Композиция для повышения качества спермы у субъекта мужского пола - RU2684673C2

Чертежи

Описание

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей сухой препарат Alpinia galanga (L.) Willd (Zingiberaceae) или Alpinia conchigera Griff и растительный экстракт, содержащий соединения с антиоксидантной активностью, такой как экстракт Punica granatum. Также в данном документе раскрывается способ улучшения качества спермы путем введения указанной композиции субъекту мужского пола, нуждающемуся в этом.

Предпосылки изобретения

Олигоспермия (малое количество сперматозоидов в сперме) или азооспермия (отсутствие измеримого количества сперматозоидов в сперме) являются медицинскими состояниями, которые обусловливают до 20% случаев бесплодия у особей мужского пола. Качество спермы можно измерять с помощью ряда способов. Общее количество подвижных сперматозоидов или общее число подвижных сперматозоидов (TMSC) рассматривается как одна из характеристик сперматозоидов, наиболее тесно связанных с беременностью. С помощью анализа спермы, как правило, измеряют количество сперматозоидов на миллилитр эякулята и анализируют морфологию и подвижность сперматозоидов. Типичный эякулят здорового физически зрелого молодого взрослого мужчины репродуктивного возраста, не имеющего проблем, связанных с оплодотворяющей способностью, обычно содержит 300-500 миллионов сперматозоидов, хотя в кислой среде влагалища выживают только несколько сотен, подходящих для успешного оплодотворения. Другими параметрами, отражающими качество спермы, являются концентрация белых кровяных телец, уровень фруктозы в сперме и объем, pH и время разжижения эякулята. Ряд факторов может влиять на точность результатов анализа спермы, а результаты у одного человека могут обладать большим количеством естественных изменений с течением времени. Существуют данные об общем снижении числа сперматозоидов у мужчин в Европе и США с 1983 по 1990.

На сегодняшний день не существует клинически подтвержденного и официально одобренного лечения для улучшения качества спермы. Вместо этого, единственными альтернативами, предлагаемыми субъектам, страдающим от низкого качества спермы, часто являются микрохирургические процедуры или in vitro оплодотворение спермой субъекта или донорской спермой. Таким образом, существует потребность в способах улучшения качества спермы без операции, с тем, чтобы люди, нуждающиеся в этом, могли зачать детей.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает композицию, содержащую сухой препарат I из Alpinia galanga или Alpinia conchigera и растительный экстракт II, содержащий соединения с антиоксидантной активностью. Также раскрывается способ улучшения качества спермы путем введения такой композиции субъекту мужского пола.

Гранат (Punica granatum L, Punicaceae) является кустарником или деревом, выращиваемым в основном в районах Ближнего Востока, Индии, Испании, Израиля и США. Плоды употребляют в свежем виде или перерабатывают с получением сока. В современной фитотерапии плоды граната применяют, помимо прочего, в качестве кардиозащитного средства, против гиперлипидемии и против рецидивирующего рака предстательной железы.

Плод граната включает кожистый околоплодник, содержащий многочисленные оболочки семян, каждое отдельное семя окружено полупрозрачным сокосодержащим мешочком. Тонкие мембраны тянутся внутрь плода от околоплодника, образуя решетчатую конструкцию для поддержания оболочек семян. Таким образом, сам плод образует три части: семена, составляющие приблизительно 3% веса плода и сами по себе содержащие приблизительно 20% масла, сок, приблизительно 30% веса плода, и кожуру (околоплодник), которая также включает внутреннюю сеть мембран.

Благотворное действие гранатового сока объясняется его антиоксидантными компонентами, включающими гидролизуемые таннины (среди которых эллагитаннины, такие как изомеры пуникалагина), антоцианины, эллаговую кислоту и ее производные и витамин С. В коммерческом гранатовом соке водорастворимые пуникалагины являются наиболее важными антиоксидантными соединениями, которые делают коммерческие продукты в два раза более сильными антиоксидантами, чем сок, полученный ручным прессованием. Пуникалагины присутствуют в изобилии в околоплоднике и во время промышленной переработки экстрагируются в гранатовый сок в значительных количествах.

Влияние гранатового сока или экстракта на качество спермы изучали в двух in vivo исследованиях, проводившихся на мышах и крысах. Никакие исследования влияния на человека ранее не опубликовывались. В одном исследовании, проведенном на крысах, коммерческий пастеризованный гранатовый сок вызвал увеличение подвижности сперматозоидов (27%) в суточной дозе 3,6 мл гранатового сока/кг массы тела в течение семи недель (Turk et al., 2008). Аналогичные эффекты, хотя и более слабые, наблюдались при более низких дозах. В исследовании сообщается об отсутствии влияния граната на вес органов размножения. В исследовании на крысах этанольный экстракт граната не влиял на сперматогенез, суточное образование сперматозоидов или число эпидидимальных сперматозоидов у крыс, не подвергавшихся обработке, но немного снижал отрицательное воздействие на данные параметры у крыс, обработанных с использованием ацетата свинца (Leiva et al., 2011).

Насколько известно, в клинических исследованиях не сообщалось о серьезных нежелательных эффектах. Дозы в 50 мл гранатового сока/сутки в течение нескольких лет или 240 мл/сутки в течение нескольких месяцев хорошо переносились.

Alpinia galanga (L.) Willd. или калган большой относится к Zingiberaceae (семейство имбирные). Родиной данного растения является Индонезия, Малайзия и Индия. В некоторых областях корневище применяют в качестве приправы. Данное растение традиционно применяют для лечения воспалительных состояний, инфекций дыхательных путей, рака, диспепсии, колик и морской болезни и в качестве тонизирующего средства и афродизиака. Alpinia conchigera является близкородственным видом родом из Таиланда, Малайзии и Индии.

Корневище A. Galanga содержит несколько фенилпропаноидов, обладающих фармакологической активностью, в том числе 1'S-1'-ацетоксихавиколацетат (АСА), 1'S-1'-ацетоксиэвгенолацетат (АЕА) и 1'S-1'-гидроксихавиколацетат (НСА). Корневище также содержит эфирное масло, основным компонентом которого является 1,8-цинеол. Также присутствуют высокие уровни магния, кальция, калия и марганца.

Этанольный экстракт корневища A. galanga показал ряд эффектов, улучшающих сперму, у мышей при суточной дозе 100 мг/кг массы тела в течение трех месяцев. Как подвижность сперматозоидов, так и концентрация сперматозоидов увеличились немного, но значительно, при этом увеличение подвижности сперматозоидов являлось наиболее выраженным (Qureshi et al., 1992). В исследовании сообщается об отсутствии влияния на процент аномальных сперматозоидов.

Другое исследование влияния спиртового экстракта корневища A. galanga на крысах показало, что введение суточной дозы 200 мг экстракта/кг массы тела вызвало значительное увеличение уровня тестостерона в сыворотке через 15 дней (Islam et al., 2000).

Не известно никаких серьезных нежелательных эффектов в отношении потребления этанольного экстракта корневища A. galanga. Постоянная доза 100 мг этанольного экстракта/кг массы тела хорошо переносится мышами (Qureshi et al., 1992).

На сегодняшний день влияние препаратов P. granatum и/или A. galanga не изучалось в отношении качества спермы человека.

Краткое описание графических материалов

Фигура 1: GC-хроматограмма сухого препарата лиофилизированных корневищ Alpinia galanga.

Фигура 2: GC-хроматограмма свежих корневищ Alpinia galanga.

Фигура 3: GC-хроматограмма внешнего стандарта АСА.

Фигура 4: Увеличения TMSC от исходного уровня до конечного момента времени последующего наблюдения для каждого участника в группе, получавшей растение, и группе плацебо.

Подробное описание графических материалов

Фигура 1. GC-хроматограмма сухого препарата лиофилизированных корневищ Alpinia galanga. Преобладающим соединением при rt 34,2-34,4 минуты является АСА (1'S-1'-ацетоксихавиколацетат), идентифицированный с помощью масс-спектров соединения в экстракте в комбинации со спектрами и временем удерживания стандарта АСА.

Фигура 2. GC-хроматограмма экстракта свежих корневищ Alpinia galanga. Преобладающим соединением при rt 29,18 минут является АСА (1'S-1'-ацетоксихавиколацетат), идентифицированный с помощью масс-спектров соединения в экстракте в комбинации со спектрами и временем удерживания стандарта АСА. Для данной хроматограммы использовали несколько отличные условия (режим термостата и поток в колонке) по сравнению с хроматограммами, представленными на фигурах 1 и 3.

Фигура 3. GC-хроматограмма стандарта АСА (1'S-1'-ацетоксихавиколацетата), поставляемого Phytolab. Параметры GC аналогичны таковым, которые применялись для хроматограммы, представленной на фигуре 1.

Фигура 4. График различий в TMSC (общее число подвижных сперматозоидов) от исходного уровня до конечного момента времени последующего наблюдения для каждого участника в лечебной группе (А), получавшей препарат Alpinia galanga и экстракт выжимок Punica granatum, и группе плацебо (В). Конечный момент времени последующего наблюдения - исходный уровень (Y-ось) представляет рассчитанные различия в TMSC между TMSC в конечный момент времени последующего наблюдения через 90 дней после введения либо сухого препарата А. galanga и экстракта P. granatum (группа А), либо плацебо (группа В), и соответствующими TMSC перед введением.

