Код документа: RU2120444C1
Изобретение относится к технологии производства известного аминогликозидного антибиотика, в частности к новому способу получения изепамицина.
Известен способ получения изепамицина (=1-N-(S)-3-амино-2-оксипропионил] -гентамицин B), который заключается в том, что гентамицин B в виде комплекса с двухвалентной солью подвергают взаимодействию с N-бензилоксикарбонилоксифталимидом и получаемое при этом соединение подвергают ацилированию N-(S-3-бензилоксикарбониламино-2-оксипропионилокси)сукцинимидом с последующим снятием защитных бензилоксикарбонильных групп путем каталитического гидрирования на палладии на угле и выделением целевого продукта (см. патент США N 4 230847, МКИ C 07 H 15/22, 1980, примеры 11 и 24).
Недостатком известного способа является то, что выход изепамицина не превышает 60%.
Задачей изобретения является повышение выхода изепамицина.
Поставленная задача решается в предлагаемом способе получения изепамицина путем взаимодействия гентамицина B в виде комплекса с двухвалентной солью с гетероциклическим соединением, ацилирования получаемого при этом соединения и последующего снятия защитных групп и выделения целевого продукта за счет того, что в качестве гетероциклического соединения используют 2-формилмеркаптобензотиазол, ацилирование осуществляют соединением N-защищенного (S)-изосерина, а снятие защитных групп осуществляют основным гидролизом.
Изепамицин имеет следующую формулу
Способ его получения описывается в нижеследующем примере 1.
Пригодными в качестве комплексообразователя двухвалентными солями являются соли на основе таких металлов, как, например, медь (II), никель (II), кобальт (II), кадмий (II), цинк (II), а также их смеси. Двухвалентные соли этих металлов представляют собой соли неорганических и органических кислот, предпочтительно органических кислот, таких как, например, муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, триметилуксусная кислота и бензойная кислота. Предпочтительными солями двухвалентных металлов являются триметилуксуснокислые соли цинка (II). В частности, используют триметилуксуснокислую соль цинка (II).
Образование комплекса гентамицина B и двухвалентной соли осуществляют в среде инертного органического растворителя. Предпочтительными органическими растворителями являются, например, диметилсульфоксид, диметилформамид, диметиацетамид, метиленхлорид, толуол, этилацетат и их смеси.
При образовании гентамицина B в виде комплекса с двухвалентной солью целесообразно применять примерно 1,5 - 4,5 моль двухвалентной соли, например, цинка (II) на моль гентамицина B. Предпочтительно применяют примерно 2,7-3,5 моль двухвалентной соли на моль гентамицина B.
Гентамицин B в виде комплекса с двухвалентной солью подвергают взаимодействию с 2-формилмеркаптобензотиазолом, в результате чего защитной формильной группой снабжаются аминогруппы в положениях 3 и 6'. 2-Формилмеркаптобензотиазол и комплекс гентамицина B и двухвалентной соли обычно применяют в мольном соотношении 2-3:1, предпочтительно 2,5:1.
Реакцию формилирования гентамицина B в виде комплекса с двухвалентной солью осуществляют при температурах 0 - 40oC, предпочтительно 20-30oC. Реакцию обычно проводят в среде органического растворителя или смеси органических растворителей. Пригодным органическими растворителями являются, например, диполярные апротонные органические растворители, такие как диметилсульфоксид, диметилформамид, диметилацетамид и т.п. Возможно также применять смеси диполярных апротонных органических растворителей с инертными органическими растворителями, такими, как, например, толуол, этилацетат, 1, 2-диметоксиэтан, тетрагидрофуран, ацетонитрил, метиленхлорид и т.п. Предпочтительной смесью растворителей является смесь диметилсульфоксида с метиленхлоридом или этилацетатом.
Ацилирование проводят путем введения боковой цепи (S)-изосерина у 1-аминогруппы 3,6'-ди-N-формилгентамицина B, что можно осуществлять путем образования на месте активного сложного эфира N-защищенного
(S)-изосерина в результате взаимодействия (S)-изосерина с активирующим реагентом в присутствии дициклогексилкарбодиимида согласно следующей реакционной схеме
Пригодными соединениями N-защищенного изосерина являются, например, N-формил-(S)-изосерин, N-фталоил-(S)-изосерин, N-трифторацетил-(S)-изосерин, N-трифторацетил-(S)-изосерин, N-трихлорацетил-(S)-изосерин. Предпочтительным соединением N-защищенного изосерина является N-формил-(S)-изосерин.
