Гидроксиматаирезинол в профилактике рака - RU2241453C2
Код документа: RU2241453C2
Чертежи
Описание
Область изобретения
Данное изобретение относится к способам профилактики раковых заболеваний, некоторых нераковых заболеваний, гормонально зависимых заболеваний и/или сердечно-сосудистых заболеваний у человека, основанным на введении указанному человеку гидроксиматаирезинола. Изобретение также касается способа повышения уровня энтеролактона или другого метаболита гидроксиматаирезинола в сыворотке человека, вызывая, таким образом, профилактику рака или некоторого неракового, гормонально зависимого заболевания у человека, основанную на введении указанному человеку гидроксиматаирезинола. Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтическим препаратам, пищевым добавкам и пищевым продуктам, включающим гидроксиматаирезинол.
Публикации и другие материалы, используемые в данном описании для раскрытия уровня техники, и, в частности, случаи, раскрываемые дополнительные детали, относящиеся к практике, включены сюда в качестве ссылки.
Лигнаны определяются как класс фенольных соединений, обладающих каркасом 2,3-дибензилбутана. Они образованы соединением мономерных единиц, называемых предшественниками, таких как коричная кислота, кофеиновая, феруловая, кумаровая и галловая кислоты (Ayres and Loike, 1990). Лигнаны широко распределены в растениях. Их можно обнаружить в различных частях (корни, листья, ствол, семена, фрукты), но, главным образом, в небольших количествах. Во многих источниках (семена, фрукты) лигнаны обнаруживаются в виде конъюгатов гликозидов, связанных с волокнистым компонентом растений. Наиболее распространенными пищевыми источниками предшественников лигнанов млекопитающих являются неочищенные зерновые продукты. Самые высокие концентрации в съедобных растениях были обнаружены в льняном семени, затем в неочищенных зерновых продуктах, в частности во ржи.
Продукция лигнанов млекопитающих из различной растительной пищи представлена в табл.1.
Значительные количества лигнанов обнаруживаются также в хвойных деревьях. Тип лигнанов отличается у различных видов и количество лигнанов варьирует в различных частях деревьев. Типичными лигнанами в сердцевине ели (Picea abies) являются гидроксиматаирезинол (ГМР), α-конидендрин, конидендриновая кислота, матаирезинол, изоларицирезинол, секоизоларицирезинол, лиовил, пицеаризенол, ларицирезинол и пинорезинол (Ekman, 1979). Намного превосходящим по количеству другие лигнаны одиночным компонентом лигнанов в ели является ГМР, составляющий около 60% общего содержания лигнанов, который встречается, главным образом, в неконъюгированной свободной форме. Концентрация лигнанов в толстых корнях составляет 2-3%. Обилие лигнанов обнаруживается в сердцевине ветвей (5-10%) и в изгибах и особенно в свилях, где количество лигнанов может превышать 10% (Ekman, 1976 и 1979). Эти концентрации приблизительно в 100 раз выше по сравнению с измельченными в порошок семенами льна, известными как материал, богатый лигнанами.
Химическая структура гидроксиматаирезинола выглядит так
Лигнаны можно выделить, например, из сжатого древесного волокна. Эти волокна, полученные из сжатой древесины стволов и сучков (фракция обрезков большого размера, остающихся при распиле древесины), ухудшают качество бумаги (Ekman, 1976).
Растительные лигнаны, такие как матаирезинол и секоизоларицирезинол, превращаются микрофлорой кишечника в лигнаны млекопитающих, соответственно в энтеролактон и энтеродиол (Axelson et al., 1982). Они подвергаются кишечно-печеночной циркуляции и выводятся с мочой в виде конъюгатов глюкуронида (Alexon and Setchell, 1981). В качестве экспериментального доказательства химиопрофилактического действия лигнанов добавление в рацион с высоким содержанием жира муки из льняного семени, богатой лигнанами (5% или 10%), или лигнанов льняного семени (секоизоларицирезинол-дигликозид, СДГ) предотвращало развитие чувствительного к антиэстрогенам рака молочной железы, вызванного у крыс диметилбензантраценом (ДМБА, DMBA) (Serraino and Thompson, 1991 и 1992; Thompson et al., 1996a и 1996b). Они уменьшали пролиферацию эпителиальных клеток, ядерные аберрации, рост опухолей и развитие новых опухолей. Высокое потребление лигнанов может также защитить от экспериментального рака предстательной железы и толстой кишки. Включение в рацион ржи (содержащей лигнаны) предотвращало на ранних стадиях рост трансплантированных аденокарцином предстательной железы Dunning R3327 у крыс (Zhang et al., 1997; Landstrom et al., 1998). Процентная доля животных, пораженных пальпируемыми опухолями, объем опухоли и скорость роста были статистически значимо ниже. Кроме того, добавление льняного семени или СДГ ингибировало образование химически вызванных аберрантных крипт в толстой кишке крыс (Serraino and Thompson, 1992; Jenab and Thompson,1996). Поэтому противоопухолевое действие может быть вызвано слабыми, подобными эстрогенам-антиэстрогенам свойствами, и/или другими механизмами, которые недостаточно хорошо выяснены.