Подробное описание настоящего изобретения

Определения

1'S-1'-ацетоксихавиколацетат (АСА)

1'S-1'-ацетоксихавиколацетат (АСА) является полулетучим фенилпропаноидом. В типичных условиях гидролиза в воде или водном растворе этанола, в частности, если на экстракт воздействуют повышенные температуры, АСА может частично или полностью превращаться в 1'-гидроксихавиколацетат и/или п-ацетоксикоричный спирт, и/или п-кумарилдиацетат.

Аэробный микроорганизм

Аэробным организмом или аэробом является организм, который может выживать и расти в среде, насыщенной кислородом.

Alpinia conchigera

Alpinia conchigera Griff принадлежит к семейству Zingiberaceae (семейство имбирные). Родиной данного растения является Таиланд, Малайзия и Индия.

Alpinia galanga

Alpinia galanga (L.) Willd. или калган большой относится к семейству Zingiberaceae (имбирные). Родиной данного растения является Индонезия, Малайзия и Индия. Данное растение растет из корневищ группами жестких стеблей до двух метров в высоту с обильными длинными листьями и метелками зеленовато-белых цветов.

Безводный/Сухой

Как подразумевается в данном документе, термины "безводный" или "сухой" относятся к веществу с содержанием воды менее 15%.

Антиоксидантная активность

Антиоксидантная активность является активностью, которую проявляют антиоксиданты, т.е. молекулы, которые ингибируют окисление других молекул. Окисление является химической реакцией, которая переносит электроны или водород от вещества к окислителю. Реакции окисления могут приводить к образованию свободных радикалов. В свою очередь, такие радикалы могут запускать цепные реакции. Когда в клетке происходит цепная реакция, она может приводить к повреждению или гибели клетки. Антиоксиданты прерывают такие цепные реакции путем удаления промежуточных свободных радикалов и ингибируют другие реакции окисления. В данном процессе антиоксиданты окисляются. Они часто являются восстановителями, такими как тиолы, аскорбиновая кислота или полифенолы.

Связующее средство

Термин "связующее средство" относится к вспомогательному веществу, которое обеспечивает когезию внутри таблеток и гранул, и других составов. Применение связующего средства обеспечивает состав с достаточной механической прочностью.

Уменьшение размеров

Как подразумевается в данном документе, термин "уменьшение размера" относится к способу, при котором препарат, такой как порошок, подвергается уменьшению размера. Например, уменьшение размера порошка приводит к образованию порошка, в котором конечный размер частиц данного порошка уменьшен. Уменьшение размера можно осуществлять совместно с помолом, некоторые мельницы оснащаются ситами, которые обеспечивают только прохождение частиц, меньших, чем размер ячейки сита.

Эллагитаннины

Эллагитаннины являются разнородным классом гидролизуемых таннинов, типом полифенола, образованного главным образом за счет окислительного связывания галлоильных групп в 1,2,3,4,6-пентагаллоилглюкозе. Эллагитаннины изучались в лабораториях в клетках и животных на наличие антиоксидантной, противоопухолевой, противовирусной, противомикробной и противопаразитарной активности, а также их способности регулировать уровень глюкозы в крови. Эллагитаннины граната, которые включают изомеры пуникалагина, являются эллагитаннинами, обнаруживаемыми в плодах, корке (кожуре), коре или сердцевинной древесине гранатов. Также установлено, что пуникалагины важны для антиоксидантного и полезного для здоровья эффекта коммерческого гранатового сока. Примерами эллагитаннинов, обнаруживаемых в гранатах, являются пуникалины, пуникалагины А и В, изомеры пуникалина.

Лиофилизация

Лиофилизация, как подразумевается в данном документе, относится к способу высушивания твердого соединения, такого как корневища A. galanga. Способы лиофилизации, которые подразумеваются в данном документе, могут включать стадии:

i) замораживания корневищ до температуры приблизительно -18 или -20°С;

ii) применения вакуума до стабилизации давления в диапазоне 1,5-1,7 мбар; при этом давление можно поддерживать на стабильном уровне путем подачи, например, азота;

iii) повышения температуры для запуска процесса высушивания;

iv) устранения вакуума.

Таким образом, лиофилизация включает стадии, необходимые для обеспечения сублимации воды, содержащейся в материале, подлежащем лиофилизации, т.е. корневищах.

Гранулят/Гранулирование

Гранулят или гранулированный материал является скоплением отдельных твердых, макроскопических частиц, характеризующихся потерей энергии, всегда, когда эти частицы взаимодействуют. Компоненты, составляющие гранулированный материал, должны являться достаточно большими, такими, чтобы они не подвергались колебаниям теплового движения. Таким образом, нижний предел размера зерен в гранулированном материале составляет приблизительно 1 мкм. Термин "гранулирование" относится к способу формирования гранулята.

Бескислородный газ

Следует понимать, что бескислородный газ относится к газовой смеси, содержащей уровни кислорода настолько низкие, что рост аэробных микроорганизмов подавляется. Как правило, уровни кислорода в, по сути, бескислородном газе составляют менее 3%.

Фармакологическая активность

Фармакологическая активность относится к воздействию лекарственного средства на живую материю. Если лекарственное средство является сложной химической смесью, такая активность проявляется активным ингредиентом вещества или фармакофором, но может модифицироваться с помощью других компонентов. Активность, как правило, зависит от дозы.

Фенилпропаноиды

Фенилпропаноиды являются разнородным семейством органических соединений, которые синтезируются растениями из аминокислоты фенилаланина. Их название происходит от шестиуглеродной ароматической фенильной группы и трехуглеродного пропенового концевого участка коричной кислоты, которая синтезируется из фенилаланина на первой стадии биосинтеза фенилпропаноидов. Фенилпропаноиды встречаются во всем царстве растений, где они служат основными компонентами ряда структурных полимеров, обеспечивают защиту от ультрафиолетового света, защищают от травоядных животных и патогенов, и опосредуют взаимодействия растений с опылителями как цветочные пигменты и соединения, придающие аромат. Тремя фенилпропаноидами, обнаруживаемыми в Alpinia galanga, являются 1'S-1'-ацетоксихавиколацетат (АСА), 1'S-1'-ацетоксиэвгенолацетат (АЕА) и 1'-гидроксихавиколацетат (НСА).

Порошок/Измельчение

Порошок является сухим сыпучим материалом, состоящим из большого количества очень мелких частиц, которые могут свободно перемещаться при встряхивании или наклоне. Термин "измельчение" относится к способу превращения твердого вещества в порошок, например, путем помола.

Punica granatum

Гранат (Punica granatum L, Punicaceae) является кустарником или деревом, в основном выращиваемым в районах Ближнего Востока, Индии, Испании, Израиля и США. Плоды употребляют в свежем виде или перерабатывают с получением сока. В современной фитотерапии плоды граната применяют, помимо прочего, в качестве кардиозащитного средства, против гиперлипидемии и против рецидивирующего рака предстательной железы.

Плод граната включает кожистый околоплодник, содержащий многочисленные оболочки семян, каждое отдельное семя окружено полупрозрачным сокосодержащим мешочком. Тонкие мембраны тянутся внутрь плода от околоплодника, образуя решетчатую конструкцию для поддержания оболочек семян. Таким образом, сам плод образует три части: семена, составляющие приблизительно 3% веса плода и сами по себе содержащие приблизительно 20% масла, сок, приблизительно 30% веса плода, и кожуру (околоплодник), который также включает внутреннюю сеть мембран.

Пуникалагины

Пуникалагины А и В являются подклассом эллагитаннинов, который, как оказалось, важен для антиоксидантного и полезного для здоровья эффекта коммерческого гранатового сока. Пуникалагины также встречаются в других растениях семейства Combretaceae: в листьях Terminalia catappa L, в плодах Terminalia citrina (Gaertn.) Roxb., в корнях Terminalia macroptera Guill. & Perr., в листьях Terminalia myriocarpa Van Heurck & Mull. Arg., в листьях Terminalia oblongata F. Muell., в листьях Combretum molle R. Br. ex G. Don. и в листьях Lumnitzera racemosa Willd.

Пуникалины

Пуникалин является эллагитаннином. Термин пуникалины, как подразумевается в данном документе, относится к пуникалинам А и В, а также к изомерам пуникалина.

Пуникозиды

Как подразумевается в данном документе, термин пуникозиды относится к пуникалагинам и пуникалинам, включая пуникалагин А и В, пуникалины А и В и изомеры пуникалина.

Корневище

Корневище является модифицированным подземным стеблем растения, который обычно находится под землей, часто давая корни и побеги из своих узлов.

Сперма

Сперма, также известная как семенная жидкость, является органической жидкостью, которая может содержать сперматозоиды. Она секретируется гонадами (половыми железами) и другими половыми органами самцов или гермафродитных животных, и может оплодотворять женские яйцеклетки.

Качество спермы

Качество спермы является мерой способности спермы совершать оплодотворение. Таким образом, оно является мерой репродуктивной функции субъекта мужского пола. Качество спермы включает как количество спермы, так и ее качество. Сниженное качество спермы является главным фактором мужского бесплодия. Качество спермы можно оценивать с помощью анализов спермы. Примерами параметров, измеряемых при анализе спермы, являются число сперматозоидов, подвижность, морфология, объем, уровень фруктозы и pH.