Активные сложные группы N-защищенного (S)-изосерина получают взаимодействием изосерина с таким соединением, как, например, N-оксибензотриазол, N-оксисукцинимид, имидазол, N-оксифталимид, N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимид и т. п., в присутствии связующего вещества, такого как, например, дициклогексилкарбодиимид.
Реакцию N-защищенного (S)-изосерина с 3,6'-ди-N-формилгентамицином B осуществляют при температуре 0-40oC, предпочтительно при комнатной температуре, в среде растворителя. Примерами пригодных растворителей являются протонные органические растворители, как, например, спирты, такие как метанол, этанол, пропанол и т.п., смеси воды со спиртом, такие как водный метанол, водный этанол и т.п., апротонные растворители, такие как диметилформамид, диоксан, метиленхлорид. Предпочтительным растворителем является водный метанол.
В результате взаимодействия N-формилизосерина с 3,
6'-ди-N-формилгентамицином B получается соединение формулы IV, т.е. триформилизепамицин. Защитные группы снимаются с соединения формулы IV путем гидролиза согласно следующей схеме
Пример 1. Получение 2-формилмеркаптобензотиазола
В трехгорлую круглодонную колбу
емкостью 500 мл подают 80 мл ацетонитрила, 5 мл (0,133 моль) муравьиной кислоты и 18,1 г (0,266 моль) формиата натрия. Получаемую суспензию охлаждают до 0-5oC, после чего медленно добавляют
14,6 мл (0,2 моль) ацетилхлорида, поддерживая температуру реакционной смеси ниже 8oC. После завершения добавления ацетилхлорида реакционную смесь нагревают до 18-20oC. Завершение
реакции определяют путем анализа с помощью1H-ЯМР. К гетерогенной смеси, содержащей ацетомуравьиный ангидрид, последовательно добавляют 60 мл ацетонитрила и 20 г (0,103 моль)
2-меркаптобензотиазола. Реакционной смеси дают нагреваться до 32oC и ее поддерживают на этой температуре. За ходом реакции следят при помощи жидкостной хроматографии, осуществляемой каждые
10 минут. Реакцию считают законченной, когда примерно 4% 2-меркаптобензотиазола остаются непрореагировавшимися или же когда указанный процент начинает увеличиваться в результате разложения
продукта.
Затем к реакционной смеси добавляют 200 мл ледяной воды и перемешивают в течение 2 минут. Осадившийся продукт фильтруют, тщательно промывают водой (4 раза по 150 мл) и сушат в вакууме до водосодержания твердого вещества, равного < 0,08%. Получают 21,4 г (89%) 2-формилмеркаптобензотиазола с чистотой 98% (определенной жидкостной хроматографией). Т. пл. 125-130oC (разл.).
1H-ЯМР (CDCl3)w 7,36-7,44 (м, 3H), 8,45-8,52 (м, 1H), 9,92 (с, 1H).
Пример 2. Получение цинковой соли триметилуксусной кислоты.
К 250 мл воды с температурой 60-70oC добавляют 56,1 г (0,55 моль) триметилуксусной кислоты, после чего порциями добавляют 31,25 г (0,25 моль) карбоната цинка в течение 10-15 минут и температуру повышают до 96-98oC. После перемешивания реакционной смеси в течение часа охлаждают до 4oC в течение 30 минут при помощи ледяной бани и суспензию фильтруют. Фильтровальный осадок последовательно промывают 75 мл холодной воды и три раза холодным ацетоном, взятым в количествах по 50 мл. Получаемый продукт сушат при 60oC в течение 16 часов в печи, получают 58 г (87%) цинковой соли триметилуксусной кислоты.
