Способ получения производных аминогликозидаминоциклитола - SU952109A3
Код документа: SU952109A3
Описание
Изобретение относится к способам получения новых аминогликозидаминоциклитольных производных, обладающих антибиотической активностью.
Цель изобретения - получение новых , полезных соединений, расширяющих арсенал средств воздействия на живой организм.
Поставленная цель достигается путем микробиологического синтеза последних , .основанного на методе биоконверсии , заключающемся в введении соответствующего диаминоциклитола . или псевдосахарида в антибиотик с использованием штамма мутанта 1.
Согласно предлагаемому способу можно получить новые производные аминоциклитола общей формулы
л т
НО
где R и R различны и представляют собой водород или
R выбирают из группы, состоящей
из
° -y-v
Ки л
/гЛ /А ifit
ноУ «TviV Т-К
Ixi., Wx.10
(,А) или СВ) где R - амино или оксигруппа; R4- СН-«Н„ или СН-МНСН,
Я снъ
15 где R - водород или мети.прадикал
или их фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей.
Предлагаемый способ заключается в том, что деоксистрептамин - отри20 цательный мутант микроорганизма Streptomyces культивируют при 28-30.С на питательной среде, содержащей источник углевода, источник ассимилируемого азота и микроэлементов я 39 присутствии соединения общей формулы J или его кислотно-аддитивные соли, - где X и tj - водород, или X означает ОН, означает группу формулы . Л,я Р где R Имеет приведенные значения, причем деоксистрегистамин - отрицательный мутант Streptomyces представляет собой D-Streptomycesfradial АТСС2Й01 или D-Streptomyces rimosus вида paramomycinus АТСС21 84, если питательная среда содержит соединение формулы 11 , в которой X и I имеют оди наковые значения, и D-Streptomyces rimosus вида paramomycinus АТСС21 8 если среда содержит соединение формулы I I , в которой X и У имеют различные значения. Целевой продукт выделяют в виде основания или в виде фармакологически приемлемой соли, Согласно предлагаем&му способу получают антибиотик в форме свободного основания независимо от того, присутствует ли диаминоциклитол формулы 11 в виде свободного основания или в Фор ме соли. Если желательно использовать полученный в результате антибиотик в виде соли, достаточно провести реакцию с подходящей органической или неорганической кислотой, например серной , с получением фармацевтически при менимой соли присоединения кислоты. Соединения формулы 1 могут существовать в форме эпймеров и смеси указанных эпимеров. Соединения изобретения имеют химиче кие структуры, которые подобны структурам неомицина или паромицина. По этой причине соединения формулы 1 будут обозначены далее как производные неомицина или паромомицина следующим образом: 6-деоксинеомицин В, еслиЯ представляет собой водород, RT - , а R- группу Л, в которой Йл представляет собой 6-де оксинеомицин С, если R представляет собой , Ri - водород, а R группу Л, в которой R-i представляет собой WHi;(смесь этих двух эпимеров. полученная по предлагаемому способу, обозначается далее как 6-деоксинеомицин ); 6-деоксипаромомицин 1, если RI представляет собой водород, R,j, CHj ,WH,j,, а R - группу А, в которой R, представляет собьй ОН; 6-деоксипарамомицим 11, если R представляет собой CHjVIH, Rj водород, а R - группу Л, в которой R представляет собой ОН (смесь этих двух эпимеров, полученная по предлагаемому способу далее называется 6-дезоксипаромомиЦин ). Смесь 3 , -дидеоксинеомицина и его производных обозначает неразделенную комбинацию соединений, в которой RX, и R являющиеся различными, представляют собой водород или СН NH., ad- группу В. Термин неомицин используется для обозначения смеси неомицина В и неомицина С, которая получается при культивировании Streptomyces fradiali Аналогичным образом название паромомицин используется для обозначения смеси паромомицина 1 и паромомицина 11, которую получают при культивации St reptonyces rimosus формы paramomycinus. Производные аминогликозидаминоциклитола обладают значительной антибиотической активностью, которая делает их полезными для лечения болезней , вызываемых ростом патогенных бактерий, таких как Eschlricfiia coll, Proteus mirabils, Staphylococcus aureus Sarcina lulea, Klebsialla edwarolsii , Shi gel la sonnei. Salmonella kyphimurium. В ходе