Кумарины, замещенные вторичными аминами, и их применение в качестве флуоресцентных меток - RU2756272C2

Чертежи

Описание

Настоящее изобретение относится к кумаринам, замещенным вторичными аминами, и применению таких соединений в качестве флуоресцентных маркеров. В частности, соединения могут быть применены в качестве флуоресцентных меток для нуклеотидов при секвенировании нуклеиновых кислот.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящей работе для более полного описания состояния области техники, к которой относится настоящее изобретение, цитируются некоторые публикации и патентные документы. Содержание каждой из этих публикаций и документов включено в настоящее описание посредством ссылки.

Нерадиоактивное обнаружение нуклеиновых кислот, имеющих флуоресцентные метки, является важным инструментом молекулярной биологии. Различные протоколы методик, которые ранее применяли при исследовании рекомбинантных ДНК, основывались на применении нуклеотидов или полинуклеотидов, меченных радиоактивными метками, например,³²Р. Радиоактивные соединения обеспечивают высокую чувствительность обнаружения нуклеиновых кислот и других целевых молекул. Однако применение радиоактивных изотопов имеет ряд серьезных ограничений, таких как их высокая стоимость, ограниченный срок хранения, недостаточная чувствительность и, что более важно, небезопасность. Устранение необходимости использования радиоактивных меток снижает риски, связанные с опасным воздействием на человека и окружающую среду, а также связанные с этим затраты, например, затраты на утилизацию реагентов. Способы, для которых подходят нерадиоактивные методики флуоресцентного обнаружения, включают, без ограничений, автоматизированное секвенирование ДНК, гибридизационные способы, обнаружение продуктов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и иммунохимические анализы.

Для многих методик желательно применение различных спектрально различимых флуоресцентных меток, которые позволяют независимо обнаруживать совокупность пространственно перекрывающихся аналитов (анализируемых веществ). Применение таких мультиплексных способов позволяет снизить количество реакционных емкостей, упростить протоколы экспериментов и облегчить производство специализированных наборов реагентов. Например, в системах многоцветного автоматизированного секвенирования ДНК мультиплексное флуоресцентное обнаружение позволяет определять несколько нуклеотидных оснований на одной электрофоретической дорожке, что позволяет повышать производительность по сравнению со способами одноцветного обнаружения и снижать неопределенность, обусловленную вариациями электрофоретической мобильности внутри одной дорожки.

Однако мультиплексное флуоресцентное обнаружение может быть связано с рядом проблем, и имеется ряд важных факторов, которые ограничивают выбор подходящих флуоресцентных меток. Во-первых, для данного применения может быть затруднительным обнаружение красителей, имеющих спектры поглощения и испускания с подходящим разрешением. Кроме того, при совместном применении нескольких флуоресцентных красителей, затруднительной может быть генерация флуоресцентных сигналов в различных спектральных областях при одновременном возбуждении, поскольку полосы поглощения красителей обычно сильно разнесены, что затрудняет достижение сравнимых эффективностей флуоресцентного возбуждения даже для двух красителей. Во многих случаях для возбуждения применяют источники излучения высокой мощности, такие как лазеры, и для того, чтобы выдержать подобное возбуждение, красители должны иметь достаточную фотоустойчивость. Наконец, особенно важным аспектом способов, применяемых в молекулярной биологии, является необходимая степень совместимости флуоресцентных красителей с химическими реагентами, такими как, например, растворители и реагенты для синтеза ДНК, буферы, полимеразные ферменты и лигазные ферменты.

По мере развития методик секвенирования возникает необходимость в создании новых флуоресцентных красителей, их конъюгатов с нуклеиновыми кислотами, а также необходимость в создании новых наборов из нескольких красителей, которые позволили бы устранить все рассмотренные выше трудности и были бы особенно подходящими для применения в высокопроизводительных способах молекулярной биологии, таких как твердофазное секвенирование и подобные способы.

Применение молекул флуоресцентных красителей, имеющих улучшенные флуоресцентные свойства, такие как подходящая интенсивность флуоресценции, форма и длина волны максимума флуоресценции, может повысить скорость и точность секвенирования нуклеиновых кислот. Выраженность сигналов флуоресценции особенно важна при проведении измерений в водных биологических буферах и при повышенных температурах, поскольку интенсивности флуоресценции большинства красителей в этих условиях значительно снижаются. Кроме того, природа основания, к которому присоединен краситель, также влияет на максимум флуоресценции, интенсивность флуоресценции и другие спектральные свойства красителя. Определенная конструкция флуоресцентных красителей позволяет инициировать последовательность-специфичные взаимодействия между нуклеотидными основаниями и флуоресцентными красителями. Оптимизация структуры флуоресцентных красителей может повышать эффективность встраивания нуклеотида, снижать частоту ошибок секвенирования и снижать расход реагентов и, следовательно, стоимость секвенирования нуклеиновых кислот.

Некоторые разработки в области оптики и технологии привели к значительному улучшению качества изображения, но в конечном итоге они были ограничены низким оптическим разрешением. Обычно оптическое разрешение оптической микроскопии ограничено объектами, расположенными на расстоянии приблизительно половины длины волны применяемого света. Точнее говоря, только объекты, расположенные достаточно далеко (по меньшей мере на расстоянии от 200 до 350 нм), могут быть распознаны с помощью оптической микроскопии. Одним из способов повысить разрешение изображения и увеличить количество распознаваемых объектов на единицу площади поверхности является применение излучения возбуждения более коротких длин волн. Например, если длину волны излучения понижают на Δλ~100 нм при использовании тех же оптических устройств, разрешение будет выше (приблизительно Δ50 нм / (приблизительно 15%)), записываемые изображения будут менее искаженными, и плотность объектов на распознаваемой области повысится приблизительно на 35%.

В некоторых способах секвенирования нуклеиновых кислот для возбуждения и обнаружения меченных красителями нуклеотидов применяют лазерное излучение. В таких способах используют свет большей длины волны, такой как красное лазерное излучение, в комбинации с подходящими красителями, способными возбуждаться при 660 нм. Для секвенирования более плотно упакованных кластеров нуклеиновых кислот с сохранением подходящего разрешения может быть применен источник синего света (450-460 нм) с более короткой длиной волны. В этом случае оптическое разрешение будет ограничено не длиной волны излучения более длинноволновых красных флуоресцентных красителей, а излучением красителей, возбуждаемых источником света, имеющим следующую, чуть меньшую длину волны, например, "зеленым лазером" при 532 нм. Таким образом, имеется необходимость получения красителей-меток, испускающих излучение в синем диапазоне, флуоресцентное излучение которых может быть использовано для обнаружения в способах секвенирования.

Несмотря на то, что химические свойства синих красителей и соответствующие лазерные технологии были усовершенствованы и, например, привели к созданию красителей для DVD дисков и Blu-ray дисков, такие соединения не подходят для получения биологических меток и не могут быть применены в качестве биомаркеров.

К сожалению, коммерчески доступные синие красители, испускающие мощное флуоресцентное излучение, подходящее для мечения нуклеотидов, встречаются довольно редко. Настоящее изобретение относится к новым флуоресцентным соединениям, подходящим для мечения нуклеотидов, испускающим мощное флуоресцентное излучение при возбуждении синим светом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к производным кумарина, замещенным вторичными аминами. Такие соединения могут быть применены в качестве флуоресцентных меток, в частности, для мечения нуклеотидов, применяемых для секвенирования нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах красители оптимально поглощают свет с длиной волны 450-460 нм, и их применение особенно предпочтительно в ситуациях, в которых применяют источники возбуждающего излучения синего диапазона с длиной волны 450-460 нм. Благодаря более короткой длине волны флуоресцентного излучения, возбуждение синим светом позволяет обнаруживать с достаточным разрешением элементы, расположенные с большей плотностью на единицу площади. При использовании таких красителей в виде конъюгатов с нуклеотидами в способах секвенирования нуклеиновых кислот может быть увеличена длина и повышены интенсивность, точность и качество прочтений секвенирования.

Первый аспект изобретения относится к соединениям, имеющим Формулу (I), или к их солям:

где:

X представляет собой О, S, Se или NRⁿ, где Rⁿ представляет собой Н или C₁-₆алкил;

каждый из R и R¹ независимо представляет собой Н, галоген, -CN, -CO₂H, амино, -ОН, С-амидо, N-амидо, -NO₂, -SO₃H, -SO₂NH₂, факультативно замещенный алкил, факультативно замещенный алкенил, факультативно замещенный алкинил, факультативно замещенный алкокси, факультативно замещенный аминоалкил, факультативно замещенный карбоциклил, факультативно замещенный гетероциклил, факультативно замещенный арил или факультативно замещенный гетероарил;

каждый из R² и R⁴ независимо представляет собой Н, галоген, -CN, -CO₂H, амино, -ОН, С-амидо, N-амидо, -NO₂, -SO₃H, -SO₂NH₂, факультативно замещенный алкил, факультативно замещенный алкенил, факультативно замещенный алкинил, факультативно замещенный алкокси, факультативно замещенный аминоалкил, факультативно замещенный карбоциклил, факультативно замещенный гетероциклил, факультативно замещенный арил или факультативно замещенный гетероарил; или один из R² и R⁴ соединен с R³ с образованием факультативно замещенного гетероциклического кольца;

R³ представляет собой Н, С_1-6алкил, замещенный С_2-6алкил, факультативно замещенный С_2-6алкенил, факультативно замещенный С_2-6алкинил или факультативно замещенный карбоциклил, гетероциклил, арил или гетероарил, или R³ соединен с R² или R⁴ с образованием факультативно замещенного цикла;

где, если R представляет собой -CN, то R³ не является С_1-6алкилом;

каждый R⁵ независимо представляет собой галоген, -CN, -CO₂H, амино, -ОН, С-амидо, N-амидо, -NO₂, -SO₃H, -SO₂NH₂, факультативно замещенный алкил, факультативно замещенный алкенил, факультативно замещенный алкинил, факультативно замещенный алкокси, факультативно замещенный аминоалкил, факультативно замещенный карбоциклил, факультативно замещенный гетероциклил, факультативно замещенный арил или факультативно замещенный гетероарил; и

m составляет 0, 1, 2, 3 или 4.

В некоторых аспектах R не является -CN, то есть R представляет собой Н, галоген, -CO₂H, амино, -ОН, С-амидо, N-амидо, -NO₂, -SO₃H, -SO₂NH₂, факультативно замещенный алкил, факультативно замещенный алкенил, факультативно замещенный алкинил, факультативно замещенный алкокси, факультативно замещенный аминоалкил, факультативно замещенный карбоциклил, факультативно замещенный гетероциклил, факультативно замещенный арил или факультативно замещенный гетероарил.

Другой аспект относится к соединению, имеющему Формулу (II), или к его соли:

где:

X' выбран из О, S и NR^p, где R^p представляет собой Н или С_1-6алкил;

R⁶ представляет собой Н или С_1-4алкил;

R⁷ представляет собой Н, галоген, -CN, -ОН, факультативно замещенный C_1-4алкил, факультативно замещенный С_1-4алкенил, факультативно замещенный С_2-4алкинил, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂NH(C_1-4алкил), -SO₂N(C_1-4алкил)₂ и факультативно замещенный С_1-4алкокси;

каждый из R⁸ и R¹⁰ независимо представляет собой Н, галоген, -CN, -CO₂H, амино, -ОН, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂NH(С_1-4алкил), -SO₂N(С_1-4алкил)₂, факультативно замещенный С_1-6алкил, факультативно замещенный С_1-6алкенил, факультативно замещенный С_2-6алкинил или факультативно замещенный С_1-6алкокси; или

один из R⁸ и R¹⁰ представляет собой Н, галоген, -CN, -CO₂H, амино, -ОН, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂NH(C_1-4алкил), -SO₂N(С_1-4алкил)₂, факультативно замещенный С_1-6алкил, факультативно замещенный С_1-6алкенил, факультативно замещенный С_2-6алкинил или факультативно замещенный С_1-6алкокси, и другой R⁸ и R¹⁰ вместе с R⁹ образует факультативно замещенное гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 7 членов;

R⁹ представляет собой С_2-6алкил или С_1-6алкил, замещенный -CO₂H, -CO₂C_1-4алкилом, -CONH₂, -CONH(С_1-4алкилом), -CON(С_1-4алкилом)₂, -CN, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂NH(C_1-4алкилом) или -SO₂N(С_1-4алкилом)₂;

каждый R¹¹ независимо представляет собой галоген, -CN, карбокси, амино, -ОН, С-амидо, N-амидо, нитро, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂NH(C_1-4алкил), -SO₂N(С_1-4алкил)₂, факультативно замещенный алкил, факультативно замещенный алкенил, факультативно замещенный алкинил и факультативно замещенный С_1-6алкокси; и

q составляет 0, 1 или 2.

В другом варианте осуществления соединение согласно настоящему изобретению образует конъюгат с частицей субстрата такой как, например, нуклеозид, нуклеотид, полинуклеотид, полипептид, углевод, лиганд, частица, клетка, полутвердая поверхность (например, гель) или твердая поверхность. Конъюгат может быть образован через карбоксильную группу -CO₂H, которая, с помощью способов, известных в данной области техники, может быть введена в реакцию с аминогруппой или гидроксильной группой, имеющейся на частице субстрата (такой как нуклеотид), или присоединенным к ней линкером, с образованием амида или сложного эфира.

Таким образом, другой аспект изобретения относится к соединениям-красителям, включающим линкерные группы, способные, например, ковалентно связываться с частицей субстрата. Присоединение может быть произведено по любому положению красителя, включая любую из R групп. Присоединение может быть осуществлено через R³ или через R⁵ Формулы (I) или через R⁹ или R¹¹ Формулы (II).

Другой аспект изобретения относится к нуклеозидному или нуклеотидному соединению, описываемому формулой:

N-L-Краситель

где N представляет собой нуклеотид;

L представляет собой необязательный линкерный фрагмент; и

Краситель представляет собой флуоресцентное соединение согласно настоящему изобретению.

Таким образом, некоторые примеры осуществления, рассмотренные в настоящей работе, относятся к частице, в частности, к нуклеотиду или олигонуклеотиду, меченному соединением, имеющим (а) Формулу (I) или (b) Формулу (II).