Подвижность сперматозоидов

Данный термин относится к способности сперматозоидов двигаться вперед. В контексте настоящего изобретения следует понимать, что данный термин относится также к степени подвижности, когда подвижность сперматозоидов подразделяют на четыре различных степени.

Степень a: сперматозоиды с поступательной подвижностью. Они являются самыми сильными и быстро плывут по прямой линии.

Степень b: (нелинейная подвижность): они также двигаются вперед, но проявляют тенденцию перемещаться, совершая нелинейные или непрямые движения.

Степень c: они обладают непоступательной подвижностью, потому что они не двигаются вперед, несмотря на то, что двигаются их хвосты.

Степень d: они неподвижны и не в состоянии двигаться вообще.

Сперматогенез

Сперматогенез является процессом, с помощью которого примордиальные зародышевые клетки самца, называемые сперматогониями, подвергаются мейозу с получением множества клеток, называемых сперматозоидами. Начальные клетки в данном пути называются сперматоцитами первого порядка.

Общее число подвижных сперматозоидов (TMSC)

Общее число подвижных сперматозоидов (TMSC) или общие подвижные сперматозоиды (Total motile spermatozoa) (TMS) является комбинацией числа сперматозоидов, подвижности и объема, показывающей при измерении, сколько миллионов сперматозоидов во всем эякуляте являются подвижными. TMSC определяется как объем эякулята × концентрацию сперматозоидов × процент подвижных сперматозоидов.

Летучесть и полулетучесть

Летучесть является склонностью вещества к испарению. Летучесть напрямую связана с давлением паров вещества. При заданной температуре вещество с более высоким давлением паров испаряется легче, чем вещество с более низким давлением паров. Летучими соединениями являются соединения, которые обладают высоким давлением паров в обычных условиях при комнатной температуре. Их высокое давление паров является следствием низкой точки кипения, которая приводит к испарению или сублимации большого числа молекул из жидкой или твердой формы соединения и поступлению в окружающий воздух. Полулетучее соединение является соединением, которое обладает более высокой температурой кипения, чем вода, и которое может испаряться, подвергаясь воздействию температур выше комнатной.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей сухой препарат I из корневищ Alpinia galanga или Alpinia conchigera и экстракт II, содержащий соединения с антиоксидантной активностью. В рамках настоящего изобретения также предусмотрены композиции, содержащие сухой препарат I, содержащий главным образом все полулетучие и нелетучие соединения из корневищ Alpinia galanga или Alpinia conchigera. Применение такой композиции неожиданно приводит к среднему увеличению общего числа подвижных сперматозоидов до 74%.

Сухой препарат I

Сухой препарат I получают из Alpinia galanga или Alpinia conchigera, предпочтительно способом, включающим стадии:

i) получения невысушенных корневищ Alpinia galanga или Alpinia conchigera;

ii) лиофилизации указанных корневищ в течение такого периода, чтобы содержание воды в указанных корневищах составляло менее 15%;

iii) измельчения указанных лиофилизированных корневищ при температуре ниже 50°С; при этом указанный сухой препарат содержит главным образом все нелетучие и полулетучие соединения из Alpinia galanga или Alpinia conchigera. Сухой препарат I содержит главным образом все нелетучие соединения и полулетучие соединения из Alpinia galanga или Alpinia conchigera.

Предпочтительные способы получения сухого препарата I из Alpinia galanga или Alpinia conchigera дают в результате сухой препарат I, содержащий главным образом все полулетучие и нелетучие соединения из Alpinia galanga или Alpinia conchigera. Сухой препарат I также может содержать летучие соединения из A. galanga или А. conchigera. Соединения, которые могут содержаться в сухом препарате I, включают без ограничения i) фенилпропаноиды, включая без ограничения 1'S-1'-ацетоксихавиколацетат (АСА), 1'S-1'-ацетоксиэвгенолацетат (АЕА) и 1'S-1'-гидроксихавиколацетат (НСА); ii) эфирные масла, включая без ограничения 1,8-цинеол; iii) минералы, включая без ограничения магний, кальций, калий и марганец. Сухой препарат I также может содержать продукты разложения соединений, присутствующих в свежих корневищах A. galanga или A. conchigera, такие как без ограничения 1'-гидроксихавиколацетат, п-ацетоксикоричный спирт, п-кумарилдиацетат. Настоящее изобретение дополнительно относится к сухому препарату I, содержащему одно или несколько из следующего: фенилпропаноиды, такие как 1'S-1'-ацетоксихавиколацетат (АСА), 1'S-1'-ацетоксиэвгенолацетат, 1'S-1'-гидроксихавиколацетат, п-гидроксикоричный альдегид, п-кумарилдиацетат, транс-кониферилдиацетат, транс-п-кумариловый спирт, транс-п-гидроксициннамилацетат, п-ацетоксикоричный спирт, п-гидроксибензальдегид, хавиколацетат, хавикол, метилэвгенол, эвгенол, эвгенолацетат, метилциннамат; терпены и родственные соединения, включая монотерпены и сесквитерпены, такие как 1,8-цинеол, α-пинен, β-пинен, α-терпинеол, терпинен-4-ол или 4-терпинеол, камфен, камфора, мирцен, (Z)-β-оцимен, лимонен, линалоол, фенхилацетат, геранилацетат, борнилацетат, цитронеллилацетат, 2-ацетокси-1,8-цинеол, 3-ацетокси-1,8-цинеол, гвайол, β-фарнезен, β-бисаболен, (Z,Е)-фарнезол, β-кариофиллен, α-бергамотен.

В предпочтительном варианте осуществления корневища A. galanga или А. conchigera, предусмотренные для получения сухого препарата I, являются свежими корневищами. Апикальные побеги можно удалить, или корневища еще могут содержать по меньшей мере один апикальный побег. Стебли можно удалить, или корневища еще могут содержать по меньшей мере один стебель. В одном варианте осуществления собранные корневища хранят в замороженном состоянии при температуре от -20 до 0°С до высушивания. В других вариантах осуществления собранные корневища хранят при температуре от 0 до 25°С до высушивания, например, при температуре от 0 до 20°С, например, при температуре от 0 до 15°С, например, при температуре от 0 до 10°С, предпочтительно при температуре от 0 до 5°С. Корневища могут являться неизмененными или, предпочтительно, разрезанными или нарезанными слоями перед высушиванием, например, их можно разрезать в продольном направлении с целью увеличения поверхности корневища, подвергающейся воздействию, тем самым способствуя процессу высушивания.

Сухой препарат I содержит предпочтительно по меньшей мере 1% 1'S-1'-ацетоксихавиколацетата, например, по меньшей мере 1,5% 1'S-1'-ацетоксихавиколацетата, например, по меньшей мере 2% 1'S-1'-ацетоксихавиколацетата, например, по меньшей мере 2,5%, например, по меньшей мере 3%, например, по меньшей мере 3,5%, например, по меньшей мере 4%, например, по меньшей мере 4,5%, например, по меньшей мере 5%, например, по меньшей мере 5,5%, например, по меньшей мере 6%, например, по меньшей мере 6,5%, например, по меньшей мере 7%, например, по меньшей мере 7,5%, например, по меньшей мере 8%. Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения выдвигают гипотезу о том, что уровни содержания АСА свидетельствует об уровнях содержания компонентов A. galanga или A. conchigera, которые подвержены гидролизу и/или разложению.

Лиофилизацию можно осуществлять при температурах выше 25°С. Предпочтительно, процесс высушивания включает стадии:

i) замораживания корневищ до температуры приблизительно -18 или -20°С;

ii) применения вакуума до стабилизации давления в диапазоне 1,5-1,7 мбар; давление можно поддерживать на стабильном уровне путем подачи, например, азота;

iii) повышения температуры для запуска процесса высушивания;

iv) высушивания при заданной температуре;

v) устранения вакуума.

Таким образом, лиофилизация включает стадии, необходимые для обеспечения сублимации воды, содержащейся в материале, подлежащем лиофилизации, т.е. корневищах. Температура высушивания, применяемая на стадии iv), составляет более 0°С, например, до 10°С, до 20°С, до 30°С, до 40°С, до 50°С, до 60°С, до 70°С, до 80°С, до 90°С. Температура высушивания, применяемая на стадии iv), предпочтительно, может составлять более 25°С, например, 30°С, например, 37°С, например, 40°С, например, 47°С, например, 50°С, например, 52°С, например, 60°С, например, 70°С, например, 80°С, например, 90°С.

В некоторых вариантах осуществления содержание воды в лиофилизированных корневищах составляет менее 15%, например, менее 14%, например, менее 13%, например, менее 12%, например, менее 11%, например, менее 10%, например, менее 9%, например, менее 8%, например, менее 7%, например, менее 6%, например, менее 5%.

Специалисту в данной области будет очевидно, что температура и продолжительность, применяемые для каждой из стадий, включенных в лиофилизацию, могут изменяться в зависимости, например, от таких параметров, как производительность сушильной камеры, от применяемого давления, от возраста корневищ, от степени измельчения или нарезки корней.

В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать помол сухого препарата I с помощью способов, известных из уровня техники, с получением порошка.