исследований, проводимых с соединениями было обнаружено, что смесь 3-1 Дидеоксинеомицина и его производных обладает отчетливой антибиотической активностью против организмов , которые являются устойчивыми к действию других аминоглинозид-аминоциклитольных антибиотиков, в особенности к действию неомицина и гентамицина . Так, смесь 3,+ -дидеоксинеомицина и его производных активна против штаммов Escherichia coll, которые устойчивы к действию гентамицина и неомицина посредством 2-аденилирующего энзима и 3-фосфорилирующего энзима соответственно. Микроорганизмы, используемые согласно предлагаемому способу, представляют собой D-Streptomyces fradial 595 ATCCZI OI и D-S t reptomyces rlrnosus форму pararnomyci nus ATCC21484 l. D-Str-eptomyces fradial ATCC используется для получения 6-деоксинеомицина , а D-Streptomyces rinosus форма paramomycinus АТСС21 84 - для получения 6-деоксипаромомицина и смеси 3 ,k -дидеоксинеомицина и его производных . Таким образом, если питательная среда содержит соединение формулы 11, в которой X и У имеют одинаковые значения , то деоксистрептамин - отрицательный мутант Streptomyces представляет собой D-Streptomyces fradial АТСС21401 или D-Streptomyces rimosus вида paramomycinus АТСС2ИВ, а если среда содержит соединение формулы 11, в которой X и У имеют различные значения , то микроорганизмом является D-Streptomyces rimosus вида paramomyci nus. Процесс обычно осуществляют следующим образом. Микроорганизм выращивают при 28ЗО С в питательной среде, имеющей значение рН 7,2-7,5 и содержащей питательные элементы, выбранные из глюкозы , гидролизага казеина, (NhU)RPO, Мд50ц7Н20, , CuS04-5H,, СаСО. Затем добавляют в другую питательную среду для роста, содержащую диаминоциклитол формулы 11 в виде свободного основания или соли присоединения кислоты и питательные вещест ва, выбранные из группы, содержащей соевую муку, дрожжевой экстракт, NaCI СаСОз и глюкозу, при значении рН 7,27 ,3. Культурную среду инкубируют при 28-30 С при встряхивании и хорошей аярации в течение по крайней мере, 5 дней до достижения опт-имального по (Лучения требуемого 6-деоксинеомицина, 6-Деоксипаромомицина или смеси 3, дидеоксинеомицина и его производных, 6-Деоксинеомицин В, 6-деоксинеомицин С, 6-деоксипаромомицин 1.и 6-деоксипаромомицин 11 могут быть получены из 6-деоксинеомицина и 6-деоксипаромомицина соответственно, например, путем их выделения с помощью бумажной хроматограЛии. Изомеры, составляющие смесь 3 , -дидеоксимеомицииа и его производных также могут быть разделены традиционными способами. Соединение формулы 11, в которой X и У означают водород, называемое далее 2 ,4-дидеоксистрептомин представляет собой известное соединение. Оно 96 может быть получено гидрированием в присутствии катализатора, например никеля Рэнея, ( 1 ,3,5/2) 1 ,5-Диaзидo-2 ,3Циклoгeкcaн-диoлa, полученного из 1Ь 1 ,5-ди-О-тозия-1 ,2,5/3 циклогексантетрола и азида натрия. Соединение формулы 11, где X означает ОН, а У является радикалом формулы п пч называемое далее смесью гептаминов, может быть получено из промышленного гентамицинсульфата. Аминогликозид - аминоциклитольные производные демонстрируют значительную антибиотическую активность. Такая антибактериальная активность против различных испытуемых организмов иллюстрируется следующими данными . Антибактериальная активность 6-деоксинеомицина и 6-деоксипаромомицина. Аминогликозид - аминоциклитольные производные испытывают.на антибиотическую активность путем добавления измеренных количеств изучаемого соединения в стерильной воде к питательному агару. Затем агар,содержащий увеличивающиеся концентрации испытуемого соединения, переливают в чаши Петри, в каждую из которых механически с помощью мультиинокулятора добавляют несколько различных организмов, которые предварительно выращивают в соответствующей среде и хранят при -2оС в смеси питательная среда/глицерин в соотношении 1:1. Чаши инкубируют при 37°С в течение 1 ч и затем изучают рост. Концентрацию антибиотика, которая ингибирует рост бактерий, обозначают как минимальная ингибирующая концентрация или М.I.e. Полученные результаты приведены в табл. 1 в сравнении с яействием неомицина и паромомицина в сульфатной форме. Значения, приведенные в табл. 1 и 2, соответствуют количеству свободт ного основания. Эти результаты показывают,---что удаление гидроксильной группы из шестого положения аминоциклитольного фрагмента неомицина, что соответствует 6-деоксинеомицину, незначительно изменяет общую антибактериальную активность неомицина. Антибактериальная активность 6-де оксинеомицина против Escherichia col W3110 имеет более высокое значение, чем для неомицина. Активность 6-деоксинеомицина В и 6-деоксинеомицина С, Антибактериальную активность 6-де оксинеомицина В и 6-деоксинеомицина испытывают описанным способом, и с пол ьзуя при этом в качестве питательной среды D.S.T. агар, и М.1.