Другой аспект изобретения относится к способам секвенирования с применением соединений-красителей согласно настоящему изобретению.

Еще один аспект изобретения также относится к набору, включающему соединение-краситель (в свободной или конъюгированной форме), который может быть применен в различных иммунологических исследованиях, для мечения олигонуклеотидов или нуклеиновых кислот или для секвенирования ДНК синтезом. Еще один аспект изобретения относится к наборам, включающим "комплекты" красителей, особенно подходящие для проведения циклов секвенирования синтезом на автоматизированной инструментальной платформе. Некоторые аспекты относятся к наборам, содержащим один или более нуклеотидов, в которых по меньшей мере один нуклеотид представляет собой меченый нуклеотид, рассмотренный в настоящей работе.

Еще один аспект изобретения относится к химическому синтезу соединений согласно изобретению, включающих замещенные вторичным амином кумариновые красители и вещества, такие как нуклеотиды, меченные такими красителями.

Другие аспекты изобретения относятся к способам секвенирования, включающим введение меченого нуклеотида, рассмотренного в настоящей работе, в полинуклеотид при проведении анализа секвенированием и обнаружение встроенного меченого нуклеотида.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1А, 1В и 1С представлены диаграммы рассеяния, которые показывают применимость новых красителей, рассмотренных в настоящей работе, в секвенировании с помощью методики Illumina секвенирования синтезом (англ. sequencing-by-synthesis, сокращенно SBS). Красители обнаруживаются в виде четырех отчетливых, спектрально разрешенных зон, как указано в Примере 5.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к замещенным вторичным амином кумариновым соединениям, особенно подходящим для применения в способах флуоресцентного обнаружения и секвенирования синтезом. Примеры осуществления, рассмотренные в настоящей работе, относятся к красителям и их производным, имеющим структуру, соответствующую Формуле (I).

Первый аспект изобретения относится к соединениям, имеющим Формулу (I), или их солям.

Конкретные ограничения для различных заместителей указаны ниже. Если не указано иное, каждая отдельная группа может быть скомбинирована с любым другим индивидуальным ограничением.

Для улучшения флуоресцентных свойств биомаркеров и, в частности, их биоконъюгатов в растворах на водной основе, соединение, имеющее Формулу (I), представляет собой соединение, в котором:

i) R² представляет собой -SO₃H; и/или

ii) R⁴ представляет собой -SO₃H; и/или

iii) R⁵ представляет собой -SO₃H или -SO₂NH₂.

В некоторых аспектах X представляет собой О или S. В некоторых аспектах X представляет собой О. В некоторых аспектах X представляет собой S. В некоторых аспектах X представляет собой NRⁿ, где Rⁿ представляет собой Н или С_1-6алкил, и в некоторых аспектах Rⁿ представляет собой Н.

В некоторых аспектах R³ представляет собой Н. В некоторых аспектах R³ представляет собой метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, или гексил. В других аспектах R³ представляет собой этил. В других аспектах R³ представляет собой замещенный С_2-6алкил. В других аспектах R³ представляет собой С_2-6алкил, замещенный -CO₂H. В других аспектах R³ представляет собой факультативно замещенный С_2-6алкенил или факультативно замещенный С_2-6алкинил. В некоторых аспектах R³ соединен с R² или R⁴ с образованием факультативно замещенного цикла.

Если соединение с линкером или нуклеотидом происходит через R³, то R³ должен иметь достаточную длину для соединения с присоединяемой к нему функциональной группой. В некоторых аспектах R³ не является -СН₂СООН или -СН₂СОО^-.

Факультативно R³ представляет собой -(СН₂)_nCOOH, где n составляет от 2 до 6. В некоторых аспектах n составляет 2, 3, 4, 5 или 6. В других аспектах n составляет 2 или 5. В некоторых аспектах n составляет 2. В некоторых аспектах n составляет 5.

Факультативно R³ представляет собой -(CH₂)_nSO₃H, где n составляет от 2 до 6. В некоторых аспектах n составляет 2, 3, 4, 5 или 6. В других аспектах n составляет 2 или 5. В некоторых аспектах n составляет 2. В некоторых аспектах n составляет 5.

Бензольный цикл индольного фрагмента факультативно замещен в любом из следующих положений: в первом, втором, третьем или четвертом, и заместитель обозначен R⁵. Если m равен нулю, то бензольный цикл не замещен. Если m составляет более 1, то все R⁵ могут быть одинаковыми или различными. В некоторых аспектах m составляет 0. В других аспектах m составляет 1. В других аспектах m составляет 2. В некоторых аспектах m составляет 1, 2 или 3, и каждый R⁵ независимо представляет собой галоген, -CN, -CO₂H, амино, -ОН, -SO₃H, или -SO₂NH₂. В некоторых аспектах R⁵ представляет собой -(СН₂)_хСООН, где X составляет от 2 до 6. В некоторых аспектах X составляет 2, 3, 4, 5 или 6. В других аспектах X составляет 2 или 5. В некоторых аспектах X составляет 2. В некоторых аспектах X составляет 5.

В некоторых аспектах R⁵ представляет собой галоген, -CN, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂ или факультативно замещенный С_1-6алкил. В некоторых аспектах R⁵ представляет собой галоген, -CO₂H, -SO₃H или -SO₂NH₂. В некоторых аспектах R⁵ представляет собой С_2-6алкил, замещенный -CO₂H, -SO₃H или -SO₂NH₂. В некоторых аспектах каждый R⁵ независимо представляет собой факультативно замещенный С_1-6алкил, галоген, -CN, -CO₂H, амино, -ОН, -SO₃H или -SO₂NH₂.

В некоторых аспектах R¹ представляет собой Н. В некоторых аспектах R¹ представляет собой галоген. В некоторых аспектах R¹ представляет собой Cl. В некоторых аспектах R¹ представляет собой С_1-6алкил. В некоторых аспектах R¹ представляет собой метил.

В некоторых аспектах R представляет собой Н. В некоторых аспектах R представляет собой галоген. В некоторых аспектах R представляет собой Cl. В некоторых аспектах R представляет собой С_1-6алкил. В некоторых аспектах R представляет собой метил. В некоторых аспектах R не является -CN. В некоторых аспектах R представляет собой Н, галоген, -CO₂H, амино, -ОН, С-амидо, N-амидо, -NO₂, -SO₃H, -SO₂NH₂, факультативно замещенный алкил, факультативно замещенный алкенил, факультативно замещенный алкинил, факультативно замещенный алкокси, факультативно замещенный аминоалкил, факультативно замещенный карбоциклил, факультативно замещенный гетероциклил, факультативно замещенный арил или факультативно замещенный гетероарил.

В некоторых аспектах R² представляет собой Н. В некоторых аспектах R² представляет собой факультативно замещенный алкил. В некоторых аспектах R² представляет собой С_1-4алкил, факультативно замещенный -CO₂H или -SO₃H. В некоторых аспектах R² представляет собой -SO₃H. В некоторых аспектах R² соединен с R³ с образованием факультативно замещенного гетероциклического кольца, такого как пирролидин или пиперидин, факультативно замещенного одной или более алкильными группами. В некоторых аспектах R² представляет собой Н, факультативно замещенный алкил, С_1-4алкил, факультативно замещенный -CO₂H или -SO₃H, или -SO₃H. В некоторых аспектах R² представляет собой Н или -SO₃H.

В некоторых аспектах R⁴ представляет собой Н. В некоторых аспектах R⁴ представляет собой факультативно замещенный алкил. В некоторых аспектах R⁴ представляет собой С_1-4алкил, факультативно замещенный -CO₂H или -SO₃H. В некоторых аспектах R⁴ представляет собой -SO₃H. В некоторых аспектах R⁴ соединен с R³ с образованием факультативно замещенного гетероциклического кольца, такого как пирролидин или пиперидин, факультативно замещенного одной или более алкильными группами.

Конкретные примеры соединения, имеющего Формулу (I), включают следующее: X представляет собой О или S; R представляет собой Н, R¹ представляет собой Н, R³ представляет собой -(СН₂)_nCOOH, где т составляет от 2 до 6, R⁵ представляет собой Н, -SO₃H или -SO₂NH₂, R² представляет собой Н или -SO₃H, и R⁴ представляет собой Н или -SO₃H.

Конкретные примеры соединения, имеющего Формулу (I), включают варианты, в которых: X представляет собой О или S; R представляет собой Н, R¹ представляет собой Н, R³ представляет собой -(СН₂)₂СООН, R⁵ представляет собой Н, -SO₃H или -SO₂NH₂, R² представляет собой Н или -SO₃H, и R⁴ представляет собой Н или -SO₃H.

Конкретные примеры соединения, имеющего Формулу (I), включают варианты, в которых: X представляет собой О или S; R представляет собой Н; R¹ представляет собой Н; R³ представляет собой -(СН₂)₅СООН; R⁵ представляет собой Н, -SO₃H или -SO₂NH₂, R² представляет собой Н или -SO₃H, и R⁴ представляет собой Н или -SO₃H.

В некоторых аспектах в Формуле (II) X' представляет собой О. В некоторых аспектах X' представляет собой S. В некоторых аспектах X' представляет собой NR^p, где R^p представляет собой Н или С_1-6алкил. В некоторых аспектах X' представляет собой NR^p, где R^p представляет собой Н.

В некоторых аспектах R⁶ представляет собой Н. В некоторых аспектах R⁶ представляет собой С_1-4алкил.

В некоторых аспектах R⁷ представляет собой Н. В некоторых аспектах R⁷ представляет собой факультативно замещенный С_1-4алкил, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂NH(C_1-4алкил) или -SO₂N(C_1-4алкил)₂. В некоторых аспектах R⁷ представляет собой С_1-4алкил, факультативно замещенный -CO₂H.

В некоторых аспектах R⁸ представляет собой Н. В некоторых аспектах R⁸ представляет собой -CO₂H, -SO₃H или -SO₂NH₂. В некоторых аспектах R⁸ представляет собой -SO₃H.

В некоторых аспектах R¹⁰ представляет собой Н. В некоторых аспектах R¹⁰ представляет собой -CO₂H, -SO₃H или -SO₂NH₂. В некоторых аспектах R¹⁰ представляет собой -SO₃H. В некоторых аспектах R⁸ представляет собой Н, и R¹⁰ представляет собой -SO₃H. В некоторых аспектах R⁸ представляет собой -SO₃H, и R¹⁰ представляет собой Н.

В некоторых аспектах один из R⁸ и R¹0 представляет собой Н, галоген, -CN, -CO₂H, амино, -ОН, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂NH(C_1-4алкил), -SO₂N(C_1-4алкил), факультативно замещенный С_1-6алкил, факультативно замещенный С_1-6алкенил, факультативно замещенный С_2-6алкинил или факультативно замещенный C_1-6алкокси, и другой R⁸ и R¹⁰ образует совместно с R⁹ факультативно замещенное гетероциклическое кольцо, содержащее от 4 до 7 членов.

В некоторых аспектах R⁹ представляет собой С_2-6алкил. В некоторых аспектах R⁹ представляет собой С_1-6алкил, замещенный -CO₂H, -CO₂C_1-4алкил, -CONH₂, -CONH(С_1-4алкил), -CON(C_1-4алкил)₂, -CN, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂NH(C_1-4алкил) или -SO₂N(С_1-4алкил)₂. В некоторых аспектах R⁹ представляет собой С_1-6алкил, замещенный -CO₂H. В некоторых аспектах R⁹ представляет собой -(СН₂)_у-CO₂H, где у составляет 2, 3, 4 или 5.

В некоторых аспектах каждый R¹¹ независимо представляет собой галоген, -CO₂H, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂NH(C_1-4алкил), -SO₂N(C_1-4алкил)₂ или факультативно замещенный алкил. В других аспектах каждый R¹¹ независимо представляет собой галоген, -CO₂H, -SO₃H или -SO₂NH₂.

В некоторых аспектах q равен 0. В других аспектах q равен 1. В других аспектах q равен 2.

Конкретные примеры замещенных вторичным амином кумариновых красителей включают:

и соли приведенных соединений.

Особенно подходящим соединением является нуклеотид или олигонуклеотид, меченный красителем, рассмотренным в настоящей работе. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к атому азота молекулы кумарина через алкилкарбоксильную группу, в результате чего образуется алкиламид. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к положению С5 пиримидинового основания или положению С7 7-деазапуринового основания через линкерный фрагмент.

Меченый нуклеотид или олигонуклеотид также может содержать блокирующую группу, ковалентно присоединенную к рибозному или дезоксирибозному сахару нуклеотида. Блокирующая группа может быть присоединена к любому положению рибозного или дезоксирибозного сахара. В конкретных примерах осуществления блокирующая группа находится в 3' ОН положении рибозного или дезоксирибозного сахара нуклеотида.

Предложены наборы, включающие два или более нуклеотида, в которых по меньшей мере один нуклеотид представляет собой нуклеотид, меченный соединением согласно настоящему изобретению. Набор может включать два или более меченых нуклеотида. Нуклеотиды могут быть помечены двумя или более флуоресцентными метками. Две или более метки могут быть возбуждены одним источником возбуждающего излучения, который может быть лазером. Например, полосы возбуждения двух или более меток могут по меньшей мере частично перекрываться таким образом, что возбуждение в перекрывающейся области спектра приводит к флуоресценции обеих меток. В конкретных примерах осуществления излучение двух или более меток находится в различных областях спектра, то есть присутствие по меньшей мере одной из меток может быть обнаружено при оптическом анализе испускаемого излучения.

Набор может содержать четыре меченых нуклеотида, в которых первый из четырех нуклеотидов помечен соединением, рассмотренным в настоящей работе. В таком наборе метка на одном из четырех нуклеотидов может представлять то же соединение, что и на остальных трех нуклеотидах, или отличаться от них. Таким образом, одно или более соединений может иметь отчетливый максимум поглощения и/или максимум испускания, позволяющий отличать целевое соединение (соединения) от других соединений. Например, каждое соединение может иметь отчетливый максимум поглощения и/или максимум испускания, что позволяет отличать каждое из соединений от трех других соединений. Следует понимать, что некоторые части спектра поглощения и/или спектра испускания, в которых не имеется максимумов, могут различаться, и эти различия могут быть использованы для распознавания соединения. Набор может быть составлен таким образом, что два или более соединения имеют отчетливый максимум поглощения. Соединения согласно изобретению обычно поглощают свет в области менее 500 нм.