Помол сухого препарата I предпочтительно осуществляют при температуре, подходящей для предотвращения гидролиза летучих соединений, таких как АСА. Таким образом, помол предпочтительно осуществляют при температуре ниже 50°С, например, ниже 40°С, например, ниже 35°С, например, ниже 30°С. Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения выдвигают гипотезу о том, что высокие температуры могут ускорять гидролиз АСА в лиофилизированных корневищах, которые все еще содержат некоторое количество воды. Таким образом, помол предпочтительно осуществляют на мельнице, оснащенной системой охлаждения с целью поддержания температуры в соответствующем диапазоне, несмотря на то, что процесс помола является экзотермическим.

В некоторых вариантах осуществления стадия помола включает по меньшей мере одну стадию уменьшения размера. Уменьшение размера можно осуществлять в мельнице, оснащенной ситом, где сито характеризуется отверстием менее 15 мм, например, 12 мм, например, 10 мм, например, 5 мм, например, 4 мм, например, 3 мм, например, 2 мм, например, 1 мм.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна стадия уменьшения размера представляет собой три стадии уменьшения размера, осуществляемых в следующем порядке:

i) уменьшение размера на сите 12 мм;

ii) уменьшение размера на сите 2 мм;

iii) уменьшение размера на сите 1 мм.

Осуществление нескольких стадий уменьшения размера может способствовать процессу уменьшения размера путем отсортировывания в первую очередь более крупных частиц, в результате чего дополнительное уменьшение размера отобранных частиц облегчается.

В некоторых вариантах осуществления полученный порошок, подвергшийся уменьшению размера, таким образом, содержит частицы, обладающие размером, меньшим, чем наименьший размер любого сита, используемого в процессе уменьшения размера. Специалисту в данной области будет очевидно, что выбор сита зависит от требуемого размера частиц. Стадия помола и/или по меньшей мере одна стадия уменьшения размера предпочтительно приводит к получению, по сути, гомогенного сухого препарата I, в котором компоненты корневищ A. galanga или А. Conchigera, по сути, равномерно распределены.

В некоторых вариантах осуществления сухой препарат I является, по сути, гомогенным.

В предпочтительном варианте осуществления сухой препарат I составляют в виде препарата для приема внутрь, такого как без ограничения таблетка, пилюля, капсула или порошок. Его также можно составлять в виде пищевой добавки или в виде биологически активной пищевой добавки, продукта лечебного питания или продукта питания для специального медицинского назначения. Способом составления сухого препарата I может являться любой способ, известный специалисту в данной области. Состав может содержать другие ингредиенты, и может содержать покрытие.

В некоторых вариантах осуществления любые дополнительные стадии составления осуществляют при температуре ниже 50°С, например, ниже 40°С, например, ниже 35°С, например, ниже 30°С.

Сухой препарат I из A. galanga или A. conchigera можно получать вышеописанным способом, дополнительно включающим стадии, на которых i) переносят сухой препарат в газонепроницаемый герметичный контейнер, причем указанный контейнер содержит бескислородный газ; ii) необязательно, нагревают указанный контейнер при температуре в диапазоне от 50°С до 90°С, например, от 60°С до 80°С, например, от 70°С до 80°С, например, при 75°С. Бескислородный газ может являться азотом или любым другим бескислородным газом, который предотвращает рост аэробных микроорганизмов. Сухой препарат I следует хранить в контейнере в течение такого времени, чтобы титры аэробных микроорганизмов, либо факультативных, либо облигатных аэробов, существенно снизились. Например, сухой препарат I хранят в контейнере, содержащем бескислородный газ, в течение периода по меньшей мере 5 дней, например, по меньшей мере 6 дней, например, по меньшей мере 7 дней, например, по меньшей мере 8 дней, например, по меньшей мере 9 дней, например, по меньшей мере 10 дней, например, 11 дней, например, 12 дней, например, 13 дней, предпочтительно, в течение, по меньшей мере 14 дней, например, 15 дней, например, 16 дней.

Газонепроницаемый герметичный контейнер, содержащий бескислородный газ и сухой препарат I из A. galanga или A. conchigera, можно дополнительно нагревать при температуре в диапазоне от 50°С до 90°С, например, от 60°С до 80°С, например, от 70°С до 80°С, например, при 75°C с целью обеспечения ингибирования роста оставшихся аэробных микроорганизмов и роста анаэробных микроорганизмов. Контейнер можно нагревать в течение такого времени, чтобы общее число бактерий в сухом препарате I являлось низким. Неожиданно, такое нагревание не приводит к низкому выходу АСА в сухом препарате (смотри пример 1).

Для уменьшения общего числа бактерий в сухом препарате I могут применяться другие способы, известные из уровня техники, такие как без ограничения химическая стерилизация, облучение, газовая стерилизация, высокое давление.

Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения характеризуются таким общим числом бактерий, что прием внутрь сухого препарата I по настоящему изобретению расценивается как безвредный и безопасный. Например, виды Salmonella должны отсутствовать в 25 г образца препарата, как рекомендовано в общих руководящих принципах безопасности пищевых продуктов (general food safety guidelines) (Руководство по оценке патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах, Министерство продовольствия, сельского хозяйства и рыболовства, Дания, 1999 г.; Постановление (ЕС) №2160/2003 Европейского парламента и Совета от 17 ноября 2003 года о контроле над Salmonella и другими определенными возбудителями зоонозных заболеваний, переносимыми с пищей (Guidelines on the Evaluation of Pathogenic Microorganisms in Food, Ministry for Food, Agriculture and Fishing, Denmark, 1999; Regulation (EC) No 2160/2003 of the European Parliament and of the Council of 17 November 2003 on the control of Salmonella and other specified food-borne zoonotic agents)). Число Escherichia coli должно находиться в пределах допустимого диапазона менее 100 на грамм препарата. Такие препараты считаются, по сути, не содержащими микроорганизмы.

Также в данном документе предусматривается способ получения гранулированного порошка Alpinia galanga или Alpinia conchigera, причем указанный способ включает стадии:

i) получения сухого препарата из Alpinia galanga или Alpinia conchigera;

ii) связывания указанного сухого препарата с помощью раствора связующего средства, который содержит связующее средство, растворенное в, по сути, чистом органическом растворителе, причем указанный раствор связующего средства, по сути, не содержит воды;

iii) удаления органического растворителя;

где стадии ii) и iii) осуществляют при температуре ниже 50°С, например, ниже 40°С, например, ниже 35°С, например, 30°С.

Примеры подходящих связующих средств включают без ограничения сахариды и их производные: дисахариды, например, сахарозу или лактозу, полисахариды и их производные, например, крахмалы, целлюлозу или модифицированную целлюлозу, такую как микрокристаллическая целлюлоза и простые эфиры целлюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза (НРС); сахарные спирты и их производные, например, ксилит, сорбит или мальтит; белки, например, желатин; синтетические полимеры, например, поливинилпирролидон (PVP), полиэтиленгликоль (PEG). Предпочтительно, связующее вещество представляет собой раствор связующего вещества. В одном варианте осуществления связующее вещество является PVP, например, PVP90.

Подходящие органические растворители включают растворители, которые являются, по сути, чистыми и не содержат воду. Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что важно, чтобы растворитель не содержал воду с целью предотвращения гидролиза АСА и других соединений из Alpinia galanga или Alpinia conchigera.

В некоторых вариантах осуществления органическим растворителем является этанол или изопропанол. Следует понимать, что можно применять любой органический растворитель, способный растворять связующее вещество с получением подходящего раствора связующего вещества.

Специалисту в данной области известно, в каком массовом соотношении следует растворять связующее вещество в органическом растворителе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления применимые массовые соотношения растворитель/связующее вещество находятся в диапазоне от 80:20 до 98:2, например, от 85:15 до 96:4, например, от 87:13 до 94:6, например, от 89:11 до 92:8, например, 91,5:8,5.

В некоторых вариантах осуществления органический растворитель является по меньшей мере на 90% чистым, например, по меньшей мере на 95% чистым, например, по меньшей мере на 96% чистым, например, по меньшей мере на 97% чистым, например, по меньшей мере на 98% чистым, например, по меньшей мере на 99% чистым, например, на 99,5% чистым, например, на 100% чистым. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления органическим растворителем является этанол, который является по меньшей мере на 90% чистым, например, по меньшей мере на 95% чистым этанолом, например, по меньшей мере на 96% чистым этанолом, например, по меньшей мере на 97% чистым этанолом, например, по меньшей мере на 98% чистым этанолом, например, по меньшей мере на 99% чистым этанолом, например, на 99,5% чистым этанолом, например, на 100% чистым этанолом. В других вариантах осуществления органическим растворителем является изопропанол, который является по меньшей мере на 90% чистым, например, по меньшей мере на 95% чистым изопропанолом, например, по меньшей мере на 96% чистым изопропанолом, например, по меньшей мере на 97% чистым изопропанолом, например, по меньшей мере на 98% чистым изопропанолом, например, по меньшей мере на 99% чистым изопропанолом, например, на 99,5% чистым изопропанолом, например, на 100% чистым изопропанолом.

Специалисту в данной области известно, в каком массовом соотношении сухой препарат растворяют в растворе связующего вещества. В некоторых вариантах осуществления сухой препарат и связующее вещество вводят в контакт при массовом соотношении в диапазоне от 80:20 до 98:2, например, от 85:15 до 96:4, например, от 87:13 до 94:6, например, от 89:11 до 93:7, например, 92,5:7,5.