Пример 3. Получение 3,6'-ди-N-формилгентамицина B
Вариант A
К 285 мл
диметилсульфоксида и 285 мл метиленхлорида добавляют 34 г (127 моль) цинковой соли триметилуксусной кислоты и 19 г (36,7 ммоль) гентамицина B с чистотой 93,1%. Получаемую суспензию перемешивают при
комнатной температуре в течение 10-15 минут и к получаемому при этом раствору добавляют 16 г (81,9 ммоль) 2-формилмеркаптобензотиазола. Через 5 минут берут аликвот, который подвергают жидкостной
хроматографии для определения соотношения пиков моноформила и диформила. 2-Формилмеркаптобензотиазол добавляют еще два раза в малом количестве, так что общее количество составляет 16,95 г (86,8
ммоль). При этом конечное соотношение пиков составляет 0,02, что рассматривается как желаемый результат реакции. Реакционную смесь подают в разделительную воронку емкостью 2 л, куда добавляют 800 мл
воды. Фазы разделяют и водный слой экстрагируют 30 мл метиленхлорида. Затем водный слой фильтруют на целите. Фильтрат разбавляют водой до объема 2 л. Получаемый водный раствор с pH примерно 6 подают в
колонку, содержащую 800 мл Амберлите IRC-50. Продукт элюируют 0,75 N гидроокисью аммония. Фракции, содержащие продукт, собирают и концентрируют с получением раствора, который согласно данным
жидкостной хроматографии содержит 17,5 г (90,5%) 3,6'-ди-N-формилгентамицина B.
Масс-спектр (m/e)% (FAB/GLY-THIO) 539 (100, M+ + 1), 511(9), 380 (9), 350 (4), 191 (10), 190 (5), 160 (28).
1H-ЯМР (400 МГц, D2O; pH 9) w 1,25 (с, 3H, C-4''-CH3), 2,57 (с, 3H, N-CH3), 5,11 (д, J = 4,02 Гц, 1H, аномерно), 5,38 (д, J = 4,02 Гц, 1 H, аномерно), 8,15 (с, 1H, N-CHO), 8,16 (с, 1H, N-CHO).
13C-ЯМР (100 МГц, D2O; pH 9) w 51,36 (C-1), 47,8 (C-3), 38,96 (C-6'), 64,5 (C-3''), 37,01 (N-CH3), 22,22 (C-4''-CH3), 165,47 (N-CHO), 164,76 (N-CHO).
Вариант Б
Повторяют вариант А с той разницей, что к 75 мл диметилсульфоксида и 75 мл
этилацетата добавляют 7,76 г (31,5 ммоль) ацетата кобальта в виде тетрагидрата и 5 г (9,16 ммоль) гентамицина В с чистотой 88,4%. Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение
15 минут с получением раствора, к которому добавляют 4,5 г (22,12 ммоль) 2-формилмеркаптобензотиазола, после чего продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение 30 минут.
Реакционную смесь подают в разделительную воронку емкостью 500 мл, куда добавляют 300 мл воды. Продукт, содержащий водный слой, фильтруют на целите и фильтрат подвергают жидкостной хроматографии. Получают 4,19 г (84,9%) 3,6'-ди-N-формилгентамицина В, имеющего вышеуказанную характеристику.
Пример 4. Получение N,O-диформил-(S)-изосерина
В круглодонную колбу емкостью 1 л
подают 50 г (0,476 ммоль) (S)-изосерина и 62,5 мл муравьиной кислоты, после чего добавляют 5 эквивалентов свежеприготовленного раствора ацето-муравьиного ангидрида при 0-5oC в течение 30
минут (этот раствор получают путем добавления ацетилхлорида к 1,2 эквивалентам порошкового безводного формиата натрия в среде безводного ацетонитрила (концентрация формиата натрия в ацетонитриле может
составлять до 50%) при температуре 0-5oC. Реакция завершена через 2 часа, после чего осадок фильтруют. В зависимости от температуры из реакционной смеси может выделяться небольшое
количество окиси углерода. Продукт реакции является стабильным при 0oC в течение месяца). После завершения реакции примерно через два часа, что подтверждается данными1H-ЯМР,
смесь концентрируют в вакууме примерно до половины первоначального объема при 40oC. Медленно добавляют 250 мл изопропанола при одновременном охлаждении для достижения кристаллизации.