У женщин с диагностированным раком молочных желез выделение энтеролактона с мочой и его концентрация в сыворотке низкие (Ingram et al., 1997; Hulten et al., 1998), что свидетельствует о химиопрофилактическом действии лигнанов. Была выдвинута гипотеза о том, что лигнаны млекопитающих (энтеролактон и энтеродиол) модулируют гормонально связанные формы рака, такие как рак молочной железы, ввиду их структурной аналогии с эстрогенами. Энтеролактон оказывал слабое эстрогенное действие на клетки MCF-7 (Mousavi and Adlercreutz, 1992), но не обладал эстрогенной реакцией (ответом) в отношении массы матки мышей (Setchell et al., 1981). В качестве признака активности, подобной эстрогену, скармливание крысам СДГ во время беременности и лактации увеличивало массу матки при отъеме от груди, но этот эффект не был очевиден на более поздних стадиях (Той et al., 1998). Возможные противоопухолевые эффекты были также связаны с их антиэстрогенными воздействиями (Waters and Knowler, 1982). Ингибирование ароматазы лигнаном млекопитающих энтеролактоном должно было бы предложить механизм, с помощью которого потребление богатой лигнанами растительной пищи могло бы способствовать снижению частоты эстрогенозависимых заболеваний, таких как рак молочной железы (Adlercreutz et al., 1993; Wang et al., 1994). Возможная антиоксидантная активность лигнанов также могла бы представить механизм, связанный с профилактическим действием лигнанов при развитии различных видов рака. Кроме того, было показано, что лигнаны млекопитающих ингибируют превращение тестостерона в 5α-дигидротестостерон (ДГТ), мощный внутриклеточный андроген, в концентрациях, которые можно достичь у людей (Evans et al., 1995). Снижение концентрации ДГТ должно было бы модифицировать риск рака предстательной железы (РПЖ) и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ).
Возможно, что лигнаны в качестве предшественников энтеролактона могли бы также облегчить симптомы со стороны нижних отделов мочевыводящих путей (СНОМП) и гинекомастию. На основании результатов, полученных на экспериментальной модели, было высказано предположение, что эстрогены играют существенную роль в развитии нарушения функции мышц, участвующей в диссинергии уретры, проявляемой в виде диссинергии шейки мочевого пузыря или ложной диссинергии наружного сфинктера (Streng et al., неопубликованные наблюдения). Такие нервно-мышечные изменения, по крайней мере, частично устраняются с помощью ингибитора ароматазы (MPV-2213ad), свидетельствуя о роли эстрогенов. Кроме того, гинекомастию, которая вызывается воздействием эстрогенов или развивается в присутствии возросшего соотношения между эстрогенами и андрогенами, можно успешно лечить ингибитором ароматазы. Способность лигнанов ингибировать 5α-редуктазу и/или ароматазу в комбинации с их потенциальной антиоксидантной активностью может представлять механизмы, связанные с профилактическим действием лигнанов при развитии гормонально связанных заболеваний в мужском организме.
Отсутствуют данные о возможных эффектах лигнанов у людей. Современные теории о действии лигнанов у людей были получены на основании исследований по влиянию пищевых рационов с добавлением продуктов льняного семени (а значит лигнанов). Льняное семя в рационе женщин вызывало изменения менструального цикла (Phipps et al., 1993). У исследуемых лиц, которые все были женщинами с нормальным менструальным циклом, было выявлено удлинение средней продолжительности лютеальной фазы и более высокое соотношение прогестерон/17β-эстрадиол в сыворотке во время лютеальной фазы, когда они принимали 10 г порошка льняного семени / в день в дополнение к их привычным пищевым рационам (Phipps et al., 1993). He было обнаружено статистически значимых различий между циклами на фоне приема льняного семени и в контроле или концентраций и эстрона, и 17β-эстрадиола. Не было также каких-либо статистически значимых различий между группой, принимавшей льняное семя, и контрольной группой по концентрации эстрогенов в сыворотке у женщин в постменопаузе (Brzezinski et al., 1997). Добавление льняного семени увеличивало концентрацию глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ, SНВG) (белка, который обладает высокой способностью связывать эстрадиол) в сыворотке. Это представляет типичный эстрогенный эффект в ткани печени. С другой стороны, повышенная концентрация ГСПГ снижает биологическую доступность эндогенных эстрогенов. У здоровых молодых мужчин кратковременное (6 нед.) добавление льняного семени в рацион (10 г/д в оладьях) не оказывало статистически значимого эффекта на концентрацию тестостерона в плазме (Shultz et al., 1991), указывая на отсутствие эстрогенности в мужском организме. Все эти исследования вместе показывают, что лигнаны могут оказывать слабые гормональные (эстрогенные и антиэстрогенные) эффекты, но механизм их действия не может быть полностью описан гормональными эффектами.
В заключение, выделенные лигнаны млекопитающих не были ранее доступны в количествах, достаточных для использования в экспериментах на животных или в клинических испытаниях, и единственной возможностью увеличить потребление лигнанов было увеличение потребления богатых волокнами пищевых продуктов, таких как льняное семя. ГМР или любой другой лигнан, который эффективно превращается в энтеролактон и может производиться/выделяться в больших количествах, имел бы ценность при разработке фармацевтических препаратов и пищевых продуктов, таких как функциональные пищевые продукты, для химиопрофилактики рака и других гормонально связанных заболеваний и сердечно-сосудистых заболеваний.
