лецитин (неочищенный)0,01 Вода 97,18 рН среды доводят до 8,5 добавле ем 50%-ного раствора NaOH. Эту среду инкубируют в. 68-литро вом ферментере в течение 47 ч при 4 л подготовленного таким образ посевного материала используют для инокуляции 40 л.стерильной фермент ционной среды следукидего состава, Рыбная мука0,9188 Зерновая мука1,575 Зерновая клейковина0,9188 Карбонат кальция0,210 Хлорид натрияО,105 (NH)2HPQ40,042 Свекольная патока2,10 Соевое масло (сырое)3,15 0 0,0945 Лецитин Вода90,88ЬУ рН регулируют до 7,2 добавлением 50%-ного piacTBopa NaOH. Ферментацию ведут в 68-литро 3ом ферментере в течение 5 дн при 2В С при аэрации стерильным воздухом, при этом концентрация растворенного кислорода поддерживается в пре- Делах 30-50%, перемешивание осуществляют со скоростью мешалки 300 об/мин. Пример -3. Полученную культуральную жидкость с рН 7,2 фильтруют через фильтровальный мелкозернистый порошок. К 1450 мл фильтрата добавляют 400 мл этилацетата, рН раствора устанавливают 9,1 с помощью NaOH. Смесь перемешивают 10 мин и отделяют этилацетат. Фильтрат повторно экстрагируют 200 мл этилацетата. К объединенным этилацетатным экстрактам добавляют 200 мл воды и устанавливают рН 4,1 фосфорной кислотой. Водную фазу отделяют, а органическую фазу отбрасывают, рН водной фазы доводят до 9,1 NaOH и концентрируют до 100 мл в вакууме. Получают аморфньй осадок, выдерживают его в течение 8 ч и отделяют фильтрованием. Осадок растворяют в ацетоне (20 мл) и добавляют 75 мл воды. Раствор концентрируют в вакууме, образ ующийся осадок отфильтровывают и промывают водой. Получают 50 мг 23-де(мицинозилокси )тилозина (ДМОТ). Аналогичным способом из фильтрата получают дополнительно 260 мг ДМОТ. ДМОТ представляет собой белое аморфное вещество, размягчается при 158°С, плавится при 1б5-167С. Элементный анализ,%: углерод 62, водород 8, азот 2, кислород 27. Эмпирическая формула: C.gH,, N0. Молекулярный вес 726 (725 по данным масс-спектрометрии). ИК-спектр поглощения в хлороформе (max поглощения), 3653 (маленькая ), 3588 (с уступом), 3470 (широкая), 3026 (с уступом), 2998 (с уступом), 2969. (интенсивная), 2932 (интенсивная), 2873 (с уступом), 1709 (интенсивная), 1669 (средняя), 1616 (очень маленькая), 1583 (интенсивная ), 1447 (средняя), 1400 (средняя ) ,1365(средняя),1309 (средняя), 1278 (маленькая),1175 (средняя),1151 / (средняя) , 1106 (маленькая) , 1066 (с уступом ), 1036 (интенсивная),1001 (средS няя),982 (средняя),972 (с уступом), 946 (маленькая) ,913 (очень маленькая) 891 (очень маленькая), 853 (очень маленькая), 826 (маленькая). УФ-спектр поглощения в нейтральн этаноле имеет максимум поглощения п 283 нмо( 21500). Удельное вращение/а / 62,75 . Электрометрическое титрование в 66%-иом водном диметилформамиде ука зьгоает на наличие титруемых групп с рКд величиной примерно 7,3. Умеренно раствЬримо в воде, раст римо в ацетоне, метаноле, диметилфо амиде, хлороформе,диметилсульфоксиде и других Полярных органических растворителях. Лучшей растворимость в воде обладают соли,кислот. Антимикробная активность, мкг/мп Streptococcus pyogeneg С 2030,25 Streptococcus pneumoniae pi0,13 Streptococcus (группа D) 2826,5 Staphylococcus aureus 30551,0 Pasteurella multocida 6,25 Pasteurella hemolytica 25,00 Mycoplasma gallisepticum0 ,097 Mycoplasma hyopheumoniae 0,39 Mycoplasma hyorhinis 0,79 Пример 4. 11 г ДМОТ раство ряют в разбавленной соляной кислоте ( рН 1,8). Полученный раствор выдер.живают при комнатной температуре в течение 24 ч и затем рН доводят до 9,0 с помощью NaOH. Щелочной раство экстрагируют хлороформом. Полученны экстракт сушат в вакууме и получают 9,65 г 23-деокси-5-0-мицаминозилтиналида (ДОМТ), имеющего структурную формулу О он М «з Пример 5. 50мг ДМОТ раств ряют в водном растворе изопропилово 206 го спирта (40%, 25 мл). В 30%-ном водном растворе изопропилового спирта (10 мл) растворяют 20 мл борогидрида натрия. 