С. отмечают в сравнении со значениями для неомицина и 6-деоксинеомицина. Полученные результаты приведены в табл. 2. Из полученных результатов видно, что 6-деоксинеомицйн В в некоторой степени менее активен, чем неомицин В, но что 6-деоксинеомицин С более активен, чем неомицин С. Активность смеси З, -дидеоксине мицина и его производных. Антибактериальную активность смеси 3 -дидеоксинеомицина и его про изводных определяют в соответствии с описанной методикой. D-Streptomyces rinrasus формы paramomyclnus АТСС ZlA инкубируют при в чашке с питательным агаром, содермащим 5Qj мг/мл смеси гентаминов формулы Ml. Через три дня машу загружают агаром, засеянным испытуемым организмом, и произ водство антибиотика демонстрируют зоной ингибирования вокруг Streptomyces . Такую зону измеряют и сравнивают с зоной контрольного опыта, полученного при использовании одного, питательного агара. Для сравнения аналогичное испытание осуществляют с концентрацией неамина 50 мг/мл в качестве добавки в питательный araj) вместо cMej гентам нов формулы 111 и также при использовании D-Streptomycer riirosus АТСС . Установлено, что полученный антибиотик представляет собой неомицин. Полученные результаты приведены в табл. 3. Приведенные значения показывают, что смесь З,-дидеоксинеомицина и его производных является активной против организмов, устойчивых к действию неомицина. Организм E.Coli РТ также устойчив к действию гентамицин Для терапевтического использовани . соединения согласно предлагаемому способу могут применяться в виде фар мацевтическои или ветеринарной композиции с единичной дозой, соответствующей требуемому виду применения, причём композиция включает в качестве актив Ного инградиента по крайней мере одно соединение согласно изобретению совместно с фармацевтическим носителем или наполнителем. Для орального применения композиция может иметь, например , форлу покрытых или непокрытых таблеток, твердой или мягкой желатиновой капсулы, суспензии или сиропа. Такая композиция может выполняться в виде свечей для ректального или вагинального применения, раствора или суспензии для парентерального применения , крема или мази для н)зружного применения Пример 1. Получение 6-деоксинеомицинового основания и его сульфата. а) 6-Деоксинеомицин в виде свободного основания D-Streptomyces fradial АТСС 21401 выращивают в колбе в течение 48 ч, предварительно установив jsH 7,2-7,3, на следующей среде, г: Глюкоза1 Гидролизат казеина 1 (NH4),HP041 MgS04-7H,00,05 Ре504.7Н.О0,005 Си504-5Нз О0,005 ВодаДо объема 100 мл Такую культуру встряхивают и поддерживают при 28с в течение указаннбго периода времени. 10% прививочного материала этой культуры затем добав )Тяют, предварительно установив рН 7,2-7,3, в следующую питательную ере ДУ, г: Глюкоза1 Соевая мука2,5 Дрожжевой экстракт0,5 NaCT0,5 СаСО,,.0,2 2,4-Дидеоксистрептамин дигидрохлорид0,025 ВодаДо объема 100 мл Культуры инкубируют в Эрленмейеройских колбах при на роторном астряхивателе при хорошей аэрации. Вырабатывание 6-деоксинеомицина начинается через 2 дня и становится оптимальным через 5 дней. 99 Контрольные культуры, содержащие 2 j -дидеоксистрептамин дигидрохлорид не производят 6-деоксинеомицин. Культуральную среду затем центрифугируют и всплывную жидкость перели . вают через колонку, содержащую слабо kиcлoтнyJO карбоксильную (полиметакр ловуп) катионообменную смолу средней пористости (Amberlite IPC-50, Amber lite - торговое наименование) в аммониевой форме. Эту операцию проводят дважды для. экстрагирования 6-деоксинеомицина и непревращенного 2,А-дидеоксистрепт« амин дигидрохлорида. Колонку промывают водой и 6-деоксинеомицин элюируют 2 н. раствором гидроокиси аммония в