В соответствии с одним аспектом, данное изобретение относится к способу профилактики рака, некоторого неракового заболевания, гормонально зависимого заболевания и/или сердечно-сосудистого заболевания у человека, включающему введение указанному человеку эффективного количества гидроксиматаирезинола или его геометрического изомера или стереоизомера.
В соответствии с другим аспектом, изобретение относится к способу повышения уровня энтеролактона или другого метаболита гидроксиматаирезинола в сыворотке человека, вызывая посредством этого профилактику рака или некоторого неракового заболевания, гормонально зависимого заболевания у человека, включающему введение указанному человеку эффективного количества гидроксиматаирезинола или его геометрического изомера или стереоизомера.
В соответствии с третьим аспектом, изобретение относится к фармацевтическому препарату, включающему эффективное количество гидроксиматаирезинола или его геометрического изомера или стереоизомера в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
В соответствии с четвертым аспектом, изобретение относится к продукту, включающему жидкий или твердый материал, обогащенный гидроксиматаирезинолом или его геометрическим изомером или стереоизомером, для применения в качестве добавки к пищевому продукту.
В соответствии с пятым аспектом, изобретение относится к пищевому продукту, включающему эффективное количество гидроксиматаирезинола или его геометрического изомера или стереоизомера.
В соответствии с еще одним аспектом, изобретение относится к способу увеличения устойчивости пищевого продукта, включающему добавление в указанный пищевой продукт эффективного количества гидроксиматаирезинола или его геометрического изомера или стереоизомера.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показано ингибирование ароматазы в клетках JEG-3 в зависимости от концентрации лигнанов.
На фиг.2 показана пролиферация клеток MCF-7 в присутствии и в отсутствие ГМР.
На фиг.3 показана влажная масса матки неполовозрелых крыс при применении ГМР или ингибитора ароматазы.
На фиг.4 показана противоопухолевая активность ГМР против опухолей молочных желез, вызванных у самок крыс ДМБА.
На фиг.5 показано выведение энтеролактона с мочой крыс, леченных различными дозами ГМР.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к использованию гидроксиматаирезинола (ГМР) для профилактики рака, неракового заболевания, гормонально зависимых заболеваний и сердечно-сосудистых заболеваний путем добавления указанного ГМР в пищу или с помощью применения его в виде фармацевтического препарата. К удивлению, ГМР метаболизируется in vivo в энтеролактон, который, как предполагается, по меньшей мере, частично, ответственен за противоопухолевые свойства лигнанов. Антиоксидантная активность ГМР in vitro сильно выражена, и это свойство указывает на то, что ГМР может также предотвращать сердечно-сосудистые заболевания посредством защитного действия против повреждающих видов свободного кислорода в организме. Изобретение относится также к использованию ГМР в качестве пищевой добавки для увеличения устойчивости пищи (т.е. ингибирования окисления липидов и пигментов и потерь витаминов, которые вызывают потерю питательной ценности и развитие неприятного запаха пищи).
Способ в соответствии с данным изобретением особенно эффективен при профилактике различных видов рака, таких как рак молочной железы, рак предстательной железы и рак толстой кишки, нераковых заболеваний, гормонально зависимых заболеваний, таких как симптомы со стороны нижних отделов мочевыводящих путей, диссинергия уретры, неустойчивость мочевого пузыря, обструкция выводного тракта мочевого пузыря, доброкачественная гиперплазия предстательной железы и гинекомастия у мужчин и сердечно-сосудистые заболевания, возникающие в результате наличия окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛНП) в сыворотке.
Фармацевтический препарат в соответствии с данным изобретением представляет предпочтительно оральную композицию. Требуемое количество активного соединения (ГМР) будет варьироваться в зависимости от конкретного заболевания, профилактика которого предполагается. Обычная доза для взрослого человека находится в диапазоне от около 10 до около 100 мг/д.
В пищевой добавке изобретения материал, который предстоит обогатить гидроксиматаирезинолом, может представлять любой съедобный, нетоксичный твердый или жидкий материал, подходящий для смешивания с ГМР без влияния на свойства ГМР. Роль материала состоит главным образом в облегчении приготовления точной дозировки ГМР. Подходящая концентрация составляет, например, от 100 мг до 1 г ГМР на 100 г обогащенного материала.
Пищевой продукт в соответствии с данным изобретением представляет, в частности, функциональный пищевой продукт, питательную добавку, питательное вещество, фармацевтический пищевой продукт, питательный пищевой продукт, оздоровительный пищевой продукт, экспериментальный пищевой продукт или любой пищевой продукт. Подходящая концентрация ГМР в пищевом продукте составляет, например, от 1 до 20 мг ГМР на 100 г пищевого продукта.
Функциональный пищевой продукт в соответствии с данным изобретением может быть, например, в форме масла, маргарина, бисквитов, хлеба, торта, конфеты, кондитерского изделия, йогурта или другого ферментированного молочного продукта или каши, такой как мюсли.
Добавление гидроксиматаирезинола может, в частности, использоваться для увеличения устойчивости пищи, т.е. ингибирования окисления липидов и пигментов, которое вызывает потерю питательной ценности, и развитие неприятного запаха пищи. Подходящая концентрация ГМР для этой цели составляет, например, около 0,1%.