Соединения, нуклеотиды или наборы согласно изобретению могут быть применены для обнаружения, определения или идентификации биологической системы (включая, например, ее процессы или компоненты). Примеры методик, в которых могут быть применены соединения, нуклеотиды или наборы, включают секвенирование, экспрессионный анализ, анализ гибридизации, генетический анализ, анализ РНК, клеточный анализ (например, клеточное связывание или клеточный функциональный анализ) или белковый анализ (например, анализ связывания белка или анализ активности белка). Применение может быть произведено на автоматизированном устройстве для осуществления конкретной методики, таком как устройство для автоматизированного секвенирования. Устройство для секвенирования может включать два лазера, излучающих свет с разной длиной волны.

В настоящей работе рассмотрены способы синтеза соединений согласно изобретению. Красители согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы из множества различных подходящих исходных материалов. Способы получения кумариновых красителей хорошо известны в данной области техники.

Определения

В настоящей работе названия разделов приведены лишь для организационных целей и не ограничивают раскрытый предмет изобретения.

Следует отметить, что используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное, если ясно и недвусмысленно не указан единственный объект. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в различные примеры осуществления, рассмотренные в настоящей работе, могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за пределы объема настоящего изобретения. Таким образом, следует понимать, что различные примеры осуществления, рассмотренные в настоящей работе, включают другие изменения и модификации, не выходящие за пределы объема, определяемого прилагаемыми пунктами формулы изобретения и их эквивалентами.

Если не указано иное, все технические и научные термины, употребляемые в настоящем описании, имеют обычное значение, понятное специалистам в данной области техники. Значение термина "включающий", а также других его форм, таких как "включают", "включает" и "включаемый", не является ограничивающим. Значение термина "имеющий", а также других его форм, таких как "имеют", "имеет" и "имел", не является ограничивающим. Употребляемые в настоящем описании, как в переходной фразе, так и в тексте пункта формулы изобретения, термины "включают (включает)" и "включающий" имеют неисчерпывающее значение. Таким образом, приведенные выше термины должны рассматриваться как синонимы фразам "имеющий по меньшей мере" или "включающий по меньшей мере." Например, при описании способа термин "включающий" означает, что способ включает по меньшей мере перечисленные этапы и может включать дополнительные этапы. При описании соединения, композиции или устройства термин "включающий" означает, что соединение, композиция или устройство включает по меньшей мере перечисленные элементы или компоненты, а также может включать дополнительные элементы или компоненты.

В контексте данного документа термин "ковалентно присоединенный" или "ковалентно связанный" относится к формированию химической связи, которая характеризуется обобществлением пары электронов несколькими атомами. Например, ковалентно присоединенное полимерное покрытие означает полимер полимерное покрытие, которое образует химические связи с функционализированной поверхностью субстрата, в отличие от присоединения к поверхности другими средствами, например, посредством адгезионного или электростатического взаимодействия. Следует понимать, что полимеры, ковалентно присоединенные к поверхности, наряду с ковалентным присоединением также могут быть присоединены другими средствами.

В контексте данного документа термин "галоген" или "галогено" означает любой из радиоактивно стабильных атомов 7 группы Периодической системы элементов, например, фтор, хлор, бром или йод, причем предпочтительными являются фтор и хлор.

В контексте данного документа термин "алкил" относится к неразветвленной или разветвленной, полностью насыщенной (т.е. не содержащей двойных или тройных связей) углеводородной цепочке. Алкильная группа может содержать от 1 до 20 атомов углерода (при любом упоминании в настоящем описании, числовой диапазон, такой как "от 1 до 20", относится к каждому целому числу, содержащемуся в указанном диапазоне; например, "от 1 до 20 атомов углерода" означает, что алкильная группа может состоять из 1 атома углерода, 2 атомов углерода, 3 атомов углерода и т.д., вплоть до и включая 20 атомов углерода, хотя приведенное определение также включает употребление термина "алкил" в тех случаях, когда числовой диапазон не указан). Алкильная группа также может представлять собой алкил среднего размера, содержащий от 1 до 9 атомов углерода. Алкильная группа также может представлять собой низший алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода. Алкильная группа может быть обозначена "С_1-4алкил" или аналогичными обозначениями. В неограничивающем примере обозначение "С_1-6алкил" указывает на то, что алкильная цепочка содержит от одного до шести атомов углерода, т.е. алкильная цепочка выбрана из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Типичные алкильные группы включают, без ограничений, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, третичный бутил, пентил, гексил и подобные группы.

В контексте данного документа термин "алкокси" относится к формуле -OR, в которой R представляет собой алкил, охарактеризованный выше, такой как "C_1-9алкокси", которая включает, без ограничений, следующие группы: метокси, этокси, н-пропокси, 1-метилэтокси (изопропокси), н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси и трет-бутокси и подобные группы.

В контексте данного документа термин "алкенил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке, содержащей одну или более двойных связей. Алкенильная группа может содержать от 2 до 20 атомов углерода, хотя приведенное определение также включает употребление термина "алкенил" в тех случаях, когда числовой диапазон не указан. Алкенильная группа также может представлять собой алкенил среднего размера, содержащий от 2 до 9 атомов углерода. Алкенильная группа также может представлять собой низший алкенил, содержащий от 2 до 6 атомов углерода. Алкенильная группа может быть обозначена "С_2-6алкенил" или аналогичными обозначениями. В неограничивающем примере обозначение "С_2-6алкенил" указывает на то, что алкенильная цепочка содержит от двух до шести атомов углерода, т.е. алкенильная цепочка выбрана из группы, состоящей из этенила, пропен-1-ила, пропен-2-ила, пропен-3-ила, бутен-1-ила, бутен-2-ила, бутен-3-ила, бутен-4-ила, 1-метил-пропен-1-ила, 2-метилпропен-1-ила, 1-этилэтен-1-ила, 2-метилпропен-3-ила, бута-1,3-диенила, бута-1,2,-диенила и бута-1,2-диен-4-ила. Типичные алкенильные группы включают, без ограничений, этенил, пропенил, бутенил, пентенил и гексенил и подобные группы.

В контексте данного документа термин "алкинил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке, содержащей одну или более тройных связей. Алкинильная группа может содержать от 2 до 20 атомов углерода, хотя приведенное определение также включает употребление термина "алкинил" в тех случаях, когда числовой диапазон не указан. Алкинильная группа также может представлять собой алкинил среднего размера, содержащий от 2 до 9 атомов углерода. Алкинильная группа также может представлять собой низший алкинил, содержащий от 2 до 6 атомов углерода. Алкинильная группа может быть обозначена "С_2-6алкинил" или аналогичными обозначениями. В неограничивающем примере обозначение "С_2-6алкинил" указывает на то, что алкинильная цепочка содержит от двух до шести атомов углерода, т.е. алкинильная цепочка выбрана из группы, состоящей из этинила, пропин-1-ила, пропин-2-ила, бутин-1-ила, бутин-3-ила, бутин-4-ила и 2-бутинила. Типичные алкинильные группы включают, без ограничений, этинил, пропинил, бутинил, пентинил и гексинил и подобные группы.

В контексте данного документа термин "гетероалкил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке, содержащей один или более гетероатомов, то есть элементов, не являющихся углеродом, примеры которых включают, без ограничений, азот, кислород и серу. Гетероалкильная группа может содержать от 1 до 20 атомов углерода, хотя приведенное определение также включает употребление термина "гетероалкил" в тех случаях, когда числовой диапазон не указан. Гетероалкильная группа также может представлять собой гетероалкил среднего размера, содержащий от 1 до 9 атомов углерода. Гетероалкильная группа также может представлять собой низший гетероалкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода. Гетероалкильная группа может быть обозначена "С_1-6гетероалкил" или аналогичными обозначениями. Гетероалкильная группа может содержать один или более гетероатомов. В неограничивающем примере обозначение "С_4-6гетероалкил" указывает на то, что гетероалкильная цепочка содержит от четырех до шести атомов углерода в цепочке и дополнительно один или более гетероатомов в основной цепи.

Термин "ароматический" относится к циклу или циклической системе, содержащей систему сопряженных pi-электронов, и включает как карбоциклические ароматические (например, фенил), так и гетероциклические ароматические группы (например, пиридин). Термин включает моноциклические или конденсированные полициклические (т.е. циклы, содержащие общие соседние пары атомов) группы, при условии, что вся система циклов является ароматической.

В контексте данного документа термин "арил" относится к ароматическому циклу или системе циклов (т.е. к двум или более конденсированным циклам, имеющим общие два соседних атома углерода), содержащей в основной цепи цикла только атомы углерода. Если арил представляет собой систему циклов, то каждый цикл в системе является ароматическим. Арильная группа может содержать от 6 до 18 атомов углерода, хотя приведенное определение также включает употребление термина "арил" в тех случаях, когда числовой диапазон не указан. В некоторых примерах осуществления арильная группа содержит от 6 до 10 атомов углерода. Арильная группа может быть обозначена "С_6-10 арил", "С₆ или С₁₀ арил" или аналогичными обозначениями. Примеры арильных групп включают, без ограничений, фенил, нафтил, азуленил и антраценил.

"Аралкил" или "арилалкил" представляет собой арильную группу, присоединенную в качестве заместителя через алкиленовую группу, такую как "С_7-14аралкил" и подобные группы, включая, в том числе, бензил, 2-фенилэтил, 3-фенилпропил и нафтилалкил. В некоторых случаях алкиленовая группа представляет собой низшую алкиленовую группу (т.е. С_1-6алкиленовую группу).

В контексте данного документа термин "гетероарил" относится к ароматическому циклу или системе циклов (т.е. к двум или более конденсированным циклам, имеющим общие два соседних атома), которая содержит в основной цепи цикла один или более гетероатомов, то есть элементов, не являющихся углеродом, примеры которых включают, без ограничений, азот, кислород и серу. Если гетероарил представляет собой систему циклов, то каждый цикл в системе является ароматическим. Гетероарильная группа может содержать от 5 до 18 членов цикла (т.е. атомов, составляющих основную цепь цикла, включающую атомы углерода и гетероатомы), хотя приведенное определение также включает употребление термина "гетероарил" в тех случаях, когда числовой диапазон не указан. В некоторых примерах осуществления гетероарильная группа содержит от 5 до 10 членов цикла или от 5 до 7 членов цикла. Гетероарильная группа может быть обозначена как "гетероарил, содержащий от 5 до 7 членов", "гетероарил, содержащий от 5 до 10 членов" или аналогичными обозначениями. Примеры гетероарильных циклов включают, без ограничений, фурил, тиенил, фталазинил, пирролил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, триазолил, тиадиазолил, пиридинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, триазинил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензотиазолил, индолил, изоиндолил и бензотиенил.

"Гетероаралкил" или "гетероарилалкил" представляет собой гетероарильную группу, присоединенную в качестве заместителя через алкиленовую группу. Примеры таких групп включают, без ограничений, 2-тиенилметил, 3-тиенилметил, фурилметил, тиенилэтил, пирролилалкил, пиридилалкил, изоксазолилалкил и имидазолилалкил. В некоторых случаях алкиленовая группа представляет собой низшую алкиленовую группу (т.е. С_1-6алкиленовую группу).

В контексте данного документа термин "карбоциклил" означает неароматический цикл или систему циклов, содержащую только атомы углерода в основной цепи циклической системы. Если карбоциклил представляет собой систему циклов, то два или более циклов могут быть соединены друг другом с образованием конденсированной системы, мостиковой системы или спиро-соединенной системы. Карбоциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере один цикл в системе циклов не является ароматическим. Таким образом, карбоциклилы включают циклоалкилы, циклоалкенилы и циклоалкинилы. Карбоциклильная группа может содержать от 3 до 20 атомов углерода, хотя приведенное определение также включает употребление термина "карбоциклил" в тех случаях, когда числовой диапазон не указан. Карбоциклильная группа также может представлять собой карбоциклил среднего размера, содержащий от 3 до 10 атомов углерода. Карбоциклильная группа также может представлять собой карбоциклил, содержащий от 3 до 6 атомов углерода. Карбоциклильная группа может быть обозначена "С_3-6 карбоциклил" или аналогичными обозначениями. Примеры карбоциклильных групп включают, без ограничений, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, 2,3-дигидроинден, бицикло[2,2,2]октанил, адамантил и спиро[4,4]нонанил.

В контексте данного документа термин "циклоалкил" означает полностью насыщенное карбоциклильное кольцо или систему циклов. Их примеры включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.

В контексте данного документа термин "гетероциклил" означает неароматический цикл или систему циклов, содержащую в основной цепи цикла по меньшей мере один гетероатом. Гетероциклилы могут быть соединены друг другом с образованием конденсированной системы, мостиковой системы или спиро-соединенной системы. Гетероциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере один цикл в системе циклов не является ароматическим. Гетероатом (гетероатомы) могут присутствовать как в неароматическом, так и в ароматическом цикле системы циклов. Гетероциклильная группа может содержать от 3 до 20 членов цикла (т.е. атомов, составляющих основную цепь цикла, включающую атомы углерода и гетероатомы), хотя приведенное определение также включает употребление термина "гетероциклил" в тех случаях, когда числовой диапазон не указан. Гетероциклильная группа также может представлять собой гетероциклил среднего размера, содержащий от 3 до 10 членов цикла. Гетероциклильная группа также может представлять собой гетероциклил, содержащий от 3 до 6 членов цикла. Гетероциклильная группа может быть обозначена "гетероциклил, содержащий от 3 до 6 членов" или аналогичными обозначениями. В предпочтительных шестичленных моноциклических гетероциклилах гетероатом (гетероатомы) выбран из О, N или S, которые могут содержаться в количестве от одного до трех, и в предпочтительных пятичленных моноциклических гетероциклилах гетероатом (гетероатомы) выбран из одного или двух гетероатомов, выбранных из О, N или S. Примеры гетероциклильных групп включают, без ограничений, азепинил, акридинил, карбазолил, циннолинил, диоксоланил, имидазолинил, имидазолидинил, морфолинил, оксиранил, оксепанил, тиепанил, пиперидинил, пиперазинил, диоксопиперазинил, пирролидинил, пирролидонил, пирролидионил, 4-пиперидонил, пиразолинил, пиразолидинил, 1,3-диоксинил, 1,3-диоксанил, 1,4-диоксинил, 1,4-диоксанил, 1,3-оксатианил, 1,4-оксатиинил, 1,4-оксатианил, 2H-1,2-оксазинил, триоксанил, гексагидро-1,3,5-триазинил, 1,3-диоксолил, 1,3-диоксоланил, 1,3-дитиолил, 1,3-дитиоланил, изоксазолинил, изоксазолидинил, оксазолинил, оксазолидинил, оксазолидинонил, тиазолинил, тиазолидинил, 1,3-оксатиоланил, индолинил, изоиндолинил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидро-1,4-тиазинил, тиаморфолинил, дигидробензофуранил, бензимидазолидинил, и тетрагидрохинолин.