воде. Элюат концентрируют в вакууме в роторном испарителе и затем пропускают через колонку с Sephadex G-10. Элюирование 0,1 М раство ром гидроокиси аммония дает 6-деокси неомицин в первых фракциях и 2,-дидеоксистрептамйн дигидрохлорида в по следующих фракциях. Согласно этому способу получают 6-деоксинеомицин в виде свободного основания, который имеет активность 83 единицы (1 единица 1 мг/мл неоми . цина). Это соответствует введению в 6-деоксинеомицин, полученный таким образом, приблизительно 22% 2,4-дигл деоксистрептамин дигидрохлорида, который использовали вначале. Это значение представляет максимальную активность, и дальнейшее ин . кубирование не приводит в результате к увеличению количества 6-деоксинеомицина . В качестве альтернативного процесса сырой 6-деоксинеомицин очищают бумажной хроматографией на Ватманско бумаге № ЗИМ, осуществляют проявление раствором метанол/гидроокись аммония в соотношении 4/-1. Положение 6-деоксинеомицина визуально определя ют с использованием 0,25%-ного раствора гипохлорита натрия а воде, затем абсолютного этанола и далее 1%-ным раствором крахмала и 1%-ным растворо иодида калия в воде с сушкой воздухо между применением каждого из .реагентов , Rf 6 деоксинеомицина 0,30. . Rf для неомицина, 2-деоксистрепт амина и 2,-дидеоксистрептамина в то же системе растворителей составляет 910 Неомицин .0,26 2-Деоксистрептамин 0,58 2 ,А-ДидеоксистрептаминО ,б2 б)6-Деоксинеомицин сульфат. 6-Деоксинеомицин, полученный опи санным путем, превращают в .его сульфат по реакции с эквивалентным количестЕзом разбавленной серной кислоты. / D/ 6-деоксинеомицин сульфата +k3°( с 1,0, вода). в)Структура 6-деоксинеомицина. Структуру антибиотического соединения формулы 1 в виде свободного основания определяют сравнением с природным антибиотиком неомицином, который получают при инкубировании 2-деоксистрептамина в соответствующей среде. Сб-Деоксинеомицин далее называют соединением Х. В результате метанолиза неомицина и соединения X с помощью 10%-ного раствора НС1 в метаноле в течение 2 ч в результате кипячения с обратным холодильником получают два основных продукта, один из которых соответствует метилнеобиосаминид и вырабатывав ется обоими веществами. Другой продукт, который далее называют Z, различен для двух антибиотиков , причем соединение 2 из неомицина мигрирует в меньшей степени, чем продукт Z из соединения хроматографическом анализе при использовании в качестве элюента смете мы метанол/раствор гидроокиси аммоний в соотношении 4/1. Подтверждение структуры каждого вещества Z получают масспектрометричес КИМ анализом пергтриметил-силильных производных. Хотя молекулярные ионы получены не были, спектры соединения Z из неомицина и соединения Z из соединения X были очень похожими за исключением i того, что два лика из спектра первого соединения {т/е и ) были сдви нуты на 88 массовых единиц ниже у nof следнего соединения (т/е с 255 и 972). Это соответствует потере OSiCCH.-),. и замещению водородом. Таким образом, структура соединения Z из неомицина соответствует неамину , а структура Z из соединения X - 6-деоксинеамину. Ацетилирование обоих соединений Z в метаноле с последующим кислотный гидролизом 3 н. раствором хлористо11 водородной кислоты при нагревании с обратным хооодильником в течение 10 давало в каждом случае два основных продукта. В результате бумажной хроматографии оказалось, что один из этих продуктов представляет одно и то же вещество в обоих случаях независимо от того,получают ли его из вещества 2 , соответствующего неомицину или из вещества Z , соответствующего соединению X, Это соединение представляет собой 2,6-диамино-2,6-дидеокси-Э-глю козу. Другие два продукта, как было установлен.о хроматографическим анализом , идентичны 2-деоксистрептамину из неамина и 2,А-дидеоксистрептамину из деоксинеамина. Эти результаты приводят к заключе нию, что соединение X соответствует 6-деоксинеомицину. г) Разделение 6-деоксинеомицина на 6-деоксинеомицин В и 6-деоксинеомицин С. 6 Деоксинеомицин, полученный на стадии а разделяют на 6-деоксинеомицин В и 6-деоксинеомицин G путем бумажной хроматографии при использовании в качестве растворителя смеси третбутанол/ бутанол 6,5 н. раствор гидроокиси аммония/метанол в йоотношении 3:16:6:1. 