Выделение ГМР для использования в данном изобретении может производиться из фракции обрезков большого размера, остающихся при распиле древесины (содержащих ветви, изгибы и свили) сжатой древесины и ГМР может применяться при профилактике заболеваний, таких как рак и сердечно-сосудистые заболевания.
Свойства ГМР были изучены с помощью семи различных количественных анализов.
1. Измерение антиоксидантной способности in vitro.
2. Измерение способности ингибировать ароматазу в клетках JEG-3.
3. Измерение эстрогенной и антиэстрогенной активности в культурах клеток MCF-7.
4. Оценка эстрогенной и антиэстрогенной активности биологическим анализом роста матки.
5. Измерение эстрогенной и антиэстрогенной активности у взрослых самцов крыс.
6. Исследование противоопухолевой активности на модели рака молочной железы, вызванного у крыс ДМБА.
7. Анализ метаболитов из матки крыс после введения различных доз ГМР
Ранее выделение и очистка ГМР в достаточных количествах для биологических исследований была невозможна, потому что это компонент древесных лигнанов, которые были относительно плохо охарактеризованы. Понимание распределения ГМР в различных частях ели (Ekman, 1976 и 1979) дало возможность детально изучить лигнаны и, в частности, ГМР.
Была обнаружена линейная корреляция между дозами ГМР и количествами энтеролактона в моче. Энтеролактон представляет хорошо известный лигнан млекопитающих, образуемый кишечными бактериями из матаирезинола или окислением энтеродиола (Axelson and Setchell, 1981; Axelson et al., 1982). В моче были обнаружены лишь небольшие количества неметаболизированного ГМР и других метаболитов (энтеродиол и 7-гидроксиэнтеролактон). Их количества оставались неизменными, когда увеличивалась суточная доза ГМР. Эти данные свидетельствуют о том, что ГМР метаболизировался до энтеролактона, а далее энтеролактон, полученный из ГМР посредством этапов деметилирования и дегидроксилирования, не превращается в энтеродиол. На основании структуры ГМР ожидалось, что 7-гидроксиэнтеролактон являлся основным метаболитом ГМР, но это было не так. Эта гидроксильная группа устраняется при метаболизме. Метаболизм ГМР отличается от метаболизма СДГ. СДГ метаболизируется до энтеродиола, который частично окисляется до энтеролактона (Rickard et al., 1906; Lampe et al., 1994). Таким образом, ГМР предоставляет преимущество перед СДГ в качестве прямого предшественника энтеролактона.
Если ГМР оказывает какое-либо эстрогенное действие на матку крыс или на мужской организм, то это действие слабое. Он обладал слабой, но статистически незначимой эстрогеноподобной активностью по отношению клеток MCF-7. Антиэстрогенная активность ГМР выявлена не была. Поэтому удивительно, что, как показано на фиг.2, он обладает высоко статистически значимой противоопухолевой активностью на модели опухоли, вызванной у крыс ДМБА. Активность ГМР может объясняться самим ГМР или энтеролактоном. Однако не было обнаружено зависимости от дозы химиопрофилактического действия ГМР при введении в двух различных дозах (3 и 15 мг/кг) крысам после обработки ДМБА. Таким образом, ГМР не нужно превращаться в энтеролактон для того, чтобы оказывать противоопухолевое действие, или для реализации максимальных химиопрофилактических эффектов достаточны меньшие дозы данных лигнанов.
Как показано в табл.2 и 3, ГМР является очень эффективным антиоксидантом. Он представляет один из самых мощных известных ингибиторов перекисного окисления липидов и является отличным ингибитором окисления ЛНП. Считается, что окисление ЛНП имеет особое значение у людей, поскольку концентрация окисленных ЛПН в сыворотке считается одним из лучших прогностических показателей сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз. ГМР может служить в качестве пищевой добавки для увеличения устойчивости пищи (т.е., ингибирования окисления витаминов, липидов и пигментов, которое вызывает потерю питательной ценности и развитие неприятных запахов в пище), потому что ГМР был гораздо лучшим средством утилизации перекисного аниона и пероксильного радикала, чем хорошо известные антиоксиданты - бутилированный гидроксианизол (БГА) и бутилированный гидрокситолуол (БГТ), которые обычно используются для увеличения устойчивости пищевых продуктов.
Эксперименты
Химические соединения
Были проведены испытания in vitro различных лигнанов для выявления их эстрогенной активности, антиэстрогенной активности, способности ингибировать ароматизацию и их антиоксидантные свойства. Испытуемые соединения закупали в следующих источниках: энтеродиол и энтеролактон - у Plantech, London, UK, а 7-гидроксиэнтеролактон, содержащий два 7-ОН энантиомера, был щедрым даром д-ра Кристины Вахала (Kristina Wahala) из отдела прикладной химии Хельсинского университета, Финляндия.