"О-карбоксильной" группой называется группа "-OC(=O)R", в которой R выбран из водорода, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкинила, С_3-7карбоциклила, С_6-10арила, гетероарила, содержащего от 5 до 10 членов, и гетероциклила, содержащего от 3 до 10 членов, определение которых дано выше.

"С-карбоксильной" группой называется группа "-C(=О)OR", в которой R выбран из водорода, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкинила, С_3-7карбоциклила, С_6-10арила, гетероарила, содержащего от 5 до 10 членов, и гетероциклила, содержащего от 3 до 10 членов, определение которых дано выше. Неограничивающий пример такой группы включает карбоксил (т.е. -С(=O)ОН).

"Сульфонильной" группой называется группа "-SO₂R", в которой R выбран из водорода, C_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкинила, С_3-7карбоциклила, С_6-10арила, гетероарила, содержащего от 5 до 10 членов, и гетероциклила, содержащего от 3 до 10 членов, определение которых дано выше.

"Сульфино"-группой называется группа "-S(=О)OH".

"S-сульфонамидной" группой называется группа "-SO₂NR_AR_B", в которой каждый из R_A и R_B независимо выбран из водорода, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкинила, С_3-7карбоциклила, С_6-10арила, гетероарила, содержащего от 5 до 10 членов, и гетероциклила, содержащего от 3 до 10 членов, определение которых дано выше.

"N-сульфонамидной" группой называется группа "-N(R_A)SO₂R_B", в которой каждый из R_A и R_B независимо выбран из водорода, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкинила, С_3-7карбоциклила, С_6-10арила, гетероарила, содержащего от 5 до 10 членов, и гетероциклила, содержащего от 3 до 10 членов, определение которых дано выше.

"С-амидной" группой называется группа "-C(=О)NR_AR_B", в которой каждый из R_A и R_B независимо выбран из водорода, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкинила, С_3-7карбоциклила, С_6-10арила, гетероарила, содержащего от 5 до 10 членов, и гетероциклила, содержащего от 3 до 10 членов, определение которых дано выше.

"N-амидной" группой называется группа "-N(R_A)C(=O)R_B", в которой каждый из R_A и R_B независимо выбран из водорода, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкинила, С_3-7карбоциклила, С_6-10арила, гетероарила, содержащего от 5 до 10 членов, и гетероциклила, содержащего от 3 до 10 членов, определение которых дано выше.

"Аминогруппой" называется группа "-NR_AR_B", в которой каждый из R_A и R_B независимо выбран из водорода, С_1-6алкила, С_2-6алкенила, С_2-6алкинила, С_3-7карбоциклила, С_6-10арила, гетероарила, содержащего от 5 до 10 членов, и гетероциклила, содержащего от 3 до 10 членов, определение которых дано выше. Неограничивающий пример такой группы включает свободную аминогруппу (т.е. -NH₂).

"Аминоалкильной" группой называется аминогруппа, присоединенная через алкиленовую группу.

"Алкоксиалкильной" группой называется алкоксигруппа, присоединенная через алкиленовую группу, такая как "С_2-8алкоксиалкильная" и подобные группы.

В контексте данного документа термин "замещенная группа" означает группу, полученную из незамещенной исходной группы, в которой один или более атомов водорода были заменены другим атомом или группой. Если не указано иное, если группу называют "замещенной", то это означает, что группа имеет один или более заместителей, независимо выбранных из С₁-С₆ алкила, С₁-С₆ алкенила, С₁-С₆ алкинила, С₁-С₆ гетероалкила, С₃-С₇ карбоциклила (факультативно замещенного галогеном, С₁-С₆ алкилом, С₁-С₆ алкокси, С₁-С₆ галогеналкилом и С₁-С₆ галогеналкокси), С₃-С₇-карбоциклил-С₁-С₆-алкила (факультативно замещенного галогеном, С₁-С₆ алкилом, С₁-С₆ алкокси, С₁-С₆ галогеналкилом и С₁-С₆ галогеналкокси), содержащего от 3 до 10 членов гетероциклила (факультативно замещенного галогеном, С₁-С₆ алкилом, С₁-С₆ алкокси, С₁-С₆ галогеналкилом и С₁-С₆ галогеналкокси), содержащего от 3 до 10 членов гетероциклил-С₁-С₆-алкила (факультативно замещенного галогеном, С₁-С₆ алкилом, С₁-С₆ алкокси, С₁-С₆ галогеналкилом и С₁-С₆ галогеналкокси), арила (факультативно замещенного галогеном, С₁-С₆ алкилом, С₁-С₆ алкокси, С₁-С₆ галогеналкилом и С₁-С₆ галогеналкокси), арил(С₁-С₆)алкила (факультативно замещенного галогеном, С₁-С₆ алкилом, С₁-С₆ алкокси, С₁-С₆ галогеналкилом и С₁-С₆ галогеналкокси), содержащего от 5 до 10 членов гетероарила (факультативно замещенного галогеном, С₁-С₆ алкилом, С₁-С₆ алкокси, С₁-С₆ галогеналкилом и С₁-С₆ галогеналкокси), содержащего от 5 до 10 членов гетероарил(С₁-С₆)алкила (факультативно замещенного галогеном, C₁-C₆ алкилом, С₁-С₆ алкокси, С₁-С₆ галогеналкилом и С₁-С₆ галогеналкокси), галогена, -CN, гидрокси, С₁-С₆алкокси, С₁-С₆алкокси(С₁-С₆)алкила (т.е. простого эфира), арилокси, сульфгидрила (меркапто), галоген(С₁-С₆)алкила (например, -CF₃), галоген(С₁-С₆)алкокси (например, -OCF₃), С₁-С₆алкилтио, арилтио, амино, амино(С₁-С₆)алкила, нитро, О-карбамила, N-карбамила, О-тиокарбамила, N-тиокарбамила, С-амидо, N-амидо, S-сульфонамидо, N-сульфонамидо, С-карбокси, О-карбокси, ацила, цианато, изоцианато, тиоцианато, изотиоцианато, сульфинила, сульфонила, -SO₃H, сульфино, -OSO₂C_1-4алкила и оксо (=О). Если группа определена как "факультативно замещенная", то группа может быть замещена указанными выше заместителями.

В некоторых вариантах осуществления замещенные алкильные, алкенильные или алкинильные группы замещены одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, -CN, SO₃^-, SR^a, OR^a, NR^bR^c, оксо, CONR^bR^c, COOH и COOR^b, где каждый из R^a, R^b и R^c независимо выбран из Н, алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила.

Соединения, рассмотренные в данном документе, могут быть представлены в виде различных мезомерных форм. Если изображена единственная структура, то она предполагает включение любых соответствующих мезомерных форм. Кумариновые соединения, рассмотренные в настоящей работе, представлены одной структурой, но равным образом могут быть представлены в виде любой из соответствующих мезомерных форм. Примеры мезомерных структур Формулы (I) показаны ниже:

Каждый из примеров, в которых показана единственная мезомерная форма соединения, рассмотренного в настоящей работе, включает альтернативные мезомерные формы.

Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что соединения, рассмотренные в настоящей работе, могут существовать в ионизированной форме, например, в виде -CO₂^- или -SO₃^-. Если соединение содержит положительно или отрицательно заряженную замещающую группу, например, SO₃^-, оно также может содержать отрицательно или положительно заряженный противоион, в результате чего соединение в целом является нейтральным. В других аспектах соединение может существовать в виде соли, в которой противоион предоставляет сопряженная кислота или основание.

Следует понимать, что в зависимости от контекста некоторые общепринятые правила наименования радикалов могут включать употребление наименования либо монорадикала, либо дирадикала. Например, если для присоединения заместителя к остальной молекуле требуется две точки присоединения, то следует понимать, что заместитель представляет собой дирадикал. Например, заместитель, обозначенный как алкил, для которого требуется две точки присоединения, включает дирадикалы, такие как -СН₂- -СН₂СН₂- -СН₂СН(СН₃)СН₂- и подобные радикалы. Другие правила наименования радикалов ясно указывают, что радикал представляет собой дирадикал, такой как "алкилен" или "алкенилен".

Если говорят, что две "соседних" группы R образуют цикл "совместно с атомом, к которому они присоединены", то это означает, что составная единица, образованная атомами, находящимися между ними связями и двумя группами R, представляет собой указанный цикл. Например, если присутствует следующая субструктура

и R¹ и R² определены как выбранные из группы, состоящей из водорода и алкила, или R¹ и R² совместно с атомом, к которому они присоединены, образуют арил или карбоциклил, это означает, что R¹ и R² могут быть выбраны из водорода или алкила, или в альтернативном варианте субструктура имеет следующее строение:

где А представляет собой арильный цикл или карбоциклил, содержащий изображенную двойную связь.

Меченые нуклеотиды

Один из аспектов изобретения относится к соединениям-красителям, подходящим для присоединения к частицам субстрата, в частности, включающим линкерные группы, обеспечивающие присоединение к частицам субстрата. Фрагменты субстрата практически могут представлять собой любую молекулу или вещество, с которым могут связываться красители согласно изобретению, и их неограничивающие примеры могут включать нуклеозиды, нуклеотиды, полинуклеотиды, углеводы, лиганды, частицы, твердые поверхности, органические и неорганические полимеры, хромосомы, ядра, живые клетки, а также комбинации или сборки перечисленных частиц. Красители могут образовывать конъюгаты с помощью факультативного линкера в соответствии с различными механизмами, которые включают гидрофобное взаимодействие, ионное взаимодействие и ковалентное присоединение. В некоторых аспектах красители образуют конъюгат с субстратом посредством ковалентного присоединения. В частности, ковалентное присоединение происходит с помощью линкерной группы. В некоторых примерах такие меченые нуклеотиды также называются "модифицированными нуклеотидами".

Настоящее изобретение также относится к конъюгатам нуклеозидов и нуклеотидов, меченных одним или более красителями согласно изобретению (к модифицированным нуклеотидам). Меченые нуклеозиды и нуклеотиды применяют для введения метки в полинуклеотиды, получаемые ферментативным синтезом, неограничивающие примеры которого включают ПЦР амплификацию, изотермическую амплификацию, твердофазную амплификацию, секвенирование полинуклеотидов (например, твердофазное секвенирование), реакции ник-трансляции и подобными способами.

Присоединение к биомолекулам может происходить через группы R, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ или положение X соединения, имеющего Формулу (I). В некоторых аспектах соединение происходит через группу R³ или R⁵ Формулы (I). Для соединения, имеющего Формулу (II), присоединение может происходить по любому положению R^6-11 или X'. В некоторых примерах осуществления замещающая группа представляет собой замещенный алкил, например, алкил, замещенный -CO₂H, или активированную форму карбоксильной группы, например, амид или сложный эфир, которая может быть применена для присоединения к аминогруппе или гидроксильной группе биомолекул. В одном из примеров осуществления R, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ или группа X, обозначенные в Формуле (I), или R^6-11 или группы X', обозначенные в Формуле (II), могут содержать активированный сложноэфирный или амидный остаток, наиболее подходящий для дальнейшего образования амидной/пептидной связи. Употребляемый в настоящем описании термин "активированный сложный эфир" относится к производному карбоксильной группы, которое может реагировать в мягких условиях, например, с соединением, содержащим аминогруппу. Неограничивающие примеры активированных сложных эфиров включают, без ограничений, сложные эфиры пара-нитрофенила, пентафторфенила и сукцинимида.

В некоторых примерах осуществления соединения-красители могут быть ковалентно присоединены к олигонуклеотидам или нуклеотидам через нуклеотидное основание. Например, меченый нуклеотид или олигонуклеотид может иметь метку, присоединенную к С5 положению пиримидинового основания или С7 положению 7-деазапуринового основания через линкерный фрагмент. Меченый нуклеотид или олигонуклеотид также может иметь 3'-ОН блокирующую группу, ковалентно присоединенную к рибозному или дезоксирибозному сахару нуклеотида.

Особенно полезным применением новых флуоресцентных красителей, рассмотренных в настоящей работе, является введение метки в биомолекулы, например, нуклеотиды или олигонуклеотиды. Некоторые примеры осуществления настоящего изобретения относятся к нуклеотиду или олигонуклеотиду, меченному новыми флуоресцентными соединениями, рассмотренными в настоящей работе.

Линкеры

Соединения-красители, рассмотренные в настоящей работе, могут включать реакционноспособную линкерную группу в одном из положений для заместителей, подходящую для ковалентного присоединения соединения к субстрату или другой молекуле. Реакционноспособные соединительные группы представляют собой фрагменты, способные образовывать связь (например, ковалентную или нековалентную связь), в частности, ковалентную связь. В одном из конкретных примеров осуществления линкер может представлять собой отщепляемый линкер. Употребление термина "отщепляемый линкер" не предполагает того, что должен быть удален полностью весь линкер. Сайт отщепления может располагаться на линкере в таком положении, которое позволяет части линкера оставаться присоединенной к красителю и/или частице субстрата после отщепления. Неограничивающие примеры отщепляемых линкеров могут представлять собой электрофильно отщепляемые линкеры, нуклеофильно отщепляемые линкеры, фотоотщепляемые линкеры, линкеры, отщепляемые в восстанавливающей среде (например, линкеры, содержащие дисульфид или азид), линкеры, отщепляемые в окислительной среде, линкеры, отщепляемые с помощью предохранительного механизма, и линкеры, отщепляемые в соответствии с механизмом удаления. Применение отщепляемого линкера для присоединения соединения-красителя к частице субстрата обеспечивает возможность, при необходимости, удаления метки после обнаружения, что исключает появление мешающего сигнала при проведении последующих этапов.