1 мл борогидрида натрия добавЛяют к раствору, содержащему ДМОТ. Полученную смесь перемешивают в течение 5 мин. Устанавливают Рн 7,5 с помощью фосфорной кислоты и концентрируют в вакууме. Добавляют 50 мл хлороформа. рН регулируют до 7,5. После экстракции отделяют хлороформ и выпаривают досуха. Получают 20-дигидро-23-де(мицинозилокси)тилозин (дигидро-ДМОТ). Дигидро-ДМОТ можно перевести в дигидро-ДОМТ, используя метод, описанный в примере 4. Пример 6. Полз чение 2-0-ацетил-ДМОТ . 5,0 г (6,9 моль) ДМОТ растворяют в 150 мл и обрабатывают 0,84 мл (8,2 ммоль) уксусного ангидрида, добавляемого по каплям при перемешивании и при комнатной температуре. После перемешивания в течение 17ч растворитель выпаривают при пониженном давлении.Остаток растворяют в малом объеме этилацетата и хроматографируют на силикагеле. Элюируют 4 л этилацетата. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и вьшаривают досуха при пон ксенном давлении . Получают 4,2 г (80%) 2-0-4-ацетил-ДМОТ . Пример 7. Получение 2-0-ацетил-4-финилацетил-ДМОТ . 2,7 г (3,5 ммоль) 2-0-ацетил-ДМОТ растворяют в 70 мл хлористого метилена и 0,8 мл пиридина и обрабатьшают раствором 0,56 мл (3,5 ммоль) фенилацетилхлорида в 30 мл хлористого метилена при перемешивании и при комнатной температуре. Через 6 ч растворитель выпаривают, остаток растворяют в хлористом метилене и экстрагируют насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают. Остаток растворяют в этилацетате и хроматографируют на силикагеле (Вотерс Преп 500). Колонку элкируют 4л этилацетата. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и выпаривают досуха. Получают 1,2 г (3%) .2-0-ацетил-4-0-фенилацетш1-ДМОТ. Пример 8. Получение 2-0-аце- . тил-4-О-изовалерил-ДМОТ. 7 1,2 г (1.6 ммоль) 2-0-ацетил-ПМОТ в 29 МП пиридина обрабатывают 0,7 м ( 3,9 ммоль) изовалерилхлорида при перемешиваний при . После обрабо ки сухой продукт растворяют в толуоле и хроматографируют на силикагел . Колонку элюируют смесью толуола и этилацетата (9:1 до 1;2), Получают 0,12 г продукта. Затем элюируют колонку хлористым метиленом и получают 0,84 г (55%) 2-0-ацетил-4 -0-фенилацетил-ДМОТ. Пример 9. 4-0-Изовалерил-дмот . „ 0,4 г 2-0-ацетш1-4-0-изовалерил-даОТ растворяют в 30 мл 80%-ного водного метанола и кипятят в течение 4,5 ч. Раствор охлаждают .до комнатной температуры и выпаривают досуха при пониженном давлении. Полу чают 0,13 г (34%) целевого продукта 10. 4-0-Фенилацетил Пример -ДМОТ, г 2-0-ацетш1-4-0-фенилацетил -ДМОТ растворяют в 18 мл 80%-ного водного метанола и кипятят в течени 5 ч. Раствор охлаждают до комнатной температуры и выпаривают досуха при пониженном давлении. Получают 0,16 (86%) 4 -0- енилацетил-ДМОТ. 8 0 11. Получение 2-0Пример -ацетил-4-пропионил-ДМОТ. В 30 мл пиридина растворяют 1 г 2-0-ацетип-ДМОТ и обрабатывают раствор 0,6 мл пропионового ангидрида , добавляемого по каплям при перемешивании при комнатной температуре. Через 20 ч добавляют еще 3,0 мп пропионового ангидрида и реакционную массу перемешивают в течение 26 ч при комнатной температуре. Смесь разбавляют 30 мп толуола и при пониженном давлении выпаривают растворителем . Остаточное масло растворяют в 50 мл дихлорметана и экстрагируют насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают . Остаток загружают в колонку с силикагелем и элюируют при линейном градиенте толуола (4 л) и этилацетата (4 л). Элюируют 305 мг 2-0-ацетил3 ,4-ди-0-прош10нил-ДМОТ, а затем 286 мг 2-0-ацетил-4-0-щ)опионил-ДМОТ. Каждое соединение кипятят с обратным холодильником в 80%-ном водном метаноле и получают два производных ДМОТ. Использование изобретения позволяет расоирить ассортимент антибактериальных средств.
Реферат
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА общей.формулы СН СНгС ОН оЧ)-оя где Q - (-СНО), его . ацильного эфирного производного , сложного эфира и/или производного , где Q - (-CHjOH), заключающийся i в том, что штамм Streptomyces f radiae NRRL 12171 культивируют в питатель (Л ной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим выделением целевого продукта в виде основания и при необходимости переводом его в соль и/или ацильное эфирное производное, и/или сложный эфир, и/или производное, где Q - (CHjOH).° 00 4