Суспензию перемешивают при 0oC в течение одного часа. Получаемый N,O-диформил-(S)-изосерин фильтруют и промывают изопропанолом. Выход: 64 г (84%). Т. пл. 139,5-141,5oC; [α
] ; -38o (с = 1%; метанол).
1H-ЯМР (D2O): w 3,8 (дд, 1H, J = 14,6, 4,4 Гц), 3,91 (дд, 1H, J = 14,6, 5,5 Гц), 5,38 (дд, 1H, J = 5,5, 4,4 Гц) 8,15 (с, 1H), 8,27 (с, 1H).
Пример 5. Получение N-фталоил-(S)-изосерина
К
перемешиваемой суспензии 15,75 г (150 ммоль) (S)-изосерина и 22,2 г (150 ммоль) фталевого ангидрида в 600 мл смеси толуола и диметилформамида ( 3 : 1) добавляют 2,1 мл (15 ммоль) триэтиламина.
Суспензию нагревают с обратным холодильником и выделяющуюся воду удаляют при помощи конденсатора типа Дин-Строка. Через два часа при температуре кипения вода больше не выделяется. Растворитель
упаривают до конечного объема примерно 100 мл. Реакционную смесь охлаждают, разбавляют ледяной водой и подкисляют 2 N хлористоводородной кислотой. Получаемый продукт фильтруют, промывают ледяной водой
и сушат в вакууме.
Получают 30,4 г (86%) N-фталоил-(S)-изосерина с т. пл. 227-228oC.
[α]
1H-ЯМР (DMCO-d6) w 3,76 (дд, 1H, J = 13,46, 7,69 Гц), 3,84 (дд, 1H, J = 13, 46, 5,77 Гц), 4,3 (дд, 1H, J = 7,69, 5,77 Гц), 7,77-7,89 (м, 4H).
Пример 6. Получение N-трифторацетил-S-изомерина
К 11 мл (1 экв.) перемешиваемого 24,8%-ного по весу раствора
метилата натрия в метаноле добавляют 5 г (S)-изосерина. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 минут. К получаемому гомогенному раствору добавляют 7 мл (1,25 экв.)
этилтрифторацетата, после чего смесь перемешивают в течение 30 минут. Завершение реакции определяют при помощи спектра1H-ЯМР. Смесь концентрируют при пониженном давлении до максимально
возможного объема. К остатку добавляют 50 мл этилацетата. Смесь охлаждают до 0-5oC, добавляют сначала 25 мл (1 экв.) 2 N хлористоводородной кислоты и затем 5 г твердого хлористого натрия.
Органический слой отделяют. Водный слой повторно экстрагируют 50 мл этилацетата. Объединенные органические экстракты сушат над 5 г безводного сульфата магния, фильтруют и концентрируют до 20 мл при
пониженном давлении. Остаток подают в ледяную ванну, к которой добавляют 50 мл гептана при перемешивании в течение 30 минут. Продукт фильтруют и сушат. Получают 8,86 г (93%)
N-трифторацетил-(S)-изосерина с т. пл. 142-143oC.
[α]
1H-ЯМР (D2O); w 3,78 (д, 2H, J = 5,48 Гц), 4,53 (т, 1H, J = 5,48 Гц),
Пример 7. Получение изепамицина
Вариант А
Сначала приготовляют раствор N-формил-(S)-изосерина путем перемешивания 20 г (124,2 моль) N,O-диформил-(S)-изосерина в смеси 85 мл метанола и 15 мл пиридина при комнатной температуре в течение
14-16 часов. Завершение реакции определяют при помощи спектра1H-ЯМР.