Подходящие линкерные группы указаны в заявке РСТ WO 2004/018493 (включенной в настоящее описание посредством ссылки), и их примеры включают линкеры, которые могут быть отщеплены под действием водорастворимых фосфинов или водорастворимых катализаторов на основе переходных металлов, полученных из переходного металла и по меньшей мере частично водорастворимых лигандов. В водном растворе последние образуют по меньшей мере частично растворимые в воде комплексы переходных металлов. Такие отщепляемые линкеры могут быть применены для присоединения оснований нуклеотидов к меткам, таким как красители согласно изобретению.

Конкретные линкеры включают линкеры, рассмотренные в заявке РСТ WO 2004/018493 (включенной в настоящее описание посредством ссылки), такие как линкеры, включающие фрагменты, имеющие представленные формулы:

(где X выбран из группы, включающей О, S, NH и NQ, где Q представляет собой С₁-С₁₀ замещенную или незамещенную алкильную группу, Y выбран из группы, включающей О, S, NH и N(аллил), Т представляет собой водород или С₁-С₁₀ замещенную или незамещенную алкильную группу, и знаком * обозначена точка прикрепления частицы к остатку нуклеотида или нуклеозида). В некоторых аспектах линкеры соединяют основания нуклеотидов с метками, такими как, например, соединения-красители согласно настоящему изобретению.

В конкретных вариантах осуществления длина линкера между флуоресцентным красителем (флуорофором) и гуаниновым основанием может быть изменена, например, введением спейсерной группы полиэтиленгликоля, что позволяет повысить интенсивность флуоресценции по сравнению с интенсивностью того же флуорофора, присоединенного к гуаниновому основанию через другие линкерные группы, известные в данной области техники. Примеры линкеров и их свойства рассмотрены в заявке РСТ WO 2007/020457 (которая включена в настоящее описание посредством ссылки). Конструкция линкеров и, в частности, их увеличенная длина может повышать яркость флуорофоров, присоединенных к гуаниновым основаниям гуанозиновых нуклеотидов при их встраивании в полинуклеотиды, такие как ДНК. Таким образом, если краситель предназначен для применения в любом из способов анализа, в которых требуется обнаружение флуоресцентной метки-красителя, присоединенной к гуанинсодержащему нуклеотиду, то предпочтительно, если линкер включает спейсерную группу, имеющую формулу -((СН₂)₂О)_n-, где n - целое число, составляющее от 2 до 50, рассмотренную в документе WO 2007/020457.

Метка может быть введена в нуклеозиды и нуклеотиды на участки сахара или нуклеотидного основания. Как известно в данной области техники, "нуклеотид" состоит из азотистого основания, сахара и одной или более фосфатных групп. В РНК сахар представляет собой рибозу, и в ДНК сахар представляет собой дезоксирибозу, т.е. сахар, не имеющий гидроксильной группы, которая имеется в рибозе. Азотистое основание представляет собой производное пурина или пиримидина. Пурины включают аденин (А) и гуанин (G), и пиримидины включают цитозин (С) и тимин (Т) или в контексте РНК урацил (U). Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидина или N-9 пурина. Нуклеотид также представляет собой сложный фосфатный эфир нуклеозида, полученный в результате этерификации гидроксильной группы, присоединенной к С-3 или С-5 сахара. Нуклеотиды обычно представляют собой моно, ди- или трифосфаты.

"Нуклеозид" структурно аналогичен нуклеотиду, но не содержит фосфатных фрагментов. Один из примеров нуклеозидного аналога представляет собой нуклеозид, в котором метка соединен с основанием, и к молекуле сахара не присоединены фосфатные группы.

Несмотря на то, что в качестве основания обычно называют пурин или пиримидин, специалисту должно быть понятно, что могут быть применены производные и аналоги, которые не влияют на способность нуклеотида или нуклеозида подвергаться спариванию оснований по Уотсону-Крику. "Производное" или "аналог" означает соединение или молекулу, имеющую такую же структуру основной части, что и соединение-предшественник, или схожую с ним структуру, но включающую химическую или физическую модификацию, такую как, например, отличающуюся или дополнительную боковую группу, которая позволяет производному нуклеотида или нуклеозида связываться с другой молекулой. Например, основание может представлять собой деазапурин. В конкретных примерах осуществления производные должны быть способны к спариванию оснований по Уотсону-Крику. "Производное" и "аналог" также включают, например, синтетическое производное нуклеотида или нуклеозида, имеющее модифицированные фрагменты основания и/или модифицированные фрагменты сахара. Такие производные и аналоги рассмотрены, например, в публикациях Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) и Uhlman с соавт., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Аналоги нуклеотидов также могут включать модифицированные сложные фосфодиэфирные связи, включающие фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, алкилфосфонатные, фосфоранилидатные, фосфорамидатные связи и подобные связи.

Краситель может быть присоединен к любому положению нуклеотидного основания, например, через линкер. В конкретных примерах осуществления получаемый аналог все еще может участвовать в спаривании оснований по Уотсону-Крику. Конкретные сайты для введения метки в нуклеотидное основание включают С5 положение пиримидинового основания или С7 положение 7-деазапуринового основания. Как было указано выше, для ковалентного присоединения красителя к нуклеозиду или нуклеотиду может быть применена линкерная группа.

В конкретных вариантах осуществления меченый нуклеозид или нуклеотид может подвергаться ферментативному встраиванию и ферментативному удлинению. Соответственно, линкерный фрагмент может иметь достаточную длину для связывания нуклеотида с соединением, и при этом соединение не оказывает значительного влияния на общее связывание и распознавание нуклеотида ферментом, применяемым для репликации нуклеиновой кислоты. Таким образом, линкер также может включать спейсерную группу. Спейсер позволяет разнести в пространстве, например, нуклеотидное основание и сайт отщепления или метку.

Нуклеозиды или нуклеотиды, меченные красителями, рассмотренными в настоящей работе, могут иметь следующую формулу:

где

Dye представляет собой соединение-краситель,

В представляет собой нуклеотидное основание, такое как, например, урацил, тимин, цитозин, аденин, гуанин и подобные основания,

L представляет собой необязательную линкерную группу, которая может присутствовать или отсутствовать,

R' может представлять собой Н, монофосфат, дифосфат, трифосфат, тиофосфат, сложный фосфатоэфирный аналог, -О- присоединен к реакционноспособной фосфорсодержащей группе, или -О- защищен блокирующей группой,

R'' может представлять собой Н, ОН, фосфорамидит или 3'-ОН блокирующую группу, и

R''' представляет собой Н или ОН.

Если R'' представляет собой фосфорамидит, то R' представляет собой отщепляемую под действием кислоты группу, защищающую гидроксил, которая позволяет производить последующее присоединение мономера в условиях автоматизированного синтеза.

В одном из конкретных примеров осуществления блокирующая группа отделена и не зависит от соединения-красителя, т.е. не присоединена к нему. В альтернативном примере краситель может включать всю или часть 3'-ОН блокирующей группы. Таким образом, R'' может представлять собой 3'-ОН блокирующую группу, которая может включать или может не включать соединение-краситель.

В другом альтернативном примере осуществления блокирующая группа на 3' углероде пентозного сахара отсутствует, и краситель (или конструкция краситель-линкер), присоединенный к основанию, например, может иметь достаточный размер или структуру для препятствования встраиванию следующего нуклеотида. Таким образом, препятствие может быть образовано благодаря стерическим затруднениям или благодаря комбинации размера, заряда и структуры, независимо от того, присоединен или нет краситель к 3' положению сахара.

В другом альтернативном варианте осуществления блокирующая группа находится на 2' или 4' углероде пентозного сахара, и она может иметь размер или структуру, достаточные для блокирования встраивания следующего нуклеотида.

Применение блокирующей группы позволяет регулировать протекание полимеризации, например, останавливать достройку при встраивании модифицированного нуклеотида. Если блокирующее действие обратимо, например, в неограничивающем примере посредством изменения химических условий или посредством удаления химического блока, то достройка может быть остановлена на определенном этапе и затем продолжена.

В другом конкретном примере осуществления 3'-ОН блокирующая группа включает фрагмент, рассмотренный в документах WO 2004/018497 и WO 2014/139596, содержания которых включены в настоящее описание посредством ссылки. Например, блокирующая группа может представлять собой азидометил (-CH₂N₃) или замещенный азидометил (например, -CH(CHF₂)N₃ или CH(CH₂F)N₃) или аллил.

Один из конкретных вариантов осуществления включает присутствие как линкера (между красителем и нуклеотидом), так и блокирующей группы, которые представляют собой отдельные фрагменты. В конкретных примерах осуществления как линкер, так и блокирующая группа могут быть отщеплены в по существу схожих условиях. Это позволяет более эффективно производить снятие защиты и снятие блокировки, поскольку для удаления и соединения-красителя, и блокирующей группы требуется только один тип воздействия. Однако в некоторых примерах осуществления линкер и блокирующая группа не обязательно должны быть способны отщепляться в одинаковых условиях, а напротив, должны быть способны отщепляться по отдельности, в разных условиях.

Изобретение также относится к полинуклеотидам, в которые введены соединения-красители. Такие полинуклеотиды могут представлять собой ДНК или РНК, состоящие, соответственно, из дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, соединенных фосфодиэфирными связями. Полинуклеотиды могут включать встречающиеся в природе нуклеотиды, не встречающиеся в природе (или модифицированные) нуклеотиды, отличающиеся от меченых нуклеотидов, рассмотренных в настоящей работе, или любую комбинацию указанных нуклеотидов, в комбинации с по меньшей мере одним модифицированным нуклеотидом (например, меченным соединением-красителем) согласно изобретению. Полинуклеотиды согласно изобретению также могут включать не встречающиеся в природе связи, находящиеся в основной цепи, и/или ненуклеотидные химические модификации. Изобретение также включает химерные структуры, состоящие из смесей рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, включающих по меньшей мере один меченый нуклеотид.

Неограничивающие примеры меченых нуклеотидов согласно изобретению включают:

где Dye представляет собой краситель, L представляет собой линкер, и R представляет собой остаток сахара, описанный выше.

В некоторых примерах осуществления неограничивающие примеры конъюгатов с флуоресцентным красителем включают примеры, представленные ниже:

Наборы

Настоящее изобретение также относится к наборам, включающим модифицированные нуклеозиды и/или нуклеотиды, меченные красителями. Такие наборы обычно включают по меньшей мере один модифицированный нуклеотид или нуклеозид, меченный красителем согласно изобретению, а также по меньшей мере один дополнительный компонент. Дополнительный компонент (компоненты) может представлять собой один или более компонентов, раскрытых при описании способа согласно изобретению или ниже в разделе "Примеры". Некоторые неограничивающие примеры компонентов, которые могут быть укомплектованы в набор согласно настоящему изобретению, приведены ниже.

В одном из конкретных примеров осуществления набор может включать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид или нуклеозид, меченный красителем согласно изобретению, а также модифицированные или немодифицированные нуклеотиды или нуклеозиды. Например, модифицированные нуклеотиды, меченные красителями согласно изобретению, могут быть предоставлены в комбинации с немечеными или природными нуклеотидами и/или с флуоресцентно мечеными нуклеотидами или любой их комбинацией. Соответственно, наборы могут включать модифицированные нуклеотиды, меченные красителями согласно изобретению, и модифицированные нуклеотиды, меченные другими соединениями, например, соединениями-красителями согласно предшествующему уровню техники. Комбинации нуклеотидов могут быть предоставлены в виде отдельных индивидуальных компонентов (например, нуклеотид одного типа в одной емкости или пробирке) или в виде смесей нуклеотидов (например, два или более нуклеотида в виде смеси в одной емкости или пробирке).

Если наборы включают совокупность, в частности, два или три или, в особенности, четыре модифицированных нуклеотида, меченных соединением-красителем, то различные нуклеотиды могут иметь метки из различных соединений-красителей, или один из них может быть темным, то есть не содержать соединений-красителей. Если различные нуклеотиды имеют метки из различных соединений-красителей, особенностью наборов является то, что соединения-красители представляют собой спектрально различимые флуоресцентные красители. В контексте данного документа термин "спектрально различимые флуоресцентные красители" относится к флуоресцентным красителям, которые испускают энергию флуоресценции при длинах волн, которые могут быть различимы оборудованием для флуоресцентных определений (например, коммерческими платформами на основе капилляров для секвенирования ДНК) при наличии в одном образце двух или более таких красителей. Если в виде набора предоставлены два модифицированных нуклеотида, меченных флуоресцентными соединениями-красителями, то отличительным признаком некоторых примеров осуществления является то, что спектрально различимые флуоресцентные красители могут быть возбуждены светом одной длины волны, например, с помощью одного лазера. Если в виде набора предоставлены четыре модифицированных нуклеотида, меченные флуоресцентными соединениями-красителями, то отличительным признаком некоторых примеров осуществления является то, что два спектрально различимых флуоресцентных красителя могут быть возбуждены светом одной длины волны, и оставшиеся два спектрально различимых красителя могут быть возбуждены светом, имеющим другую определенную длину волны. Конкретные длины волн возбуждающего света составляют 488 нм и 532 нм.

В одном из вариантов осуществления набор включает модифицированный нуклеотид, меченный соединением согласно настоящему изобретению, и второй модифицированный нуклеотид, меченный вторым красителем, где разность между максимумами поглощения этих двух красителей составляет по меньшей мере 10 нм, в частности, от 20 нм до 50 нм. В частности, Стоксовы сдвиги этих двух соединений-красителей находятся в диапазоне от 15 до 40 нм; "Стоксов сдвиг" представляет собой расстояние между величинами длины волны пика поглощения и пика испускания.

В другом варианте осуществления набор может дополнительно включать два других модифицированных нуклеотида, меченных флуоресцентными красителями, причем красители возбуждаются одним и тем же лазером при длине волны 532 нм. Разность между максимумами поглощения красителей может составлять по меньшей мере 10 нм, в частности, от 20 нм до 50 нм. В частности, Стоксовы сдвиги этих двух соединений-красителей могут находиться в диапазоне от 20 до 40 нм. Конкретными красителями, которые спектрально отличимы от красителей согласно настоящему изобретению и которые отвечают приведенным выше критериям, являются аналоги полиметина, рассмотренные в патенте US 5268486 (например, Су3) или в документе WO 0226891 (Alexa 532; молекулярные зонды А20106), или несимметричные полиметины, рассмотренные в патенте US 6924372, где содержание каждого из документов включено в настоящее описание посредством ссылки. Альтернативные красители включают аналоги родамина, например, тетраметилродамин и его аналоги.