Экстракция ГМР из древесины
Экстракты ГМР выделяли из норвежской ели (Picea abies), как описано Ekman, 1976 и Ekman, 1979. Вкратце, лиофилизированную измельченную сердцевину древесины экстрагируют с использованием прибора Soxhlet гексаном для удаления неполярного липофильного экстракта. Образец древесины подвергают повторной экстракции в том же приборе смесью ацетона/воды (9:1 об./об.) для получения неочищенных лигнанов. Выделяют гидроксиматаирезинол (ГМР) и его изомер и проводят их повторную хроматографию с ксантановой смолой для дальнейшей очистки.
Измерение антиоксидантной способности in vitro
Антиоксидантную способность лигнанов оценивали четырьмя различными способами: количественные анализы 1) ингибирования перекисного окисления липидов, 2) ингибирования окисления липопротеидов низкой плотности (ЛНП), 3) утилизации перекисного аниона и 4) утилизации пероксильного радикала.
Ингибирование перекисного окисления липидов оценивали на основании их способности ингибировать вызванное трет-бутилгидроксипероксидом перекисное окисление липидов (т-БГП-ПОЛ, t-BuOOH-LP) в микросомах печени крыс in vitro (Ahotupa et al., 1997). Испытание с целью выявления т-БГП-ПОЛ проводят следующим образом: Буфер (50 мМ карбоната натрия, рН 10,2, с 0,1 мМ ЭДТА) переносят пипеткой в объеме 0,8 мл в кювету люминометра. Добавляют 20 мкл разведенных микросом печени до конечной концентрации 1,5 мг белка/мл с последующим добавлением 6 мл люминола (0,5 мг/мл) и испытуемых химических соединений. Испытуемые соединения добавляют в инкубационные смеси в маленьком объеме, разведенном в этаноле или диметилсульфоксиде (2% инкубационного объема), и активность перекисного окисления липидов сравнивают с таковой носителя (этанол или диметилсульфоксид). Реакцию инициируют с помощью 0,05 мл 0,9 мМ БГП при 33°С. Хемолюминесценцию измеряют в течение около 45 мин циклами по 1 мин и рассчитывают площадь под кривой (интеграл). Измерения хемолюминесценции проводят с использованием люминометра Bio-Orbit 1251 (Bio-Orbit, Turku, Finland), соединенного с персональным компьютером, используя специально разработанную программу для количественных анализов.
Ингибирование окисления ЛНП оценивали, как описано Ahotupa et al., 1996. Вкратце: ЛНП выделяют осаждением забуференным гепарином. После ресуспендирования в фосфатном буфере добавляют 20 мМ CuCl2, и смесь инкубируют в течение 3 ч при +37°с. После этого липиды ЛНП экстрагируют хлороформом/метанолом, сушат в атмосфере азота, повторно растворяют в циклогексане и проводят спектрофотометрический анализ при 234 нм. Интенсивность спектральной поглощательной способности является показателем окисления ЛНП. Для испытания способности различных соединений предотвращать окисление ЛНП соединения добавляют в инкубационную смесь перед добавлением CuCl2. Возможное вмешательство испытуемых соединений в процедуру анализа исключают измерением поглощения при 234 нм перед и после периода инкубации. Для соединений, которые проявили антиоксидантную активность в исходной концентрации (0,1 мМ), определяли величину ИК-50 (ИК-50), т.е. концентрации, при которых испытуемое соединение ингибировало окисление ЛНП на 50%).
Способ улавливания перекисного аниона был основан на перекисном анионе, вырабатываемом в регулируемых условиях системой ксантин-ксантин оксидаза, и выявлении генерированных реактивных видов кислорода с помощью люминометра (Ahotupa et al., 1997). Оценивали способность испытуемых соединений уменьшать хемолюминесценцию. Рассчитывали концентрацию ИК-50 (концентрацию, которая предотвращала хемолюминесценцию на 50%).
Анализ улавливания пероксильного радикала основывался на генерировании пероксильных радикалов термическим разложением 2,2'-азобис(2-амидинпропан)НСl и их выявления хемолюминесценцией (Ahotupa et al., 1997). Результаты рассчитывают как стохиометрический фактор, т.е. сколько молей пероксильных радикалов может быть утилизировано одним молем испытуемого соединения.
Измерение способности ингибировать ароматазу в клетках JEG-3
Эффекты ГМР и структурно связанных лигнанов (энтеролактона, энтеродиола и 7-гидроксиэнтеролактона) изучали для выявления образования3H-17β-эстраола из3H-андостендиона в клетках JEG, клеточной линии хориокарциномы человека. Клетки хориокарциномы JEG-3 представляют практичную модель для изучения ароматазы, позволяющую исследовать ингибирование ароматазы in vitro (Krekels et al., 1991). Клетки содержат в диметиловом эфире этиленгликоля (ДМЭМ, DMEM), содержащем 10% плодную телячью сыворотку (ПТС, FCS). Инкубационная смесь содержит 50 мкл3H-андрост-4-ен, 3,17-диона (0,5 нМ) немеченого андростендиона (0,5 нМ), 100 мкл испытуемых соединений (10 мМ) и 800 мкл клеточной суспензии (1 млн клеток). После инкубации в течение 4 ч добавляют немеченые носители (андростендион, тестостерон, 17β-эстрадиол и эстрон). Стероиды дважды экстрагируют 3,0 мл дихлорметана. Для разделения и количественной характеристики меченого радиоактивной меткой3H-17β-эстрадиола использовали ВЭЖХ, как описано ранее (Makela et al., 1995). Система колонок состояла из предохранительной колонки с последующей аналитической колонкой С18 150 мм × внутренний диаметр 3,9 мм (Technopak 10 С18 HPLC Technology; Wellington House, Cheshire, UK). Подвижная фаза представляла смесь ацетонитрила/воды (35/65) и скорость потока была 1,2 мл/мин. Для выявления радиоактивных метаболитов в реальном масштабе времени жидкость, вытекающую из колонки ВЭЖХ, постоянно смешивают с жидким сцинтиллянтом и затем проводили мониторинг с помощью встроенного детектора радиоактивности.