6-Деоксинеомицин В и 6-деоксинеом цин С разделяют на бумаге с использованием описанного способа. При использовании системы раствор телей, представляющей собой метанол и гидроокись аммония в соотношении i к 1 на ЭМИ Ватманской хроматографи ческой бумаге, значения R для 6-деоксинеомицина В и С определяют по сравнению с соответствующими эпимера ми неомицина и получают следующие ре зультаты: 6-Деоксинеомицин В0,29 6-Деоксинеомицин С0,21 Неомицин В0,25 Неомицин С0,165 Пример 2. Получение 6-деокс парогюмицина и его эпимеров 1 и 11. В колбе выращивают Streptomyces формы paramomycines АТСС 2148 в течение 2-3 дней, установив предварительно рН 7,5, в следующей среде, г: Соевая мука 1 Гидролизат казеина 0,25 СаСО)0,5 Глюкоза1 NaCl0,5 9- 12 . 0,167 До объема Вода 100 мл Культуру встряхивают и поддерживают при 2irC в течение указанного промежутка времени. Затем 10% прививочного материала этой культуры добавляют в среду, идентичную описанной, но содержащую дополнительно 0,025 г 2, «-дидеоксистрептамин ди гидрохлорида Культуры инкубируют в Эрленмейровских колбах при 28-30 0 и роторном встряхивателе при хорошей аэрации. Последующие операции по получению и разделению 6-деоксипаромомицина в точности такие, как описаны в примере 1. Очистка бумажной хроматографией при тех же условиях, что описаны в примере 1, показ шает, чтоЯ для 6-деоксипаромомицина составляет 0,30. Для сравнения можно отметить, что R для паромомицина, определенное таким же хроматографическим анализом, составляет 0,27. При использовании системы растворителей , состоящей из метанола и гидроокиси аммония в соотношении t: на ЭММ Ватманской хроматографической бумаге, определяют значения 6-деоксипаромомицинов 1 и 11 в сравнении с соответствующими эпимерами паромомицина и получают следующие результаты: 6-Деоксипаромомицин 1 Т),3 6-Деоксипаромомицин 11 0,275 Паромомицин 10,3 Паромомицин 110,22 Пример 3. Получение смеси 3 ,t -дидеоксинеомицина и его производных . а) Смесь гентаминов. Ее получают из выпускаемого промышленностью гентамицинсульфата . Эту соль вначале превращают в ее свободное основание и выпаривают с получением масла. Раствор соляной кислоты в метаноле, полученный добавлением хлористоводородной кислоты к сухому метанолу, добавляют к этому маслу и полученный в результате раствор нагревают с обратным холодильником в течение 2 ч. Метанольный раствор соляной кислоты удаляют в вакууме, а полученное в результате масло разбавляют небольшим количеством воды и пропускают через колонку с Amberlite IRA lOO с получением свободного основания желаемых гентаминов. Полученные таким образом различные 13 фракции собирают, выпаривают досуха разделяют на метилгарозаминид и смешанные гентамины с помощью хроматографирования на силикагеле с использованием в качестве растворителя сме си метанол /хлороформ/ гидооокись аммония в соотношении 1:1:1. После такого хроматографического разделения метилгарозаминид дает Rr 0,8, а смесь гентаминов 0,2, б Смесь 3 , -дидзоксинеомицина и его производных. В колбе выращивают D-Strep.tomyces rinrosus формы paranromycinus АТСС в течение двух-трех дней, предварительно установив рН 7,5, на следующей среде, г: Соевая мука Гидролизат казеина Глюкоза KyTibTypy встряхивают и поддержива ют при в течение указанного пер ода времени. Затем 10 прививочной материал этой культуры добавляют к среде,. идентичной-указанной,..содержа 91 щей дополнительно 50 мг смеси гентаминов и полученной заранее, устанавли- . . ая при этом рН 7,2. Культуры инкубируют в ЭрленмейероЬских колбах при ЗОРС на роторном встряхивателе при хорошей аэрации в тетечение 5 дней., Сырую смесь 3 , -дидеоксинеомицина и его производных, полученную таким образом, очищают бумажной хроматографией на ЭММ Ватманской бумаге, использ я для проявления раствор метанол/гидроокись аммония в соотношении k:. Положение смеси 3 , -дидеоксипе неомицина и его производных определяют визуально с использованием 0,25 ного раствора гипохлорита натрия в воде, затем абсолютного этанола и затем % растворимого крахмала и }% иодида калия в воде при сушке воздухом между применением каждого из реагентов . Rf смеси 3,, дидеоксинеомицина и его производных составляет 0,25 (Rf смеси гентаминов формулы Ш при идентичном хроматографическом анализе составляет 0,5-0,7).
Реферат
Формула