Предпочтительно, по меньшей мере одну из стадий ii) и iii) осуществляют при температуре 30°С или меньше. Как правило, предпочтительно осуществлять по меньшей мере одну из данных стадий при температуре, при которой гидролиз АСА и других соединений из Alpinia galanga или Alpinia conchigera уменьшается. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере стадии ii) и iii) осуществляют при температуре 30°С или меньше. В других вариантах осуществления все стадии i), ii) и iii) осуществляют при температуре 30°С или меньше.

Способ получения гранулированного порошка из Alpinia galanga или Alpinia conchigera может дополнительно включать стадию помола.

Стадию помола предпочтительно осуществляют при температуре, подходящей для предотвращения гидролиза летучих соединений, таких как АСА. Таким образом, помол предпочтительно осуществляют при температуре ниже 50°С, например, ниже 40°С, например, ниже 35°С, например, ниже 30°С. Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения выдвигают гипотезу о том, что высокие температуры могут ускорять гидролиз АСА в лиофилизированных корневищах, которые все еще содержат некоторое количество воды. Таким образом, помол предпочтительно осуществляют на мельнице, оснащенной системой охлаждения с целью поддержания температуры в пределах соответствующего диапазона, несмотря на то, что процесс помола является экзотермическим.

В некоторых вариантах осуществления стадия помола включает по меньшей мере одну стадию уменьшения размера. Уменьшение размера можно осуществлять в мельнице, оснащенной ситом, при этом сито характеризуется отверстием менее 15 мм, например, 12 мм, например, 10 мм, например, 5 мм, например, 4 мм, например, 3 мм, например, 2 мм, например, 1 мм.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна стадия уменьшения размера представляет собой три стадии уменьшения размера, осуществляемые в следующем порядке:

i) уменьшение размера на сите 12 мм;

ii) уменьшение размера на сите 2 мм;

iii) уменьшение размера на сите 1 мм.

Осуществление нескольких стадий уменьшения размера может способствовать процессу уменьшения размера путем отсортировывания в первую очередь более крупных частиц, в результате чего дополнительное уменьшение размера отобранных частиц облегчается.

В некоторых вариантах осуществления полученный гранулированный порошок, подвергшийся уменьшению размера, таким образом, содержит частицы, характеризующиеся размером, меньшим, чем наименьший размер любого сита, используемого в процессе уменьшения размера. Специалисту в данной области будет очевидно, что выбор сита зависит от требуемого размера частиц. Стадия помола и/или по меньшей мере одна стадия уменьшения размера предпочтительно приводит к получению гомогенного гранулированного порошка, в котором компоненты А. galanga или A. conchigera, по сути, равномерно распределены.

Сухой препарат, полученный на стадии i), может являться порошком. Способ гранулирования такого порошка предпочтительно приводит к получению гранулята с более высокой плотностью, чем порошок, полученный на стадии i). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления гранулированный порошок, полученный с помощью способа по настоящему изобретению, характеризуется плотностью более 12 г/100 мл, например, более 15 г/100 мл, например, более 20 г/100 мл, например, более 22 г/100 мл, например, более 25 г/100 мл, например, более 26 г/100 мл, например, 27 г/100 мл, например, 28 г/100 мл, например, 29 г/100 мл, например, 30 г/мл.

В некоторых вариантах осуществления гранулированный порошок характеризуется углом естественного откоса, составляющим от 30° до 50°, например, от 35° до 45°, например, от 36° до 43°, например, от 37° до 41°, например, от 38° до 40°, например, 39°.

Сухой препарат, который получают на стадии i), можно получать, как описано выше, применяя один из способов по настоящему изобретению.

Настоящий способ может дополнительно включать стадию покрытия гранулята покрывающим средством. Подходящие покрывающие средства известны из уровня техники. Можно применять покрывающие средства на водной основе. Такие покрывающие средства, по-видимому, не ускоряют гидролиз АСА.

В некоторых вариантах осуществления гранулят, полученный настоящим способом, является, по сути, гомогенным.

В других вариантах осуществления все стадии способа получения гранулята осуществляют при температуре 30°С или меньше.

В другом варианте осуществления сухой препарат I из A. galanga или A. conchigera содержит главным образом все нелетучие соединения из A. galanga или А. conchigera; и по меньшей мере 1% 1'S-1'-ацетоксихавиколацетата.

Сухой препарат I можно получать с помощью способа, описываемого в данном документе, и он, по сути, не содержит живые микроорганизмы. Его можно составлять в виде препарата для приема внутрь, такого как таблетка, пилюля, капсула или порошок, в виде биологически активной пищевой добавки, пищевой добавки или продукта лечебного питания, или продукта питания для специального медицинского назначения.

Сухой препарат I из A. galanga или A. conchigera можно применять как лекарственный препарат или как медицинское средство.

Сухой препарат I можно вводить субъекту мужского пола для повышения оплодотворяющей способности самцов. Субъект мужского пола является предпочтительно млекопитающим, таким как без ограничения человек или домашнее животное, например, бык, баран, хряк, конь, собака или кот.

Сухой препарат I можно вводить вместе с экстрактом II, содержащим соединения с антиоксидантной активностью. Экстракт II может являться экстрактом из пюре плодов Punica granatum (гранат) или экстрактом Terminalia catappa, или Terminalia myriocarpa, или Combretum molle. Такой экстракт можно получать путем превращения в пюре околоплодника плодов, например, путем превращения в пюре остатков выжатых фруктов, главным образом не содержащих сок, с последующей экстракцией. В качестве альтернативы целые фрукты можно превращать в пюре или измельчать перед экстракцией. В других вариантах осуществления сухой препарат I вводят вместе с растительным экстрактом II, содержащим по меньшей мере 20% пуникалагинов. В других вариантах осуществления растение, из которого получают экстракт II, является растением, выбранным из группы, состоящей из Punica granatum, Terminalia catappa, Terminalia citrina, Terminalia oblongata и Lumnitzera racemosa. В других вариантах осуществления растительный экстракт II получают из растения, выбранного из группы, состоящей из Rosa rugosa, Rosa canina, Aronia melanocarpa, Aronia prunifoloia, Aronia mitschurinii, Euterpe oleracea, Vaccinium spp., Lycium barbarum, Lycium chinense. Растительный экстракт II можно получать из Terminalia spp. или из любого растения, содержащего соединения с антиоксидантной активностью.

Растительный экстракт II

Растительный экстракт II можно получать способами, известными из уровня техники. Растение, из которого получают экстракт И, может являться растением, выбранным из группы, состоящей из Punica granatum, Terminalia catappa, Terminalia citrina, Terminalia oblongata и Lumnitzera racemosa. В других вариантах осуществления растительный экстракт II можно получать из растения, выбранного из группы, состоящей из Rosa rugosa, Rosa canina, Aronia melanocarpa, Aronia prunifoloia, Aronia mitschurinii, Euterpe oleracea, Vaccinium spp., Lycium barbarum, Lycium chinense. Экстракт II можно получать из околоплодника Punica granatum, из листьев Terminalia catappa, из плодов Terminalia citrina, из корней Terminalia macroptera, из листьев Terminalia myriocarpa, из листьев Terminalia oblongata, из листьев Combretum molle или из листьев Lumnitzera racemosa. Растительный экстракт II можно получать из любого вида Terminalia spp., содержащего соединения с антиоксидантной активностью. Предпочтительно, экстракт получают из околоплодника Punica granatum, например, путем превращения в пюре и получения экстракта из остатков выжатых плодов. Экстракт II предпочтительно является сухим экстрактом, таким как порошок или гранулят. В некоторых вариантах осуществления экстракт II можно получать из плодов Rosa rugosa, Rosa canina, Aronia melanocarpa, Aronia prunifoloia, Aronia mitschurinii, Euterpe oleracea, Vaccinium sp., Lycium barbarum, Lycium chinense. Другие способы получения экстракта II, хорошо известные из уровня техники, также входят в объем настоящего изобретения.

Конкретные варианты осуществления относятся к экстрактам II, содержащим по меньшей мере 40% полифенолов. Экстракт II предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере 30% пуникозидов и/или по меньшей мере 20% пуникалагинов.

Композиция

Композиции по настоящему изобретению могут являться такими, что отношение (вес/вес) сухого препарата I к экстракту II находится в диапазоне от 10:1 до 1:10, предпочтительно отношение составляет 3:4, еще более предпочтительно отношение составляет 1:4 или 1:5.

В одном варианте осуществления композиция, содержащая сухой препарат I и экстракт II, содержащий соединения с антиоксидантной активностью, является композицией, содержащей сухой препарат из A. galanga или A. conchigera и экстракт Punica granatum. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту с низким качеством спермы.

Низкое качество спермы может отражаться низким общим числом подвижных сперматозоидов (TMSC), таким как TMSC<15×10⁶. Низкое качество спермы также может отражаться низкой подвижностью сперматозоидов. В некоторых вариантах осуществления введение композиции, содержащей сухой препарат I по настоящему изобретению из A. galanga или A. conchigera и экстракт II из граната, субъекту мужского пола приводит к повышению качества спермы, например, оно приводит к увеличению TMSC и/или увеличению подвижности сперматозоидов, и/или увеличению сперматогенеза. Увеличение подвижности сперматозоидов может быть отражено улучшением степени подвижности, например, улучшением от степени d до степени c, от степени c до степени b, от степени b до степени a.