Измерение эстрогенной и антиэстрогенной активности в культурах клеток MCF-7
Исходные культуры линии клеток MCF-7 (клетки рака молочной железы человека) выращивают в среде RPMI без фенола красного с добавлением 5% ПТС, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мкг/мл инсулина и 1 нМ 17β-эстрадиола во флаконах с культурой клеток Т-75. Среду 3 раза/нед замещают свежей средой. Исходные культуры собирают трипсинизацией и суспендируют в 10 мл лишенного фенола красного раствора версена и центрифугируют в течение 5 мин при 800 об/мин. Клеточный осадок осторожно ресуспендируют в среду RPMI с добавлением 5% ПТС, очищенной нагруженной декстраном угольной пылью (ОНДУП, dcFCS), и высевают на 6-луночные планшеты из расчета 50000 клеток/3, 0 мл среды/лунку. На второй день культивации среду заменяют и добавляют испытуемые соединения. Для испытания эстрогенной активности соединений лигнана их растворяют в этаноле и добавляют в клеточные культуры в конечной концентрации 1,0 М. При каждом анализе пролиферации 1,0 нМ раствор 17 β-эстрадиола в этаноле используют в качестве положительного контроля для выявления эстрогенной реакции. В контрольные лунки добавляют равные количества этанола. Для испытания антиэстрогенной активности и раствор 17β-эстрадиола, и раствор лигнана добавляют в клеточные культуры. Клетки культивируют в течение 5-7 дней в присутствии испытуемых соединений, и среду меняют 1 раз/2 дня. Количественную характеристику клеточной пролиферации получают подсчетом высвобожденных ядер с использованием култеровского счетчика (Coulter).
Оценка эстрогенной и антиэстрогенной активности в утеротропном тесте у неполовозрелых крыс
Эстрогенность ГМР оценивают утеротропным анализом у неполовозрелых крыс, который выполняют как описано ранее (Jordan et al., 1977), за исключением времени лечения, которое составляло 7 дней вместо 3 дней в исследовании, на которое делается ссылка. Время лечения было длиннее ввиду ожидавшейся слабой эстрогенной активности испытываемых соединений. Лечение неполовозрелых крыс ингибитором ароматазы (MVP-2213ad), который предотвращает биосинтез эстрадиола, используют в качестве методологического контроля для не стимулированной эстрогеном матки.
Оценка эстрогенной и антиэстрогенной активности у взрослых самцов крыс
Эстрогенные (антиандрогенные) и антиэстрогенные эффекты ГМР исследуют соответственно у интактных самцов крыс и у гипоандрогенных самцов крыс линии Noble (возраст 6-9 мес.). Хроническое гипоандрогенное состояние и со структурными, и с функциональными изменениями в репродуктивном тракте самцов вызывают неонатальной эстрогенизацией (диэтилстильбэстролом, 10,0 мкг/кг массы тела в рапсовом масле подкожно на 1-5 день после рождения). Эти изменения, как известно, частично обратимы с помощью лечения ингибитором ароматазы, состоящего из ежедневного или через день введения MPV-2213 в дозе 10-30 мг/кг массы тела (Streng et al., неопубликованные наблюдения).
Животные получали лишенный сои основной рацион (SDS, Whitham Essex, England) и имели свободный доступ к воде. По 12 интактных и гипоандрогенных животных получали с кормом ГМР при ежедневной его дозировке 50 мг/кг массы тела в рапсовом масле. Еще по 12 животных из обеих экспериментальных моделей получали только рапсовое масло в качестве лечения плацебо. После 4 недель лечения животных забивали. Определяли массу семенников и добавочных половых желез (вентральной предстательной железы, семенных пузырьков и коагулирующей железы). С помощью иммуноанализов измеряют содержание тестостерона в сыворотке и в семенниках и содержание лютеинизирующего гормона (ЛГ) в гипофизе и в сыворотке (Haavisto et al., 1993).
Исследование противоопухолевой активности на модели рака молочной железы, вызванного ДМБА
Противоопухолевую активность ГМР при раке молочной железы крыс изучают, как было описано ранее (Kangas et al., 1986). Пятидесятидневным самкам крыс линии Sprague-Dawley дают 12,0 мг ДМБА (диметилбенз[а]антрацена) путем добавления в корм. Приблизительно через 6 недель выявляются пальпируемые опухоли, после чего 1 раз/нед измеряют ширину (w) и длину (1) опухолей для определения объема опухолей по формуле V=(w2l)/12. Крыс также взвешивают 1 раз/нед. Крыс распределяют в 3 различные группы так, что общее число опухолей в начале эксперимента одинаково в каждой группе: (1) Контрольная группа из 8 животных, (2) ГМР 3,0 мг/кг, 7 животных и (3) ГМР 15,0 мг/кг, 7 животных, одно из которых должно было быть забито перед окончанием эксперимента.