N-формил-(S)-изосерин имеет следующую характеристику:
1H-ЯМР (D2O; 250
МГц):
δ 3,35 (дд, J = 13,88, 6,21 H2, 1H), 3,45 (дд, J = 13,88, 4,02 H2, 1H), 4,05 (дд, J = 6,21, 4,02 H2, 1H) 7,95 (с, 1H)
В другой колбе 4,
424 г (8,2 ммоль) 3,6'-ди-N-формил-гентамицина B в виде концентрата в 15,576 г воды и 1,26 г (8,26 ммоль) моногидрата 1-N-оксибензотриазола растворяют в 40 мл метанола. К перемешиваемой смеси
одновременно добавляют в течение 40 минут 22,2 мл (24,4 ммоль, 3 экв.) N-формил-(S)-изосерина в виде метанольного раствора и раствор 5 г (24,3 ммоль; 3 экв.) дициклогексилкарбодиимида в 20 мл
метанола. Затем смесь размешивают в течение 15 минут. За ходом реакции следят при помощи жидкостной хроматографии под давлением (возможен и анализ при помощи тонкослойной хроматографии). Растворитель
удаляют под пониженным давлением и получаемый продукт, триформилизепамицин, подвергают гидролизу с помощью 90 мл 2 N гидроокиси натрия при комнатной температуре в течение 16 часов. Во время процесса
гидролиза перемешивают, реакционную смесь нейтрализуют кислотой до pH 6, фильтруют и фильтрат разбавляют до 1000 мл. Анализ полученного раствора посредством стандартной жидкостной хроматографии под
давлением показывает 89%-ный выход изепамицина (4,17 г; 7,3 ммоль).
Вышеупомянутый трифтормилизепамицин имеет следующую характеристику:
13C-ЯМР (D2O), 62,
896 МГц):
δ 23,7; 35,1; 38,7; 40,5; 43,6; 49,1; 51,7; 66,2; 69,9; 70,4; 72,5; 72,9; 73,9; 74,1; 74,9; 77,8; 81,5; 84,6; 101; 102,4; 166,4; 167,1; 176,3.
Вариант Б
1,56 г (2,07 ммоль) 96,6%-ного 3,6'-ди-N-формилгентамицина B, 800 мг (1,7 экв.) N-фталоил-(S)-изосерина и 365 мг (1,26 экв.) моногидрата N-оксибензотриазола растворяют в 40 мл метанола. К
получаемому раствору добавляют 700 мг (1,7 экв.) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре около часа, после чего добавляют 160 мг N-фталоил-(S)-изосерина и
140 мг дициклогексилкарбодиимида и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. За ходом реакции следят при помощи тонкослойной хроматографии.
Растворитель упаривают и остаток поглощают в 50 мл метанола и 5 мл воды. Защитные группы удаляют путем обработки получаемой смеси 85%-ным гидратом гидразина, взятым в количестве 6 мл. Реакционную смесь нагревают при 85-90oC в атмосфере азота в течение 14 часов. Согласно данным жидкостной хроматографии под давлением получают 1,05 г (89%; 1,85 ммоль) изепамицина.
Вариант B
К 8,45 г (15,7 ммоль) 3,6'-ди-N-формилгентамицина B в виде концентрата в 40,45 г воды последовательно добавляют 2,4 г (15,7 ммоль) моногидрата 1-N-окси-бензотриазола и 80 мл
метанола. К перемешиваемой смеси одновременно добавляют 9,5 г (47,3 ммоль; 3 экв.) N-трифторацетил-(S)-изосерина в 40 мл метанола и 9,7 г (47,1 ммоль; 3 экв.) дициклогексилкарбодиимида в течение 40
минут. Затем смесь перемешивают в течение 15 минут. За ходом реакции следят при помощи жидеостной хроматографии под давлением (возможен и анализ при помощи тонкослойной хроматографии). Растворитель
удаляют под пониженным давлением и продукт подвергают гидролизу путем обработки 170 мл 2 N гидроокиси натрия при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь нейтрализуют кислотой до pH
6, фильтруют и фильтрат разбавляют до 1000 мл. Согласно данным жидкостной хроматографии под давлением получают 7,84 (88%; 13,8 ммоль) изепамицина.
Изобретение может быть использовано в медицине и относится к технологии производства известного аминогликозидного антибиотика. Описывается способ получения изепамицина путем
взаимодействия гентамицина В в виде комплекса с двухвалентной солью с 2-формилмеркаптобензотиазолом, ацилирования получаемого при этом соединения соединением N-защищенного (S)-изосерина с последующим
снятием защитных групп путем основного гидролиза и выделением целевого продукта. Описываемый способ позволяет повысить выход целевого продукта на 25 - 30%. Кроме того, описываются еще исходные
соединения, т.е. N, O-диформил-(S)-изосерин, N-формил-(S)-изосерин и 2-формилмеркаптобензотиазол, а также промежуточный триформилизепамицин формулы