Конкретные варианты осуществления относятся к применению композиции, которая раскрыта в данном документе, для улучшения оплодотворяющей способности самцов путем введения субъекту мужского пола в течение периода по меньшей мере 30 дней, например, по меньшей мере 50 дней, например, по меньшей мере 100 дней, например, по меньшей мере 150 дней. Предпочтительно, композицию вводят по меньшей мере до зачатия субъектом потомства.

Другие варианты осуществления относятся к применению композиции, которая раскрыта в данном документе, для улучшения оплодотворяющей способности самцов путем введения субъекту мужского пола. Предпочтительно, сухой препарат I в композиции находится в дозе по меньшей мере 100 мг препарата/сутки, например, по меньшей мере 125 мг препарата/сутки, например, по меньшей мере 250 мг препарата/сутки, например, от 250 до 3000 мг препарата/сутки, предпочтительно по меньшей мере 500 мг препарата/сутки, например, 225 мг препарата/сутки. Другие варианты осуществления относятся к применению композиции для улучшения оплодотворяющей способности самцов путем введения субъекту мужского пола в дозе по меньшей мере 2 мг АСА/сутки, например, от 5 до 50 мг АСА/сутки, предпочтительно по меньшей мере 10 мг АСА/сутки.

В некоторых вариантах осуществления оплодотворяющая способность самцов улучшается путем введения сухого препарата I из A. galanga или A. conchigera и экстракта II субъекту мужского пола. Экстракт II предпочтительно содержит по меньшей мере 40% полифенолов, по меньшей мере 30% пуникозидов и/или по меньшей мере 20% пуникалагинов. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту мужского пола в дозе по меньшей мере 75 мг пуникалагинов/сутки, например, от 75 мг/сутки до 600 мг/сутки, например, от 100 мг/сутки до 500 мг/сутки, предпочтительно по меньшей мере 300 мг/сутки. В некоторых вариантах осуществления доза пуникозидов составляет по меньшей мере 100 мг/сутки, например, от 100 мг/сутки до 800 мг/сутки, например, от 100 мг/сутки до 600 мг/сутки, предпочтительно по меньшей мере 400 мг/сутки. Доза полифенолов составляет по меньшей мере 125 мг/сутки, например, от 125 мг/сутки до 1000 мг/сутки, например, от 123 мг/сутки до 700 мг/сутки, предпочтительно по меньшей мере 500 мг/сутки. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит сухой препарат I из корневищ Alpinia galanga и экстракт II выжимок Punica granatum.

Композицию по настоящему изобретению можно вводить в состав, предпочтительно состав для приема внутрь, такой как лекарственный препарат, биологически активная пищевая добавка, пищевая добавка или продукт лечебного питания, или продукт питания для специального медицинского назначения. Данный состав может содержать другие ингредиенты, такие как без ограничения вспомогательное вещество, покрывающее средство, вкусоароматическое средство. Данную композицию можно вводить в состав таблетки, пилюли, капсулы, порошка или гранулята. Другие составы, подходящие для данной цели, будут очевидны специалисту в данной области и также предусмотрены. Предпочтительно, сухой препарат I гомогенизируют перед составлением композиции. Композицию можно составлять в виде отдельных составов, где первое средство содержит сухой препарат I, и второе средство содержит экстракт II. В качестве альтернативы, композицию можно составлять в виде одного состава.

Настоящее изобретение также относится к способу повышения качества спермы, при этом указанный способ включает стадию введения композиции, которая описана выше, субъекту мужского пола. Композицию можно вводить в виде лекарственного препарата для приема внутрь, в виде медицинского средства, биологически активной пищевой добавки, пищевой добавки или продукта лечебного питания, или продукта питания для специального медицинского назначения. Предпочтительно, сухой препарат I в композиции находится в дозе по меньшей мере 100 мг препарата I/сутки, например, по меньшей мере 125 мг препарата I/сутки, например, по меньшей мере 250 мг препарата I/сутки, например, от 250 до 3000 мг препарата I/сутки, предпочтительно по меньшей мере 500 мг препарата I/сутки, например, 225 мг препарата I/сутки. Другие варианты осуществления относятся к применению композиции для улучшения оплодотворяющей способности самцов путем введения субъекту мужского пола в дозе по меньшей мере 2 мг АСА/сутки, например, от 5 до 50 мг АСА/сутки, предпочтительно по меньшей мере 10 мг АСА/сутки. Экстракт II содержит предпочтительно по меньшей мере 40% полифенолов, по меньшей мере 30% пуникозидов и по меньшей мере 20% пуникалагинов. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту мужского пола в дозе по меньшей мере 75 мг пуникалагинов/сутки, например, от 75 мг/сутки до 600 мг/сутки, например, от 100 мг/сутки до 500 мг/сутки, предпочтительно по меньшей мере 300 мг/сутки. В некоторых вариантах осуществления доза пуникозидов составляет по меньшей мере 100 мг/сутки, например, от 100 мг/сутки до 800 мг/сутки, например, от 100 мг/сутки до 600 мг/сутки, предпочтительно по меньшей мере 400 мг/сутки. Доза полифенолов составляет по меньшей мере 125 мг/сутки, например, от 125 мг/сутки до 1000 мг/сутки, например, от 125 мг/сутки до 700 мг/сутки, предпочтительно по меньшей мере 500 мг/сутки. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит сухой препарат I из корневищ Alpinia galanga и экстракт II из выжимок Punica granatum.

Также в данном документе раскрывается способ повышения качества спермы у субъекта мужского пола с низким или нормальным качеством сперматозоидов. Субъект может иметь азооспермию, олигоспермию, низкое общее число подвижных сперматозоидов, низкую подвижность сперматозоидов. Субъект мужского пола может являться человеком. Настоящее изобретение представляет особый интерес для тех людей, чье качество сперматозоидов снижено как следствие образа жизни, например, в связи с курением, высоким уровнем потребления кофе, стрессом, алкоголем. В других вариантах осуществления субъект мужского пола выбирают из группы, состоящей из самцов домашних животных, особенно животных, для которых производство потомства может являться особенно актуальным, таких как без ограничения, бык, конь, баран, хряк, кролик, собака или кот.

В другом аспекте композиции по настоящему изобретению можно вводить для предотвращения гипертензии, гипотензии, окисления липидов высокой плотности, окисления липидов низкой плотности, атеросклероза, окислительного стресса в организме, развития простудных заболеваний, инфекций мочевых путей, бактериальных, вирусных или грибковых инфекций, импотенции, изменений веса, повреждения ДНК и клеточной мембраны, вызванного свободными радикалами, для регулирования уровня тестостерона и/или общего уровня андрогена в сыворотке, для повышения выносливости, психической или физической энергии, для уменьшения нервно-психического напряжения, для повышения потенции или сексуальной активности.

На основании результатов, приведенных в примерах ниже, авторы настоящего изобретения выдвигают гипотезу о том, что комбинация АСА и полифенольных соединений, таких как пуникозиды, включая пуникалагины и/или пуникалины, вызывает лечебно-профилактические эффекты, такие как предотвращение гипертензии, гипотензии, окисления липидов высокой плотности, окисления липидов низкой плотности, атеросклероза, окислительного стресса в организме, развития простудных заболеваний, инфекций мочевых путей, бактериальных, вирусных или грибковых инфекций, импотенции, изменений веса, повреждения ДНК и клеточной мембраны, вызванного свободными радикалами, для регулирования уровня тестостерона и/или общего уровня андрогена в сыворотке, для повышения выносливости, психической или физической энергии, для уменьшения нервно-психического напряжения, для повышения потенции или сексуальной активности.

Примеры

Пример 1

Свежие корневища Alpinia galanga собирали и стебли, растущие из корневища, обрезали во время сбора в 10-20 см над основанием. Апикальные побеги оставляли нетронутыми на корневище. Корневища хранили в охлажденном состоянии все время (0-5°С). Незадолго до лиофилизации или замораживания стебли корневищ обрезали у основания и корневища разделяли в продольном направлении для обеспечения перехода паров воды в газообразную фазу в течение процесса лиофилизации. После процесса разделения корневища замораживали при -18°С до лиофилизации.

Корневища лиофилизировали при следующих условиях:

стадия 1: 10 ч. при 47°С;

стадия 2: 6 ч. при 52°С;

стадия 3: 4 ч., линейное снижение температуры до 37°С;

стадия 4: 90 мин. при 37°С;

стадия 5: завершение/устранение вакуума.

Давление поддерживали на уровне 1,5 мбар путем подачи азота.

Микробиологические подсчеты проводились в отношении высушенных корневищ после лиофилизации (таблица 1).

После высушивания содержание воды в корневищах A. galanga составляло 2-5%.

Высушенные корневища затем переносили в газо- и запахонепроницаемый герметичный пакет из фольги и сохраняли в бескислородном газе (азот) в течение 14 дней с целью устранения или уменьшения присутствия аэробных микроорганизмов.

Характеристики пакета из фольги:

(WMPET12/DRY/LPDE Film 100) общая толщина фольги 114 мкм;

размеры 720 мм (W) * 1190 мм (L);

производитель: Won Ji Canada Corp.