ГМР дают внутрь, начиная с 9 недель после индукции ДМБА, т.е. через 3 недели после появления пальпируемой опухоли, и дают ежедневно в течение 7,5 недель. В конце эксперимента опухоли классифицируют по группам в соответствии с их типом роста: 1) растущие опухоли (ПЗ = прогрессирующее заболевание); 2) не растущие, стабилизированные опухоли (СЗ = стабилизированное заболевание, отсутствие изменения объема опухоли или регрессия менее чем 75%); 3) регрессирующие опухоли (ЧР = частичная реакция, регрессия объема опухоли более чем 75%); 4) исчезнувшие опухоли (ПР = полная реакция, отсутствие пальпируемой опухоли).
Анализ метаболитов из мочи крыс, получающих различные дозы ГМР
Для исследования метаболизма ГМР in vivo используют 10 самцов крыс линии Sprague-Dawley (в возрасте 4 мес). Во время исследования метаболизма животных помещают по парам при цикле света:темноты 12 ч, и у них имеется свободный доступ к воде и лишенному сои основному рациону (SDS, Whitham Essex, England).
Крысам дают с кормом ГМР, растворенный в 10% этаноле в полиэтиленгликоле (ПЭГ, PEG) в дозах 3, 15, 25 и 50 мг/кг массы тела 1 раз/день в течение 2 дней. После второго введения суточную мочу собирают в метаболических клетках в накопительные банки, содержащие 120 мкл 0,56 М аскорбиновой кислоты и 120 мкл 0,15 М азида Na в качестве консервантов. Отмеряют объемы отцентрифугированной мочи и хранят при -20°С. Для предварительной обработки в аликвотные количества мочи по 3,0 мл добавляют 750 мкг 0,2 М ацетатного буфера (рН 4,0±0,1). Для экстракций мочи используют колонки Sep-Pak C18 (100 мг смолы на основе кремния на колонку). Колонки предварительно кондиционируют 3,0 мл Н2О, 3,0 мл метанола и 3,0 мл ацетатного буфера. После фильтрации мочи через колонку и промывания 3,0 мл ацетатного буфера полифенольные соединения элюируют 3,0 мл метанола. Элюат выпаривают досуха в атмосфере азота в водяной бане с температурой +45°С и высушенные остатки повторно растворяют в 3,0 мл 0,2 М ацетатного буфера. Добавляют ферментную смесь Helix pomatia и растворы инкубируют при +37°С для гидролиза и глюкуронидов, и сульфатов. В гидролизованные образцы добавляют 300 мкл исходного раствора флавона (100 мкг/мл в EtOH). Образцы экстрагируют в колонках С-18 и выпаривают досуха, как описано выше, и хранят при -20°С до анализа газовой хроматографией-масс-спектрометрией (ГХ-МС).
Образцы мочи после выпаривания растворяют в пиридине и силилируют добавлением реактива силилирования BSTFA:TMCS (10:1). Анализы силилированных образцов с использованием ГХ-МС выполняют с помощью прибора ГХ-МС HP 6890-5973. ГХ колонка представляет колонку с поперечно-сшитым метилполисилоксаном НР-1 (15 м × внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм). В качестве газа-носителя используют гелий при потоке 1 мл/мин. ГХ печь программируют по температуре от 60°С до 290°С при скорости нагревания 8°С/мин. ГХ инжектор устанавливают в режиме деления потока при отношении деления потока 1:15. Температура инжектора 250°С. Процедуры идентификации основаны на масс-спектрах. Количественные расчеты основываются на некорректирующихся площадях пиков целевых компонентов относительно внутреннего стандарта.
Результаты
Оценка антиоксидантной способности in vitro
ГМР обладал более сильной способностью перекисного окисления липидов, чем любой другой лигнан или флавоноид в проведенных испытаниях (табл.2). ГМР сравнивали с хорошо известным антиоксидантом TOLOX, который является водорастворимым производным витамина Е, и ВНА и ВНТ по способности ингибировать перекисное окисление липидов, ингибировать окисление ЛНП и утилизировать перекисные и пероксильные радикалы (табл.3). ГМР в целом был самым сильным антиоксидантом, более эффективным, чем ВГА или ВГТ при всех анализах, и сильнее, чем TOLOX при всех анализах, за исключением анализа ингибирования перекисного окисления липидов, при котором соединения были почти одинаково активными.
Способность ингибировать ароматазу в клетках JEG-3
Ингибирование образования3Н-17β-эстрадиола из3 Н-андростендиона в клетках JEG-3 исследовали при различных концентрациях ГМР. Ингибирующую способность ГМР сравнивали с энтеролактоном, 7-гидроксиэнтеролактоном и энтеродиолом. Энтеролактон вызывал зависимое от дозы ингибирование ароматизации в пределах диапазона концентрации от 1,0 до 10,0 мкМ. Было, кроме того, показано, что энтеродиол не обладал ингибирующим действием, указывая на то, что лактоновое кольцо имеет решающее значение для ингибирования. 7-Гидроксиэнтеролактон и гидроксиматаирезинол не обладали ингибирующими эффектами (фиг.1), указывая на значение числа и расположения гидроксильных групп в молекуле лигнана для ингибирования ароматазы.