В альтернативном варианте осуществления наборы согласно изобретению могут содержать нуклеотиды, в которых одно и то же основание помечено двумя различными соединениями. Первый нуклеотид может иметь метку из соединения согласно изобретению. Второй нуклеотид может иметь метку из спектрально отличающегося соединения, например, 'зеленого' красителя, область поглощения которого лежит в диапазоне менее 600 нм. Третий нуклеотид может иметь метку из смеси соединения согласно изобретению и спектрально отличающегося соединения, и четвертый нуклеотид может быть 'темным' и не содержать меток. Проще говоря, помеченные таким образом нуклеотиды 1-4 могут быть 'синим', 'зеленым', 'синим/зеленым' и темным. Для дальнейшего упрощения оборудования, четыре нуклеотида могут иметь метки из двух красителей, возбуждаемые одним лазером, и, таким образом, нуклеотиды 1-4 могут быть помечены следующим образом: 'синий 1', 'синий 2', 'синий 1/синий 2' и темный.

Нуклеотиды могут содержать два красителя согласно настоящему изобретению. Набор может содержать два или более нуклеотида, меченных красителями согласно изобретению. Наборы могут содержать дополнительный нуклеотид, который помечен красителем, поглощающим свет в области от 520 нм до 560 нм. Наборы могут дополнительно содержать немеченый нуклеотид.

Несмотря на то что в настоящем описании рассмотрены примеры конфигураций наборов, содержащих различные нуклеотиды, меченные различными соединениями-красителями, следует понимать, что наборы могут включать 2, 3, 4 или более различных нуклеотидов, содержащих одно и то же соединение-краситель.

В конкретных примерах осуществления набор может включать полимеразный фермент, который может катализировать встраивание модифицированных нуклеотидов в полинуклеотид. Другие компоненты, которые могут быть включены в такие наборы, могут включать буферы и подобные вещества. Модифицированные нуклеотиды, меченные красителями согласно изобретению, и любые другие нуклеотидные компоненты, включающие смеси различных нуклеотидов, могут находиться в наборе в концентрированной форме, которую перед использованием следует разбавлять. В таких примерах осуществления также может быть включен подходящий буфер для разбавления. В этом случае также набор согласно настоящему изобретению может включать один или более компонентов, указанных при раскрытии способа согласно изобретению.

Способы секвенирования

Модифицированные нуклеотиды (или нуклеозиды), включающие соединение-краситель согласно настоящему изобретению, могут быть применены в любом способе анализа, таком как способ, который включает обнаружение флуоресцентной метки, присоединенной к нуклеотиду или нуклеозиду как таковому или встроенному в или связанному с более крупной молекулярной структурой или конъюгатом. В этом контексте термин "встроенный в полинуклеотид" может означать, что 5' фосфат соединен фосфодиэфирной связью с 3'-гидроксильной группой второго (модифицированного или немодифицированного) нуклеотида, который сам по себе может представлять собой часть полинуклеотидной цепочки большей длины. Конец 3' модифицированного нуклеотида согласно изобретению может быть соединен или может не быть соединен фосфодиэфирной связью с 5' фосфатом следующего (модифицированного или немодифицированного) нуклеотида. Таким образом, один из неограничивающих примеров осуществления изобретения относится к способу обнаружения модифицированного нуклеотида, встроенного в полинуклеотид, где способ включает: (а) встраивание по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида согласно изобретению в полинуклеотид и (b) обнаружение модифицированного нуклеотида (нуклеотидов), встроенного в полинуклеотид, посредством обнаружения флуоресцентного сигнала, испускаемого соединением-красителем, присоединенным к модифицированному нуклеотиду (нуклеотидам).

Этот способ может включать: стадию (а) синтеза, в которой один или более модифицированных нуклеотидов согласно изобретению встраиваются в полинуклеотид, и стадию (b) обнаружения, на которой один или более модифицированных нуклеотидов, встроенных в полинуклеотид, определяют, обнаруживая или количественно измеряя их флуоресценцию.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам секвенирования, включающим: (а) встраивание по меньшей мере одного меченого нуклеотида, рассмотренного в настоящей работе, в полинуклеотид; и (b) обнаружение меченого нуклеотида (нуклеотидов), встроенного в полинуклеотид посредством обнаружения флуоресцентного сигнала нового флуоресцентного красителя, присоединенного к этому модифицированному нуклеотиду (нуклеотидам).

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один модифицированный нуклеотид встраивается в полинуклеотид в этапе синтеза под действием полимеразного фермента. Однако могут быть применены другие способы соединения модифицированных нуклеотидов с полинуклеотидами, такие как, например, химический олигонуклеотидный синтез или лигирование (сшивание) меченых олигонуклеотидов с немечеными олигонуклеотидами. Таким образом, используемый в отношении нуклеотида и полинуклеотида термин "встраивание" может включать синтез полинуклеотида химическими способами и ферментативными способами.

В конкретном варианте осуществления выполняют этап синтеза, который может факультативно включать инкубацию матричной полинуклеотидной цепи (англ. template polynucleotide strand) с реакционной смесью, включающей флуоресцентно меченые модифицированные нуклеотиды согласно изобретению. Полимераза также может быть введена в условиях, которые допускают образование фосфодиэфирной связи между свободной 3'-гидроксильной группой, находящейся на полинуклеотидной цепи, гибридизованной (annealed) с матричной полинуклеотидной цепью, и 5'-фосфатной группой, находящейся на модифицированном нуклеотиде. Таким образом, этап синтеза может включать образование полинуклеотидной цепи, направляемое комплементарным спариванием оснований нуклеотидов с матричной цепью.

Во всех примерах осуществления способов этап обнаружения может быть выполнен в течение того периода, когда полинуклеотидная цепь, в которую встраиваются меченые нуклеотиды, гибридизуется (annealed) с матричной цепью, или после выполнения этапа денатурации, в котором выполняют разделение двух цепей. Между этапом синтеза и этапом обнаружения могут быть проведены дополнительные этапы, например, этапы, включающие химические или ферментативные реакции, или этапы очистки. В частности, целевая цепь, встраивающая меченый нуклеотид (нуклеотиды), может быть выделена или очищена и затем дополнительно обработана или использована в последующем анализе. Например, целевые полинуклеотиды, имеющие на этапе синтеза метку из модифицированного нуклеотида (нуклеотидов), рассмотренного в настоящей работе, могут быть затем применены в качестве меченых зондов или праймеров. В других примерах осуществления продукт этапа синтеза согласно изобретению может быть направлен в дополнительные реакционные этапы, и при необходимости продукт этих последующих этапов может быть очищен или выделен.

Условия, подходящие для проведения этапа синтеза, хорошо известны специалистам, знакомым со стандартными методиками молекулярной биологии. В одном из вариантов осуществления этап синтеза может быть аналогичным стандартной реакции достройки праймера с использованием нуклеотидных предшественников, включающих рассмотренные в настоящей работе модифицированные нуклеотиды, что приводит к удлинению (достройке) целевой цепи, комплементарной матричной цепи, в присутствии подходящего полимеразного фермента. В других вариантах осуществления этап синтеза сам по себе может быть частью реакции амплификации, приводящей к образованию меченого двухцепочечного продукта амплификации, состоящего из гибридизованных комплементарных цепочек, полученных при копировании целевой и матричной полинуклеотидных цепей. Другие примеры этапов синтеза включают ник-трансляцию, полимеризацию по типу вытеснения цепи, введение метки в ДНК способом случайных праймеров и т.д. Особенно подходящим полимеразным ферментом для этапа синтеза является фермент, способный катализировать встраивание модифицированных нуклеотидов согласно изобретению. Для этой цели могут быть применены различные встречающиеся в природе или модифицированные полимеразы. Например, для проведения реакции синтеза, протекающей в термоциклических условиях, может быть применена термостабильная полимераза, в то время как применение термостабильной полимеразы может быть нежелательным для проведения реакций изотермической достройки праймера. Подходящие термостабильные полимеразы, способные катализировать встраивание модифицированных нуклеотидов согласно изобретению, включают полимеразы, рассмотренные в документах WO 2005/024010 или WO 06120433, содержания которых включены в настоящее описание посредством ссылки. В реакциях синтеза, проводимых при более низких температурах, таких как 37°С, полимеразные ферменты не обязательно должны быть термостабильными полимеразами, и, таким образом, выбор полимеразы зависит от ряда факторов, таких как температура реакции, рН, активность при вытеснении цепи и подобные факторы.

Конкретные неограничивающие варианты осуществления изобретения включают способы секвенирования нуклеиновых кислот, ресеквенирования, полногеномного секвенирования, определение однонуклеотидного полиморфизма (точечного нуклеотидного полиморфизма), любое другие применение, включающее обнаружение модифицированного нуклеотида или нуклеозида, меченного красителями согласно изобретению, при встраивании в полинуклеотид. Модифицированные нуклеотиды или нуклеозиды, содержащие красители согласно изобретению, могут быть применены в различных областях, в которых может быть достигнут полезный эффект от применения полинуклеотидов, меченных модифицированными нуклеотидами, включающими флуоресцентные красители.

Один из конкретных вариантов осуществления изобретения относится к применению модифицированных нуклеотидов, включающих соединения-красители согласно изобретению, в реакции секвенирования полинуклеотидов синтезом. Секвенирование синтезом обычно включает последовательное добавление одного или более нуклеотидов или олигонуклеотидов к растущей полинуклеотидной цепочке в направлении от 5' к 3' под действием полимеразы или лигазы, приводящее к образованию достроенной полинуклеотидной цепочки, комплементарной матричной нуклеиновой кислоте, которую подвергают секвенированию. Идентификация основания, присутствующего в одном или более из добавленных нуклеотидов, может быть произведена в этапе обнаружения или "визуализации". Идентификация добавленного основания может быть произведена после каждого этапа встраивания нуклеотида. После этого последовательность матрицы может быть составлена в соответствии с традиционными правилами спаривания оснований по Уотсону-Крику. Применение модифицированных нуклеотидов, меченных красителями согласно изобретению, для определения единичного основания может быть полезно, например, при подсчете однонуклеотидных полиморфизмов, и такие реакции достройки единичного основания включены в объем настоящего изобретения.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения последовательность матричного полинуклеотида расшифровывают, определяя встраивание одного или более нуклеотидов в растущую цепь, комплементарную матричному полинуклеотиду, который подвергают секвенированию, посредством обнаружения флуоресцентной метки (меток), присоединенной к встраиваемому нуклеотиду (нуклеотидам). Секвенирование матричного полинуклеотида может быть инициировано подходящим праймером (или синтезированного в виде конструкции типа "шпилька", которая содержит праймер в виде части шпильки), и растущая цепочка достраивается поэтапно, добавлением нуклеотидов к 3' концу праймера в процессе реакции, катализируемой полимеразой.

В конкретных вариантах осуществления каждый из различных нуклеотидных трифосфатов (А, Т, G и С) может быть помечен своим индивидуальным флуорофором и также включать блокирующую группу в 3'-положении, которая предотвращает протекание неконтролируемой полимеризации. В альтернативном варианте один из четырех нуклеотидов может быть немеченым (темным). Полимеразный фермент встраивает нуклеотид в растущую цепочку, комплементарную матричному полинуклеотиду, и блокирующая группа предотвращает последующее встраивание нуклеотидов. Не встроенные нуклеотиды могут быть удалены промывкой, и флуоресцентный сигнал, получаемый от каждого встроенного нуклеотида, может быть "прочтен" подходящими оптическими средствами, такими как устройство с зарядовой связью, с применением возбуждения лазером и подходящих эмиссионных фильтров. Затем 3'-блокирующая группа и флуоресцентные соединения-красители могут быть удалены (снятие защиты) (одновременно или последовательно), и в растущую цепочку вновь может встраиваться нуклеотид. Обычно идентификацию встроенного нуклеотида проводят после каждого этап встраивания, но это не является строго необходимым. Аналогично, в патенте US 5302509 (который включен в настоящее описание посредством ссылки) рассмотрен способ секвенирования полинуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке.

В способе, пример которого рассмотрен выше, применяют встраивание меченных флуоресцентной меткой нуклеотидов A, G, С и Т, имеющих заблокированную 3'-группу, в растущую цепь, комплементарную иммобилизованному полинуклеотиду, в присутствии ДНК-полимеразы. Полимераза добавляет основание, комплементарное целевому полинуклеотиду, но последующее присоединение предотвращается 3'-блокирующей группой. Затем может быть определена метка на присоединенном нуклеотиде, и блокирующая группа может быть отщеплена химическим способом, что позволяет протекать дальнейшей полимеризации. Матричная нуклеиновая кислота, которую подвергают секвенированию в реакции секвенирования синтезом, может представлять собой любой полинуклеотид, который нужно просеквенировать. Матричная нуклеиновая кислота для реакции секвенирования обычно включает двухцепочечную область, содержащую свободную 3'-гидроксильную группу, которая служит праймером или точкой инициирования для присоединения последующих нуклеотидов в реакции секвенирования. Область матрицы, подвергаемая секвенированию, выступает за пределы этой свободной 3'-гидроксильной группы, находящейся на комплементарной цепи. Выступающая область матрицы, подвергаемой секвенированию, может быть одноцепочечной, но может быть и двухцепочечной, при условии, что на цепи, комплементарной матричной цепочке, подвергаемой секвенированию, "присутствует ник", обеспечивающий наличие свободной 3'-ОН группы, подходящей для инициирования реакции секвенирования. В таких вариантах осуществления секвенирование может быть проведено вытеснением цепи. В некоторых вариантах осуществления праймер, имеющий свободную 3'-гидроксильную группу, может быть добавлен в виде отдельного компонента (например, короткого олигонуклеотида), который гибридизуется с одноцепочечной областью матрицы, подвергаемой секвенированию. В альтернативном примере как праймер, так и матричная цепочка, которую подвергают секвенированию, может образовывать часть цепи частично самокомплементарной нуклеиновой кислоты, которая может образовывать внутримолекулярный дуплекс, такую как, например, петлевая шпилечная структура. Шпилечные полинуклеотиды и способы, которыми они могут быть присоединены к твердым подложкам, рассмотрены в заявках РСТ WO 0157248 и WO 2005/047301, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Нуклеотиды могут быть добавлены к растущему праймеру последовательно, что приводит к синтезу полинуклеотидной цепочки в направлении 5'→3'. В частности, но не обязательно, природа добавленного основания может быть определена после каждого добавления нуклеотида, и, таким образом, получают информацию о последовательности матричной нуклеиновой кислоты. Таким образом, нуклеотид вводят в цепь нуклеиновой кислоты (или полинуклеотида) присоединением нуклеотида к свободной 3'-гидроксильной группе цепочки нуклеиновой кислоты посредством образования фосфодиэфирной связи с 5'-фосфатной группой нуклеотида.