После хранения газо- и запахонепроницаемые пакеты с высушенными корневищами переносили в нагревательную печь на 3 часа при 75±3°C с целью дополнительного уменьшения количества микроорганизмов в продукте.

Микробиологические подсчеты осуществляли в отношении высушенных корневищ после данной стадии (таблица 3).

После лиофилизации, хранения в бескислородной атмосфере азота (<3% кислорода) и нагревания корневищ в пакетах из фольги, проводили аналитические исследования по определению уровней АСА после экстракции этанолом и последующим количественным определением с помощью GC-MS. Уровень АСА в сухих корнях составлял 4,03% (с содержанием воды в корневищах 3%). Пример GC-MS-хроматограммы количественного определения АСА, извлеченного из лиофилизированных корневищ AG, представлен на фигуре 1. Примеры GC-хроматограмм экстрактов из препарата лиофилизированных корневищ Alpinia galanga (фигура 1) и свежих корневищ (фигура 2) отчетливо показывают, что АСА (1'S-1'-ацетоксихавиколацетат) является преобладающим соединением в корневищах Alpinia galanga. Количественное определение осуществляли с применением калибровочной кривой по внешнему стандарту АСА (фигура 3).

Пример 2

Порошок корня Alpinia galanga (2 г) (коммерческий экстракт 2) подвергли экстракции с использованием 10 мл дихлорметана в закрытой колбе (25 мл) с синим колпачком в течение ночи в темноте, перемешивая при комнатной температуре. Отфильтрованный дихлорметановый экстракт анализировали непосредственно с помощью GC-MS (70 эВ). Основной пик на хроматограмме (не показан) с временем удерживания 26,16 мин. соответствует молекулярному иону с m/z 164 и основным фрагментным ионам с m/z 131 и 133 (пики базовой линии), что указывает на то, что он весьма близок к эвгенолу и/или хавиколу. Поиск в базе данных MS не дал явных кандидатов, но молекулярный ион и фрагменты показывают, что соединение может являться метиловым эфиром 1-гидроксихавикола. Кроме того, можно сделать вывод, что экстракт содержал только следовые количества характерных маркерных соединений корней Galanga, таких как 1'S-1'-ацетоксихавиколацетат (АСА), гидроксихавиколацетат (НСА) или 1'S-1'-ацетоксиэвгенолацетат. В таблице 3 показан сравнительный анализ нескольких препаратов Alpinia galanga и содержание АСА.

Пример 3

Ниже показан пример состава по настоящему изобретению на основе сухого препарата А. galanga (таблица 4).

Пример 4

На таблице 5 показан пример получения состава таблеток, содержащих сухой препарат А. galanga и этаноловый экстракт P. granatum (экстракт выжимок).

Пример 5.

Клиническое исследование

Эффекты введения сухого препарата A. galanga вместе с экстрактом P. granatum на качество спермы исследовали на субъектах мужского пола в рандомизированном, двойном слепом, плацебо-контролируемом клиническом исследовании. Цель исследования состояла в определении эффективности лечения растительными препаратами по сравнению с плацебо. Период исследования длился 3 месяца (90 дней) в целях охвата полного цикла образования сперматозоидов (72-74 сутки).

Критерии включения и исключения

Участников исследования набирали в Nordic Cryobank (отвергнутых в качестве доноров спермы в связи с относительно низкими количествами сперматозоидов), в клинике планирования семьи (Fertility Clinic) при Region Hospital Horsens, Дания, и посредством рекламы в местных газетах. Критериями включения являлись два исходных образца спермы, причем каждый демонстрировал общее число подвижных сперматозоидов (TMSC)<200×10⁶. Потенциальным участникам исследования, которые удовлетворяли данному требованию, затем следовало заполнить опросный лист об образе жизни, прежних заболеваниях и употреблении лекарственных средств, чтобы убедиться в том, что причина низкого качества спермы не связана с очевидными медицинскими причинами, такими как крипторхизм или инфекция половых путей. Другим критерием исключения являлась азооспермия. Участников исследования не осматривал врач перед включением. В остальном возраст участников исследования должен составлять по меньшей мере 18 лет. По окончании исследования участники заполняли другой опросный лист с целью изучения возникновения любых отрицательных или положительных побочных эффектов.

Отбор образцов

Образцы спермы отбирали в Nordic Cryobank, Arhus, или в Region Hospital Horsens. Образцы, отобранные в Nordic Cryobank, выдерживали при температуре тела в течение нескольких часов перед транспортировкой в Region Hospital Horsens, где их анализировали.

Участники исследования

В пределах временного графика исследования явилось возможным набрать 70 мужчин. Четверо из этих мужчин не приняли участие в исследовании по неизвестным причинам. Среди оставшихся 66 участников у 11 мужчин качество спермы на момент начала исследования составляло TMSC<40×10⁶. Таким образом, у меньшинства включенных мужчин качество спермы являлось нормальным, как определено с помощью TMSC.

В общей сложности 32 мужчины получили лечение, в то время как 34 мужчины получали плацебо. Один участник исследования в лечебной группе получил только одно значение в последний момент времени последующего наблюдения.

Рандомизация и маскирование

Единицей рандомизации являлся каждый индивидуум. Участников исследования рандомизировали в равной мере в лечебную группу или группу плацебо внутри блоков из 10.

Данные маскировались для врача-исследователя, лаборанта, участников исследования и статистика.

Измерение

Качество спермы измеряли дважды перед началом лечения с интервалом в 4-10 дней между двумя измерениями. Среднее значение двух данных измерений обозначалось как исходное значение. Качество спермы измеряли вновь через 4-8 дней после начала лечения с целью проверки наличия острого эффекта лечения. Наконец, качество спермы измеряли два раза в конце периода лечения (90 дней) с интервалом между двумя измерениями 4-10 дней. Среднее значение двух данных измерений обозначалось как значение в конечный момент времени последующего наблюдения.

Основной результат

Основным результатом являлось изменение качества спермы, выраженное как общее число подвижных сперматозоидов (TMSC)/эякулят в течение периода исследования. TMSC определяют как объем эякулята × концентрацию сперматозоидов × процент подвижных сперматозоидов. Три данных параметра измеряли в соответствии со способами, описанными в лабораторном справочнике WHO по исследованию и обработке спермы человека (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen), 5^th Edition, WHO (2010). Основной результат рассчитывали как разницу между значением в конечный момент времени последующего наблюдения и исходным значением. Разницу между лечебной группой и группой плацебо в отношении данного результата анализировали с помощью t-критерия для выборок с неодинаковой дисперсией. Данный критерий учитывает неоднородность дисперсий между двумя группами и отклонение от нормального распределения. В качестве подтверждающего анализа все доверительные интервалы и p-значения рассчитывали с помощью бутстреп-метода.

Лечение по сравнению с плацебо

Как группа лечения, так и группа плацебо должны были принимать 2×4 таблетки каждые сутки, 4 - утром и 4 - вечером, если возможно, в комбинации с едой. Суточное лечение включало 4 таблетки с экстрактом Punica granatum и 4 таблетки с Alpinia galanga (по 2 каждого вида утром и по 2 каждого вида вечером). Од на таблетка с P. granatum содержала 250 мг экстракта, так что общая суточная доза составляла 1 г. Одна таблетка A. galanga содержала 191 мг измельченного материала, так что общая суточная доза составляла 764 мг. Участники получили все таблетки в начале исследования в двух отдельных контейнерах. Участники группы плацебо также получили все таблетки в двух разных контейнерах.

Суточная доза и активные соединения таблеток P. granatum

Суточная доза экстракта P. granatum составляла 1000 мг экстракта в сутки. Содержание основных эллагитаннинов в таблетках измеряли с помощью HPLC-анализов с получением следующих результатов.

Стандарты пуникалагинов А и В приобрели в Chromadex, в то время как стандарт пуникалина приобрели в Stanford Chemicals. Стандарт эллаговой кислоты приобрели в PhytoLab.

Исходя из данных результатов анализа, можно рассчитать содержание основных эллагитаннинов в экстракте.

Пуникалагин А: 7,9-11%;

пуникалагин В: 24-34%.

Таким образом, общее содержание пуникалагинов А+В составляет от 32% до 45%. Данное соответствует информации в спецификации на экстракт, которая гласит, что общее содержание пуникалагинов А+В в экстракте составляет ≥30%.

Суточная доза и активные соединения таблеток A. galanga

Суточная доза препарата калгана составляла 763,64 мг в сутки, что соответствует приблизительно 7 г свежих корневищ A. galanga.

Содержание АСА в таблетках измеряли с помощью GC/MS-анализа со следующим результатом:

3,9 мг АСА/таблетка; 16 мг АСА/4 таблетки (суточная доза).

Стандарт АСА приобрели в PhytoLab.

Содержание АСА в таблетках уменьшалось с течением времени, как показано в таблице 6. АСА является полулетучим фенилпропаноидом. При высоких температурах АСА может частично или полностью превращаться в 1-гидроксихавиколацетат, и/или п-ацетоксикоричный спирт, и/или п-кумарилдиацетат.

Последнее значение анализа через 21 месяц являлось средним для таблеток из двух разных контейнеров, хранившихся при различных температурах (приблизительно 5°С и комнатной температуре, соответственно). Температура хранения, по-видимому, не влияет на потерю АСА таблетками.