Эстрогенная и антиэстрогенная активность на культурах клеток MCF-7
Как показано на фиг.2, ГМР обладал очень слабой, статистически незначимой эстрогенной или антиэстрогенной активностью в анализах пролиферации клеток MCF-7.
Оценка эстрогенной и антиэстрогенной активности при утеротропном тесте у неполовозрелых крыс
На фиг.3 показаны воздействия ГМР на рост матки у неполовозрелых крыс. ГМР не оказывал статистически значимого эстрогенного эффекта на прибавку массы матки неполовозрелых крыс. ГМР также не вызывал прибавку массы, указывая на отсутствие антиэстрогенного эффекта. Ингибитор ароматазы, как ожидалось, предотвращал увеличение массы матки, указывая на то, что способ измерения активности ингибиторов ароматазы был адекватным.
Оценка эстрогенной и антиэстрогенной активности у взрослых самцов крыс
После 4 недель лечения ГМР у контрольных и гипоандрогенных животных не наблюдались статистически значимые изменения массы добавочных половых желез и семенников (табл.4). Не было также статистически значимых изменений концентрации тестостерона или ЛГ (табл.5). Эти результаты показывают, что ГМР не является полным эстрогенным агонистом в мужском организме, потому что он не оказывает типичного эстрогенного действия на ось гипоталамус-гипофиз-половые железы (ингибирование секреции ЛГ и андрогенов). ГМР не является также антиэстрогеном, потому что он не устраняет изменений, вызванных эстрогенизацией в период новорожденности у самцов крыс.
Исследование противоопухолевой активности на модели рака молочной железы, вызванного ДМБА у крыс
Количество растущих опухолей (ПЗ) в сравнении со стабильными опухолями (СЗ), регрессирующими опухолями (ЧР) и исчезнувшими опухолями (ПР) представлено на фиг.4. Было обнаружено, что противоопухолевый эффект ГМР был статистически очень значимым. На этой модели не выявлено отчетливой зависимости противоопухолевого действия от дозы. Поэтому и антиоксидантные, и вызывающие обратное развитие опухолей свойства ГМР могут быть связаны с противоопухолевой активностью in vivo. Механизм противоопухолевой активности ГМР in vivo еще не известен.
Анализ метаболитов из мочи крыс после введения
различных доз ГМР
Фиг.5 иллюстрирует, что основным выводимым метаболитом ГМР у крыс является энтеролактон, который может быть биологически активным соединением. Это удивительно с учетом химической структуры ГМР, потому что следовало ожидать, что основным метаболитом будет гидроксиэнтеролактон. Метаболизм ГМР в энтеролактон может катализироваться бактериальной кишечной флорой, а не печенью крыс.
Выводы
Гидроксиматаирезинол (ГМР) обладает противоопухолевой активностью или в виде неизмененного соединения и/или после превращения в энтеролактон на модели рака молочной железы, вызванного ДМБА. Поэтому ГМР может потенциально оказывать благоприятные эффекты у людей, у которых есть риск развития рака молочной железы (РМЖ), рака предстательной железы (РПЖ), рака толстой кишки или доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ). ГМР метаболизируется в энтеролактон, который ингибирует ароматизацию in vitro. ГМР как предшественник ингибитора ароматазы может также предотвратить развитие симптомов со стороны нижних отделов мочевыводящих путей (СНОМП), нестабильности мочевого пузыря, обструкции выводного тракта мочевого пузыря, диссинергии уретры и гинекомастии. ГМР обладает также сильной антиоксидантной активностью и поэтому может применяться в качестве пищевой добавки (антиоксиданта). ГМР в качестве фармацевтического продукта или пищевой добавки может оказывать благоприятные эффекты на сердечно-сосудистую систему у людей. Возможно, добавление ГМР в пищу для приготовления инновационного нового функционального пищевого продукта, питательной добавки, оздоровительного пищевого продукта, экспериментального питания или нового пищевого продукта.
Следует понимать, что способы настоящего изобретения могут быть включены в форме различных вариантов реализации, лишь некоторые из которых раскрыты в данном описании. Специалисту в данной области будет понятно, что существуют другие варианты реализации, и они не отходят от существа изобретения. Таким образом, описанные варианты реализации являются иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие.
Способы определения были описаны в тексте.
Реферат
Предложено: новые фармацевтические композиции на основе лекарственного средства (гидроксиматаирезинола) для профилактики рака, гормонально зависимого заболевания или сердечно-сосудистого заболевания, способы профилактики, включающие введение этих композиций, способы повышения уровня энтеролактона в крови путем введения гидроксиматаирезинола, добавка к пищевому продукту, пищевой продукт и способ повышения устойчивости указанного продукта. Новые области использования гидроксиматаирезинола обеспечивает его противоопухолевая, антиоксидантная активность и метаболизм в организме до энтеролактона, который, в свою очередь, является ингибитором ароматазы. Изобретение расширяет арсенал средств и способов указанного назначения. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 ил.