Матричная нуклеиновая кислота, подлежащая секвенированию, может представлять собой ДНК или РНК или даже гибридную молекулу, состоящую из дезоксинуклеотидов и рибонуклеотидов. Матричная нуклеиновая кислота может включать встречающиеся в природе и/или не встречающиеся в природе нуклеотиды и природные или не природные связи в основной цепи, при условии, что они не предотвращают копирование матрицы в реакции секвенирования.

В некоторых вариантах осуществления матричная нуклеиновая кислота, которую подвергают секвенированию, может быть присоединена к твердой подложке любым подходящим способом соединения, известным в данной области техники, например, посредством ковалентного присоединения. В некоторых вариантах осуществления матричные полинуклеотиды могут быть присоединены непосредственно к твердой подложке (например, к подложке на основе оксида кремния). Однако в других примерах осуществления изобретения поверхность твердой подложки может быть модифицирована способом, позволяющим непосредственно ковалентно присоединять матричные полинуклеотиды или иммобилизовать матричные полинуклеотиды с помощью гидрогеля или многослойного полиэлектролита, который, в свою очередь, может быть присоединен к твердой подложке нековалентной связью.

Массивы (также называемые биочипами, англ. array), в которых полинуклеотиды непосредственно присоединены к подложкам на основе оксида кремния, представляют собой массивы, рассмотренные, например, в документе WO 00006770 (содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки), в которых полинуклеотиды иммобилизованы на стеклянной подложке в результате реакции между боковыми эпоксидными группами стекла и внутренними аминогруппами полинуклеотида. Кроме того, полинуклеотиды могут быть присоединены к твердой подложке в результате реакции нуклеофила на основе серы с твердой подложкой, например, как рассмотрено в документе WO 2005/047301 (содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки). В другом примере иммобилизованных на твердой подложке матричных полинуклеотидов матричные полинуклеотиды присоединены к гидрогелю, находящемуся на подложке, изготовленной на основе оксида кремния, или на других твердых подложках, например, рассмотренных в документах WO 00/31148, WO 01/01143, WO 02/12566, WO 03/014392, патенте US 6465178 и WO 00/53812, где содержание каждого из цитируемых документов включено в настоящее описание посредством ссылки.

Конкретным примером поверхности, на которой могут быть иммобилизованы матричные полинуклеотиды, является полиакриламидный гидрогель. Полиакриламидные гидрогели рассмотрены в цитируемых выше документах и в документе WO 2005/065814, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Конкретные примеры гидрогелей, которые могут быть применены, включают гидрогели, рассмотренные в патентных документах WO 2005/065814 и US 2014/0079923. В одном из примеров осуществления гидрогель представляет собой PAZAM (сокр. от англ. poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl) acrylamide-co-acrylamide, т.е. сополимер (N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида с акриламидом)).

Молекулы матричной ДНК могут быть присоединены к гранулам (англ. bead) или микрочастицам, например, как рассмотрено в патенте US 6172218 (содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки). Присоединение к гранулам или микрочастицам может быть полезным в способах секвенирования. Могут быть созданы библиотеки гранул, в которых каждая гранула содержит различные последовательности ДНК. Примеры библиотек и способов их создания рассмотрены в публикациях Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005), содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Секвенирование массивов таких гранул с применением нуклеотидов согласно изобретению включено в объем настоящего изобретения.

Подвергаемая секвенированию матрица (матрицы), может быть частью "массива" на твердой подложке, и в этом случае массив может принимать любую подходящую форму. Таким образом, способ согласно изобретению применим ко всем типам массивов высокой плотности, включающим одномолекулярные массивы, массивы кластеров и массивы гранул. Модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями-красителями согласно настоящему изобретению, могут быть применены для секвенирования матриц по существу на массиве любого типа, примеры которых включают, без ограничений, массивы, полученные иммобилизацией молекул нуклеиновых кислот на твердой подложке.

Однако модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями-красителями согласно изобретению, особенно подходят для секвенирования кластерных массивов. В кластерных массивах определенные области массива (обычно называемые сайтами или элементами) включают множество матричных молекул полинуклеотида. Обычно для множества матричных молекул полинуклеотида индивидуальное определение оптическими средствами невозможно, и вследствие этого их определяют в виде совокупности (ансамбля, англ. ensemble). В зависимости от принципа формирования массива, каждый сайт массива может включать множество копий одной индивидуальной полинуклеотидной молекулы (например, сайт однороден по отношению к определенному виду одно- или двухцепочечной нуклеиновой кислоты) или даже множество копий небольшого количества различных полинуклеотидных молекул (например, множество копий двух различных нуклеиновых кислот). Кластерные массивы молекул нуклеиновых кислот могут быть получены с помощью методик, известных в данной области техники. Например, в документах WO 98/44151 и WO 00/18957, содержание каждого из которых включено в настоящее описание, рассмотрены способы амплификации нуклеиновых кислот, в которых и матрица, и продукты амплификации остаются иммобилизованными на твердой подложке, в результате чего образуются массивы, состоящие из кластеров или "колоний" иммобилизованных молекул нуклеиновых кислот. Молекулы нуклеиновых кислот, находящиеся на кластерных массивах, получаемых такими способами, представляют собой матрицы, подходящие для секвенирования с применением модифицированных нуклеотидов, меченных соединениями-красителями согласно изобретению.

Модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями-красителями согласно настоящему изобретению, также пригодны для секвенирования матриц на одномолекулярных массивах. Употребляемый в настоящем описании термин "одномолекулярный массив" или "ОММ" относится к популяции полинуклеотидных молекул, распределенных (или расположенных) по твердой подложке, где расстояние от любого индивидуального полинуклеотида до всех других единиц популяции таково, что позволяет индивидуально различать отдельные молекулы полинуклеотидов. В некоторых примерах осуществления это позволяет различать целевые молекулы нуклеиновых кислот, иммобилизованные на поверхности твердой подложки, оптическими средствами. Это означает, что один или более отчетливых сигналов, каждый из которых соответствует одному полинуклеотиду, проявляются в области разрешения конкретного применяемого устройства для визуализации.

Обнаружение единичной молекулы может быть осуществлено в тех случаях, когда расстояние между соседними молекулами полинуклеотидов в массиве составляет по меньшей мере 100 нм, в частности, по меньшей мере 250 нм, предпочтительно по меньшей мере 300 нм, более предпочтительно по меньшей мере 350 нм. Таким образом, каждую молекулу можно индивидуально обнаружить и определить в виде точки флуоресценции одной молекулы, и, кроме того, флуоресценция от каждой такой точки флуоресценции одной молекулы также имеет один этап фотообесцвечивания.

В контексте данного документа термины "индивидуально разрешенный (различимый)" и "индивидуальное разрешение" применяются для указания того, что при визуализации можно отличить одну молекулу, находящуюся в массиве, от соседних молекул. Различение индивидуальных молекул массива частично определяется выбранной методикой, применяемой для различения индивидуальных молекул. В целом, элементы одномолекулярных массивов рассмотрены в опубликованных патентных заявках WO 00/06770 и WO 01/57248, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Несмотря на то, что одним из видов применения модифицированных нуклеотидов согласно изобретению являются реакции секвенирования синтезом, применимость модифицированных нуклеотидов не ограничена только этими способами. Действительно, нуклеотиды могут быть с успехом применены в любых методиках секвенирования, в которых требуется обнаружение флуоресцентных меток, присоединенных к нуклеотидам, встроенным в полинуклеотид.

В частности, модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями-красителями согласно изобретению, могут быть применены в протоколах автоматизированного флуоресцентного секвенирования, в частности, в цикле секвенирования с использованием флуоресцентного красителя-терминатора, основанного на способе секвенирования с обрывом цепи, созданном Сэнгером и соавт. В таких способах обычно применяют ферменты и циклическое секвенирование, в котором встраивание флуоресцентно меченых дидезоксинуклеотидов происходит при протекании реакции секвенирования с достройкой праймера. В так называемых способах секвенирования по Сэнгеру и родственных им протоколах (Сэнгеровского типа) применяют рандомизованный обрыв цепи с помощью меченых дидезоксинуклеотидов.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к модифицированным нуклеотидам, меченным соединениями-красителями, которые представляют собой дидезоксинуклеотиды, не содержащие гидроксильных групп ни в 3', ни в 2' положениях; такие модифицированные дидезоксинуклеотиды подходят для применения в способах секвенирования Сэнгеровского типа и подобных способах.

Следует понимать, что модифицированные нуклеотиды, меченные соединениями-красителями согласно настоящему изобретению, включающие 3'-блокирующие группы, также могут быть применены в способах Сэнгера и подобных протоколах, поскольку эффект, достигаемый при использовании модифицированных дидезоксинуклеотидов, может быть достигнут применением модифицированных нуклеотидов, содержащих группы, блокирующие 3'-ОН группу: и первые, и последние из названных предотвращают встраивание последующих нуклеотидов. Если нуклеотиды согласно настоящему изобретению, также имеющие 3'-блокирующую группу, применяют способах секвенирования по Сэнгеру, то следует понимать, что соединения-красители или обнаруживаемые метки, присоединенные к нуклеотидам, не обязательно должны быть присоединены посредством отщепляемых линкеров, поскольку в каждом примере встраивания меченого нуклеотида согласно изобретению после этого встраивания последующее присоединение нуклеотидов не обязательно должно происходить, и, таким образом, метку не нужно удалять с нуклеотида.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В приведенных ниже примерах более подробно рассмотрены дополнительные примеры осуществления изобретения, которые не ограничивают объем, определяемый пунктами формулы изобретения.

В Таблице 1 приведены спектральные свойства новых кумариновых флуоресцентных красителей, рассмотренных в примерах. В Таблице 2 приведены структуры и спектральные свойства различных нуклеотидов, меченных новыми красителями, рассмотренными в настоящей работе.

Пример 1-1-1

7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин

3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-производное кумарина (FC-1, 0,4 г, 1,345 ммоль, 1 экв.) и 6-аминогексановую кислоту (АС-С5, 0,25 г, 1,906 ммоль, 1,417 экв.) добавляли к безводному диметилсульфоксиду (сокр. DMSO (от англ. dimethyl sulfoxide), 3 мл). По завершении добавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, и затем к этой смеси добавляли N,N-диизопропил-N-этиламин (сокращенно DIPEA (от англ. N,N-diisopropyl-N-ethylamine), 0,25 г, 2 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при 120°С. Оставляли при комнатной температуре в течение 1 часа, желтую полутвердую реакционную смесь разбавляли водой (5 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрованием с отсасыванием. Выход: 0,36 г (65,5%). MS (DUIS): MW Вычислено: 408,47. Найдено: m/z: (+) 409 (М+1)⁺; (-), 407 (М-1)^-.¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ: 12,03 (m, 2Н), 9,00 (s, 1Н), 8,12 (d, J=7,9 Гц, 1Н), 7,99 (d, J=8,1 Гц, 1Н), 6,73 (dd, J=8,8, 2,1 Гц, 1H),6,54(d, J=2,0 Гц, 1Н), 3,18 (q, J=6,5 Гц, 2Н), 2,23 (t, J=7,3 Гц, 2Н), 1,57 (dp, J=14,7, 7,2 Гц, 4Н), 1,39 (dq, J=9,2, 4,5, 3,5 Гц, 2Н).

Пример 1-1-2

7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(бензимидазол-2-ил)кумарин

3-(Бензимидазол-2-ил)-7-фторкумарин (FC-2, 0,28 г, 1 ммоль, 1 экв.) и 6-аминогексановую кислоту (АС-С5, 0,13 г, 1 ммоль, 1 экв.) добавляли к безводному диметилсульфоксиду (DMSO, 2 мл). Полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре и затем добавляли DIPEA (0,25 г, 2 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при температуре 130°С. К реакционной смеси добавляли дополнительные порции 6-аминогексановой кислоты (АС-1, 0,13 г, 1 ммоль, 1 экв.) и DIPEA (0,26 г, 2 ммоль, 2 экв.), и нагревание при 130°С продолжали в течение 5 часов. Оставляли при комнатной температуре в течение 1 часа, бледно-желтую реакционную смесь разбавляли водой (5 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрованием с отсасыванием. Выход: 0,26 г (68,5%). Чистоту, структуру и состав продукта подтверждали способами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХМС (жидкостной хроматомасс-спектрометрией). MS (DUIS): MW Вычислено: 391,15. Найдено: m/z: (+) 392 (М+1)⁺; (-) 390 (М-1)^-, 781 (2М-1)^-.

Пример 1-1-3

7-(2-Карбоксиэтил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин

Стадия А: 7-[2-(трет-Бутилоксикарбонил)этил]амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин

3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (FC-1, 0,3 г, 1,01 ммоль, 1 экв.) и гидрохлорид трет-бутил-3-аминопропионата (АС-С2, 0,2 г, 1,1 ммоль, 1,09 экв.) добавляли к безводному диметилсульфоксиду (DMSO, 2 мл), полученную смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре, и затем добавляли DIPEA (0,26 г, 2 ммоль, 2 экв.). Полученную смесь перемешивали в течение 2 часов при 100°С. После выдерживание при комнатной температуре в течение 1 часа, желтую реакционную смесь разбавляли водой (7 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрованием с отсасыванием. Выход: 0,38 г (69%). MS (DUIS): MW Вычислено: 422,13. Найдено: m/z: (+) 423 (М+1)⁺; (-), 421 (М-1)^-.¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ: 9,28 (s, 1Н), 9,01 (s, 1Н), 8,27 - 8,16 (m, 1Н), 8,10 (tt, J=8,3, 0,9 Гц, 2Н), 8,05 - 7,92 (m, 1Н), 7,72 (d, J=8,8 Гц, 1Н), 7,66-7,55 (m, 1Н), 7,51 (dddd, J=11,4, 8,2, 7,1, 1,3 Гц, 2Н), 7,46-7,32 (m, 2Н), 6,74 (dd, J=8,7, 2,1 Гц, 1Н), 6,58 (d, J=2,1 Гц, 1Н), 3,41 (q, J=6,3 Гц, 2Н), 2,55 (t, J=6,4 Гц, 2Н), 1,41 (s, 9Н).