Состав таблеток P. granatum

Таблетки P. granatum содержали следующие ингредиенты (на таблетку): 250 мг экстракта P. granatum, стандартизованного до содержания пуникозидов 40% (эллагитаннины, пуникалагины и пуникалины). После экстракции 40%-ным этанолом пюре выжимок Р. granatum (15-20:1) следовало высушивание распылением.

2,55 мг диоксида кремния (Е 551);

75 мг бикарбоната натрия (E500ii);

122,2 мг микрокристаллической целлюлозы (Е 460);

5 мг силоида AL1 (Е 551);

5,25 мг стеарата магния (Е 470b).

Состав таблеток A. galanga

Таблетки A. galanga содержали следующие ингредиенты (на таблетку):

190,91 мг измельченного A. galanga;

18,00 мг талька (Е 553b);

194,30 мг микрокристаллической целлюлозы (Е 460);

54,27 мг силоида AL1 (Е 551);

4,00 мг стеарата магния (Е 470b).

Состав таблеток плацебо (P. granatum)

Таблетки плацебо, соответствующие таблеткам P. granatum, состояли из следующих ингредиентов (на таблетку):

167,6 мг бикарбоната натрия (E500ii);

296,6 мг микрокристаллической целлюлозы (Е 460);

2,35 мг силоида AL1 (Е 551);

5,15 мг стеарата магния (Е 470b).

Состав таблеток плацебо (А. galanga)

Таблетки плацебо, соответствующие таблеткам A. galanga, включали следующие ингредиенты (на таблетку):

460,85 мг микрокристаллической целлюлозы (Е 460);

6,00 мг силоида AL1 (Е 551);

5,15 мг стеарата магния (Е 470b).

Оболочка

Все таблетки покрывали белой пленочной оболочкой, включающей следующие соединения (на таблетку):

1,000 мг шеллака (Е 904);

0,621 мг пропиленгликоля (Е 1520);

1,055 мг талька (Е 553b);

2,917 мг диоксида титана (Е171);

3,103 мг гидроксипропилметилцеллюлозы (Е 464).

Кроме того, таблетки A. galanga и соответствующие таблетки плацебо окрашивали следующим пищевым красителем:

0,01 мг медных комплексов хлорофиллов (Е 141i).

Результаты

Введение комбинации вновь разработанной композиции Alpinia galanga и Punica granatum вызывало среднее увеличение 62% (Р=0,026) в TMSC у мужчин с низким качеством спермы после 90 дней лечения (таблица 7). В первой половине исследования, когда содержание АСА в композиции A. galanga являлось наивысшим, среднее увеличение числа сперматозоидов составляло 74% (Р=0,045) (таблица 7). Воздействия на число сперматозоидов только после 1 недели лечения не наблюдалось (таблица 7), что указывает на то, что наблюдаемые положительные эффекты можно объяснить скорее положительным влиянием на сперматогенез, чем антиоксидантной защитой зрелых сперматозоидов до или после эякуляции.

Увеличение TMSC от исходного уровня до конечного момента времени последующего наблюдения для каждого участника в группе растения и группе плацебо показано на фигуре 4.

Пример 6

Анализ ряда сухих экстрактов A. galanga, продаваемых в качестве сырья для биологически активных пищевых добавок, показал очень низкое содержание или отсутствие АСА в анализируемых продуктах. Содержание АСА в свежих корневищах является относительно высоким (до 11% DW). Возможно, что значительная или, в некоторых случаях, общая потеря АСА в конечных продуктах, может происходить вследствие либо 1) одной или нескольких методологических стадий преобразования свежих корневищ в сухие порошки, подходящие для включения в таблетки, и/либо 2) потери при хранении до или после изготовления сухих экстрактов или таблеток.

Разрушение основного активного соединения в A. galanga, АСА, может быть инициировано посредством гидролиза при наличии воды и повышенных температур.

Кроме того, наши первоначальные тесты на препаратах A. galanga, полученных путем помола лиофилизированных корневищ в порошок, показали, что волокна корневища обладают иной плотностью и структурой по сравнению с остальными компонентами, получаемыми с помощью процесса помола. Равномерное включение данной неоднородной смеси легких волокон и более тяжелых компонентов в таблетки являлось невозможным, т.е., первые полученные таблетки содержали бы большую часть более тяжелых фрагментов по сравнению с полученными в конце процесса производства таблеток, поскольку более мелкие и более тяжелые фрагменты перемещались бы к основанию воронки, подающей материал в таблетировочную машину.

С целью получения равномерного распределения волокон и других фракций в таблетках разработали безводный и низкотемпературный способ гранулирования сухого препарата.

Перед лиофилизацией корневища разделяли или нарезали, как описано выше.

В дальнейшем, разделенные или нарезанные лиофилизированные корневища размалывали на мельнице Co-mill, оснащенной системой охлаждения воздуха во избежание нагревания корневищ в течение процесса растирания. Жесткие волокна, присутствующие в корневищах, вызывают значительное трение в процессе растирания. Наши начальные эксперименты показали, что температура в порошке может достигать 50°С или выше, что, как ожидается, ускорит гидролиз АСА. В связи с этим мы применили в мельнице стандартную систему охлаждения воздуха, которая удерживала температуру ниже 30°С. Количественное определение содержания АСА с помощью GC не показало значительной потери АСА после помола с применением системы охлаждения и после последовательного уменьшения размера на серии сит: вначале на сите 12 мм, затем на сите 2 мм и, наконец, на сите 1 мм. Распределение частиц по размеру с применением данной серии сит представлено в таблице 8.

Как упоминалось выше, порошок необходимо превратить в гомогенную смесь с более высокой плотностью с целью включения его в таблетки.

С этой целью в промышленности существует стандартная процедура применения связующего вещества (например, поливинилпирролидона), растворенного в относительно большом количестве (в процентах) воды и, например, органического растворителя, такого как этанол. Мы разработали способ растворения связующего вещества (7,5% поливинилпирролидона (PVP 90)) в 99,5% этаноле с целью уменьшения гидролиза АСА. Дополнительно температуру снижали до 30°С. Это важно, поскольку в лиофилизированных корнях все еще присутствует некоторое количество воды, которое может гидролизовать АСА или другие соединения. Процесс грануляции осуществляли в вакууме при 40-50°С. После грануляции растворитель высушивали в вакууме при температуре ниже 30°С. Данное действие не вызывало значительной потери АСА.

PVP90 растворяли в 99,5% этаноле (91,5% вес/вес этанола, 8,5% вес/вес PVP90). Сухой препарат A. galanga смешивали с PVP90 в качестве связующего вещества (92,5% вес/вес сухого препарата, 7,5% вес/вес PVP90). Изготавливали таблетки, при этом каждая таблетка весила 457,50 мг и содержала 7,50 мг оболочки и 120 мг гранулята (что соответствует 111 мг сухого препарата).

Процесс гранулирования приводил к увеличению плотности порошка с 12 г/100 мл до 27 г/100 мл (угол естественного откоса: 39°). Гранулированный порошок дополнительно размалывали на мельнице Co-mil с применением сита 1 мм. Гранулированный порошок теперь являлся пригодным для включения в таблетки.

Мы сравнили содержание АСА в лиофилизированных корневищах с таковым в порошке (перед гранулированием) и также с содержанием АСА после гранулирования. Содержание АСА в трех продуктах статистически не различалось (от 7,9% до 8,1%), демонстрируя, что посредством способов, описываемых в данном документе, сохраняется содержание АСА в лиофилизированных корнях.

Гранулированный порошок включали в таблетки, применяя стандартную процедуру в данной отрасли. Данная процедура не вызвала существенных изменений в содержании АСА в гранулированном порошке (от 7,9 до 8,1%).

Литературные источники

Islam, M.W., Zakaria, M.N.M., Radhakrishnan, R., Liu, X.-M., Ismail, A., Chan, K., and Al-Attas, A. (2000): Galangal (Alpinia galanga Willed.) and Black seeds (Nigella sativa Linn.) and sexual stimulation in male mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology 52 (Suppl.), 278-278.

Leiva, K.P., Rubio, J., Peralta, F., and Gonzales, G.F. (2011): Effect of Punica granatum (pomegranate) on sperm production in male rats treated with lead acetate. Toxicol. Mech. Methods 21, 6, 495-502.

Qureshi, S., Shah, A.H., and Ageel, A.M. (1992): Toxicity Studies on Alpinia-Galanga and Curcuma-Longa. Planta Medica 58, 2, 124-127.

Реферат

Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции для улучшения качества спермы у субъекта мужского пола. Композиция для улучшения качества спермы у субъекта мужского пола, содержащая i) сухой препарат I из корневищ Alpinia galanga или Alpinia conchigera, содержащий по меньшей мере 2% по массе 1'S-1'-ацетоксихавиколацетата, и ii) растительный экстракт II, содержащий соединения с антиоксидантной активностью, получаемые из Punica granatum, где отношение (вес./вес.) между сухим препаратом I и экстрактом II находится в диапазоне от 10:1 до 1:10. Способ лечения мужского бесплодия, обусловленного низким числом сперматозоидов и/или низкой подвижностью сперматозоидов. Набор для улучшения качества спермы у субъекта мужского пола. Вышеописанная композиция эффективна для улучшения качества спермы у субъекта мужского пола. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 4 ил., 8 табл., 6 пр.

Формула