Стадия В

Раствор 7-[2-(трет-бутилоксикарбонил)этил]амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарина (I-1-3tBu, 0,2 г, 0,473 ммоль) в безводном дихлорметане (сокращенно DCM, от англ. dichloromethane, 20 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (0,5 мл), и полученную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Растворители отгоняли, и остаток растирали с водой (10 мл). Полученный осадок собирали фильтрованием с отсасыванием. Выход: 0,15 г (86%). Чистоту, структуру и состав подтверждали способами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХМС. MS (DUIS): MW Вычислено: 366,39. Найдено: m/z: (+) 367 (М+1)⁺; (-), 365 (М-1)^-.

Пример 1-1-4

7-(3-Карбоксипропил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин

Стадия А: 7-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин

3-(Бензотиазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (FC-1, 0,6 г, 2,02 ммоль, 1 экв.) и гидрохлорид трет-бутил-4-аминобутаноата (АС-С3, 0,5 г, 2,56 ммоль, 1,27 экв.) добавляли к безводному диметилсульфоксиду (DMSO, 5 мл). По завершении добавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре и затем добавляли DIPEA (0,65 г, 5 ммоль, 4 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при температуре 100°С. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа желтую полутвердую реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и оставляли при перемешивании в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрованием с отсасыванием. Выход: 0,7 г (79%). Чистоту, структуру и состав подтверждали способами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХМС. MS (DUIS): MW Вычислено: 436,53. Найдено: m/z: (+) 437 (М+1)⁺; (-), 435 (М-1)^-.

Стадия В

Раствор 7-[3-(трет-бутилоксикарбонил)пропил]амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарина (I-1-4tBu, 0,7 г, 1,604 ммоль) в безводном дихлорметане (25 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (1 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Растворители отгоняли, и остаток растирали с водой (10 мл). Полученный осадок собирали фильтрованием с отсасыванием. Выход: 0,59 г (97%). Чистоту, структуру и состав подтверждали способами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХМС. MS (DUIS): MW Вычислено: 36639. Найдено: m/z: (+) 381 (М+1)⁺; (-), 379 (М-1)^-.¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ: 12,17 (s, 1Н), 9,01 (s, 1Н), 8,12 (d, J=8,0 Гц, 1Н), 7,99 (d, J=8,1 Гц, 1Н), 7,71 (d, J=8,8 Гц, 1Н), 7,48-7,30 (m, 2Н), 6,73 (dd, J=8,8, 2,1 Гц, 1Н), 6,57 (d, J=2,1 Гц, 1Н), 3,21 (q, J=6,6 Гц, 2Н), 2,36 (d, J=7,3 Гц, 2Н), 1,80 (р, J=7,3 Гц, 2Н).

Пример 1-1-5

7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(5-хлор-бензоксазол-2-ил)кумарин

3-(5-Хлор-бензоксазол-2-ил)-7-фтор-кумарин (FC-3, 0,32 г, 1 ммоль, 1 экв.) и 6-аминогексановую кислоту (АС-С5, 0,26 г, 2 ммоль, 2 экв.) добавляли к безводному диметилсульфоксиду (DMSO, 5 мл) в круглодонной колбе. По завершении добавления смесь перемешивали в течение нескольких минут при комнатной температуре и затем добавляли DIPEA (0,52 г, 4 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 7 часов при температуре 135°С. Добавляли дополнительные порции 6-аминогексановой кислоты (АС-1, 0,13 г, 1 ммоль, 1 экв.) и DIPEA (0,26 г, 2 ммоль, 2 экв.), и нагревание продолжали при 135°С в течение 5 часов. После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа бледно-желтую реакционную смесь разбавляли водой (15 мл) и перемешивали в течение ночи. Полученный осадок собирали фильтрованием с отсасыванием. Выход: 0,09 г (21%). Чистоту, структуру и состав продукта подтверждали способами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХМС. MS (DUIS): MW Вычислено: 426,10. Найдено: m/z: (+) 427 (М+1)⁺; (-) 425 (М-1)^-, 851 (2М-1)^-.

Пример 2

7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин-6-сульфоновая кислота (2А) и 7-(5-Карбоксипентил)амино-3-(бензотиазол-2-ил)кумарин-8-сульфоновая кислота (2В)

Соединение I-1-1 (0,1 г, 0,245 ммоль) добавляли небольшими порциями при перемешивании к 20% дымящей серной кислоты (1 мл), которую охлаждали на бане сухой лед/ацетон. По завершении добавления смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°С, нагревали до комнатной температуры и затем перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Раствор выливали в безводный эфир (25 мл). Оставляли при комнатной температуре в течение 1 часа, полученный осадок собирали фильтрованием с отсасыванием. Выход: 78 мг (65%).¹Н ЯМР (d₆-DMSO) показал присутствие соединения 2А с небольшим количеством (~ 4%) соединения 2В.

Пример 2А, Натриевая соль: Полученный выше осадок повторно суспендировали в воде (2 мл), и рН суспензии доводили до ~ 5 добавлением 5М раствора NaOH. Полученную смесь выливали в 10 мл метанола, и суспензию фильтровали. Фильтрат испаряли досуха, получая краситель в виде натриевой соли (l-2A-Na). Чистоту, структуру и состав подтверждали способами ВЭЖХ, ЯМР и ЖХМС. MS (DUIS): MW Вычислено: 488,07. Найдено: m/z: (+) 489 (М+1)⁺; (-) 243 (М-1)^2-, 487 (М-1)^-.

Получение триэтиламмонийных солей 2А и 2В: Соединение I-1-1 (0,41 г, 1 ммоль) добавляли небольшими порциями при перемешивании в 20%-ную дымящую серную кислоту (5 мл), которую охлаждали на бане сухой лед/ацетон. По завершении добавления смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°С, нагревали до комнатной температуры и затем перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. Раствор выливали в безводный эфир (50 мл). После выдерживания при комнатной температуре в течение 1 часа, слой органического растворителя сливали декантацией, и полутвердый нижний слой растворяли в смеси ацетонитрил-вода (1:1, 10 мл). рН раствора доводили до ~ 7,0 добавлением 2М раствора ТЕАВ (сокр. от англ. triethylamonium bicarbonate, бикарбонат триэтиламмония) в воде. Полученный раствор фильтровали через нейлоновый фильтр с размером отверстий 20 мкм, и изомеры разделяли способом препаративной ВЭЖХ. Раствор изомеров концентрировали в вакууме, затем повторно растворяли в воде (20 мкл), и растворитель отгоняли в вакууме досуха, получая красители в виде триэтиламмонийных солей. Чистоту и состав подтверждали способами ВЭЖХ и ЖХМС.

Пример 3

Триэтиламмонийная соль 7-(5-карбоксипентил)амино-3-[5-сульфонато(бензотиазол-2-ил)-кумарин-6-сульфоната

Соединение I-1-1 (0,08 г, 0.2 ммоль) добавляли небольшими порциями при перемешивании в 20%-ную дымящую серную кислоту (2 мл), которую охлаждали на бане сухой лед/ацетон. По завершении добавления смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°С, нагревали до комнатной температуры и затем перемешивали в течение 2 часов при 70°С. Затем смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Раствор выливали в безводный эфир (30 мл). Перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, и полученный осадок собирали фильтрованием с отсасыванием. Выход: 43 мг (38%).

Осадок повторно суспендировали в воде (2 мл), и рН суспензии доводили до ~ 7,5 добавлением 2М раствора ТЕАВ в воде. Полученную смесь фильтровали через нейлоновый фильтр с размером отверстий 20 мкм и очищали способом препаративной ВЭЖХ. Фракцию красителя концентрировали в вакууме, затем повторно растворяли в воде (20 мкл), и растворитель отгоняли в вакууме досуха, получая краситель в виде бис-триэтиламмонийной соли. Чистоту и состав подтверждали способами ВЭЖХ и ЖХМС. MS (DUIS): MW Вычислено: 568,03. Найдено: m/z: (+) 569 (М+1)⁺.

Интенсивность флуоресценции растворов красителей согласно примерам сравнивали с интенсивностью флуоресценции коммерческих красителей в одной и той же спектральной области. Результаты представлены в Таблице 1 и показывают значительные преимущества флуоресценции красителей согласно примерам с точки зрения применения в аналитических целях.

Пример 4

Общая процедура синтеза полностью функциональных конъюгатов нуклеотидов с новыми флуоресцентными красителями

Кумариновые флуоресцентные красители, рассмотренные в настоящей работе, связывали с подходящими аминозамещенными производными A-LN3-NH₂ или C-LN3-NH₂ нуклеотидов, включающими аденин (А) и цитозин (С),

после активации карбоксильной группы красителя под действием подходящих реагентов в соответствии со следующей схемой на примере аденина:

где Dye обозначает краситель.

Общая формула продукта, получаемого для производного аденина, показана ниже

Формула ffA-LN3-Dye означает полностью функционализированный нуклеотид, содержащий LN3 линкер и меченный кумариновым красителем, рассмотренным в настоящей работе. Группа R в каждой из структур означает фрагмент кумаринового красителя после образования конъюгата.

Краситель (10 мкмоль) сушили, помещая его в круглодонную колбу емкостью 5 мл и растворяя в безводном диметилформамиде (сокр. DMF от англ. dimethylformamide, 1 мл), после чего растворитель отгоняли в вакууме. Эту процедуру повторяли дважды. Высушенный краситель растворяли в безводном N,N-диметилацетамиде (сокр. DMA от англ. N,N-dimethylacetamide, 0,2 мл) при комнатной температуре. К раствору красителя добавляли тетрафторборат N,N,N',N'-тетраметил-O-(N-сукцинимидил)урония (сокр. TSTU от англ. N,N,N',N'-tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium tetrafluoroborate, 1,5 экв., 15 мкмоль, 4,5 мг), и затем к этому раствору через микропипетку добавляли DIPEA (3 экв., 30 мкмоль, 3,8 мг, 5,2 мкл). Реакционную колбу помещали в атмосферу азота. Протекание реакции отслеживали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) (элюент: смесь ацетонитрил-вода 1:9) и ВЭЖХ. В это время раствор подходящего аминозамещенного нуклеотидного производного (A-LN3-NH₂, 20 мМ, 1,5 экв., 15 мкмоль, 0,75 мл) концентрировали в вакууме, затем повторно растворяли в воде (20 мкл). Раствор активированного красителя в DMA переносили в колбу, содержащую раствор N-LN3-NH₂. Добавляли дополнительное количество DIPEA (3 экв., 30 мкмоль, 3,8 мг, 5,2 мкл) вместе с триэтиламином (1 мкл). Протекание реакции отслеживали каждый час с помощью ТСХ, ВЭЖХ и ЖХМС. По завершении реакции к реакционной смеси через пипетку добавляли буфер из бикарбоната триэтиламмония (ТЕАВ, 0,05М ~ 3 мл). Начальную очистку полностью функционализированного нуклеотида выполняли пропусканием потушенной (нейтрализованной) реакционной смеси через колонку DEAE-Sephadex® для удаления большей части оставшегося непрореагировавшего красителя. Например, (содержимое колонки) SephadeX выливали в пустой картридж Biotage вместимостью 25 г, система растворителей TEAB/MeCN. Раствор из колонки Sephadex концентрировали в вакууме. Оставшийся материал повторно растворяли в минимальном объеме воды и ацетонитрила, и затем фильтровали через нейлоновый фильтр с размером отверстий 20 мкм. Профильтрованный раствор очищали способом препаративной ВЭЖХ. Состав полученных соединений был подтвержден способом ЖХМС.

Сравнение интенсивностей флуоресценции в растворах нуклеотидов, меченных красителями, рассмотренными в настоящей работе, с соответствующими данными, полученными для нуклеотидов, меченных коммерчески доступным красителем (Atto465, поставляемый AttoTec GmbH), в одной спектральной области демонстрирует преимущество применения красителей, рассмотренных в настоящей работе, в качестве метки для биомолекул в аналитических способах в применением флуоресценции.

Пример 5

Аналитическое секвенирование

Красители на основе ffA', рассмотренные в настоящей работе, применяли для секвенирования на секвенаторе lllumina с использованием химических реагентов для секвенирования синтезом, и представленные на Фиг. 1А, 1В, и 1С изображения демонстрируют их применимость. Температура сканирования составляла 22°С, продолжительность экспозиции: синий - 500 миллисекунд, зеленый - 500 миллисекунд; проточная ячейка SFA. Цифры в скобках, приведенные на схемах ниже, показывают отношение нового синего ffA к зеленому greenA. Нуклеотиды А, С, G и Т были помечены следующим образом: А: Пр. 2А (Фиг. 1А), Пр. I-1-3 (Фиг. 1В) и Пр. I-1-1 (Фиг. 1С); С: NR440; G: Темный; и Т: AF550POPOS0.

Реферат

Изобретение относится к соединению Формулы (I) или к его соли, где X представляет собой O, S или NRn, где Rnпредставляет собой H; каждый из R и R1независимо представляет собой H; каждый из R2и R4независимо представляет собой H или -SO3H; R3представляет собой C2-6алкил, замещенный -CO2H; каждый R5независимо представляет собой галоген или -SO3H; и m составляет 0 или 1. Изобретение также относится к нуклеотиду или олигонуклеотиду, меченным указанным соединением. Технический результат – получены новые соединения, которые могут найти применение в качестве флуоресцентных меток для нуклеотидов при секвенировании нуклеиновых кислот. 7 н. и 15 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 5 пр.

Формула