Реактив для определения глицерина фотометрическим методом - SU1554765A3
Код документа: SU1554765A3
Описание
Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической биохимии для определения глицерина триглицеридов в сыворотке крови.
Целью изобретения является реактив включающий глицериноксидазу, характеризующейся более высокой специфической активностью.
Указанная цель достигается за счет использования глицериноксидазы из Aspergillus Spec. DSM 1729 (микроорганизм почвы), которая была получена с молекулярным весом 90000 и специфической активностью между 2000 и 8000 V/мг, активность которой снижается под действием SH-реагентов, и на которую не влияет присутствие серно-кислой меди и уксусно-кислого свинца.
При определении триглицеридов вначале проводится их ферментативный гидролиз под действием липазы и
(Л
эстеразы до глицерина и количество образовавшегося свободного глицерина определяют с помощью глицериноксидазы , измеряя либо расход кислорода, либо количество перекиси водорода.
Потребление кислорода определяют поляриметрически с помощью кислородного электрода, реже используется газовая хроматография.
Перекись водорода может быть определена как титрованием, так и потенциометрическим, полярографическим и колориметрическим способами. Предпочтительным способом является ферментативный способ с применением пероксидазы. При применении последней в качестве хромогенного вещества (красителя) используют соединения, которые после проведения реакции с фенолом могут быть определены фотометрически , например 2,2 -аминобенэ- тиазолинсульфокислота, 4-аминоанти- пирин, фенилендиаминсульфокислота
СП
СЛ
Јь J О СЛ
О4
метилбензотиазолонгидраэон и буферный раствор. Кроме этих реагентов дополнительно реактив может содержат растворитель, стабилизатор и/или поверхностно-активные вещества.
Предпочитаемыми поверхностно-активными средствами являются Гена- полр ;алкилполигликолевый эфир, тритон . октилфенолокись полиэтилена
октилфенолокись полиэтилена (fa и Брийда , а также полиэтиленгликолевый эфир лаурилового, стеарилового и олеилового спирта.
При указанной величине рН 6,8- 8,0 фермент имеет хорошую стойкость,
Предпочтительная комбинация реагентов состоит из
100-250 KV/л (333-833 мг/л)
глицериноксидазы;
5-50 KV/л (.20-200 мг/л)
пероксидазы;
0,2-5 ммоль/л (38-955 мг/л)
индикатора (4-антипирин
аминозамещенный);
5-50 ммоль/л (64-6400 мг/л)
парахлорфенола;
1-5 г/л поверхностно-ак- тивного вещества;
рН 6,8-8,0 буферного раствора,
Пример 1. Определение глицерина по образованию перекиси водорода с Приготовляют два реактива.
Реактив 1.
0,1 ммоль/л триэтаноламина
(HCl-буфер, рН 8,0);
2 г/л холата натрия
(4,7 ммоль/л);
1150 мг/л парахлорфенола
(10 ммоль/л);
86 мг/л аминозамещенного
4-аминоантипирина (0,5 ммоль/л);
40 мг/л пероксидазы (10 V/мл).
Реактив 2. 1600 мг/л глицеринокси дазы (500 V/мл).
Для проведения определения 2 мл реактива 1 и 0,2 мл реактива 2 вводят пипеткой в кювету. Экстинкцию Е, измеряют на фотометре при 546 нм. Непосредственно после этого инициируют реакцию добавлением 20 мкл пробы. Для определения глицерина в качестве пробы могут быть применены водные среды всех типов, например пищевые экстракты, содержащиеся в организме жидкости, и сыворотка.
После проведения реакции в течение 20 мин измеряют экстинкцию Kg. Температура выдержки составляет 25°С.
0
5
5
0
5
0
5
Оценку производят по калибровоч- i ной прямой, на которой разность измеренных экстинкиий &Е Е--Е1 стандартного глицеринового раствора находится в зависимости от концентрации глицерина.
Конечная концентрация в исследуемой смеси составляет:
45 V/мл - 144 мг/л глицериноксидазы;
9 V/мл - 36 мг/л пероксидазы;
0,45 ммоль/л-86 мг/л 4-антипирина аминозамещенного;
9 ммоль/л-1156 мг/л парахлорфенола;
4,3 ммоль/л-1800 мг/л холата
натрия;
рН 8,0 0,09 моль/л триэтаноламин/
/НС1 - буферный раствор
Пример 2. Кинетическое определение .
Проба. Водный стандартный раствор (содержание глицерина от 10 до 100 мг/дл).
Реактив. 0,1 моль/л Pipes-буфера; 1,7 моль/н Н,1Ю,-, РН 7,0; 3,0 г/л холата натрия; 0,5 ммоль - 90 мг/л аминоантипирина, аминозамещенного; 10,0 ммоль/л парахлорфенола (1170 мг/л)г, 10,0 V/л (40 мг/л) пероксидазы; 121,0 V/л 403 мг/л глицеринокси- даэы.
Определение проводят на Gemsaec Fast анализаторе-автомате: температура 25°С; длина волны при измерениях 546 нм; объем пробы 10 мкл;1 разбавитель () 50 мкл; объем реактива 500 мкл. Время измерения: первое показание 35 с после начала, второе показание 315 с после начала.
Были получены следующие результаты:
Пробы (водный стандартный раствор ) .
Глицерин (VV-тест), Значение мг/длглицерина-00 ,%
1 I105
21101
32100
43101
54100
6599
7699
8799
96102
Пример 3. При кинетическом определении применяют реактив со следующим количественным соотношением компонентов: от 0,05 до 0,5 моль/л Pipes-буфера; от 0,5 до 2,0 моль/л Н3ВОЭ-, рН от 6,8 до 8,0; от 1 до 5 г/л холата натрия; 0,2- 5 ммоль/л (38-955 мг/л) 4-аминоанти- пирина, аминозамещенного от 5 до 50 ммоль/л (640-6400 мг/л парахлор- фенола, от 5 до 50 KV/л (20-200 мг/л пероксидазы, от 100 до 250 KV/л (.333-833 мг/л) глицериноксидазы.
Изобретение может быть осуществлено на автоматизированном анализаторе (спектрофотометре), имеющемся в биохимических лабораториях.
П р и м е р 4. Определение глицерина через образование гОг при применении различных аминозамещенных 4-аминоантипирина. Осуществляют аналогично примеру 1, причем реактив 1 содержит различные аминозамещенные 4-аминоантипирин (0,5 ммоль/л).
Получены следующие результаты:
Проба. Водный стандарт глицерина 45 мг/дл глицерина.
Производное Нахождение вновь, 4-аминоантипирина Фенилендиаминсульфокислота102
МВТН101
р-МВТН99
4-аминоантипирин (сравнение )101
Пример 5. Кинетическое определение глицерина при применении различных поверхностно-активных веществ .
Осуществляют аналогично примеру 2, причем реактив вместо 3 г/л холата натрия содержит такое же количество другого поверхностно-активного вещества.
Составитель
5
0
Получены следующие результаты. Проба. Водный стандарт глицерина (45 мг/дл глицерина).
Поверхностно-активное Нахождение веществовновь,%
Ацетилтриметиламмоний бромид101
Полиоксиэтилен лаурило- вый простой эфир
(Brij 35)103
20 этокг.и-сорбитанмо- нолаурат (Твин 20)98
10,5 этоксн-нонилфенол (Тергнтол NPX)99
Тезит100
Дезоксихолат натрия97,5
Изотридеканол-полиглико- левый простой эфир (Genapol X-80)101
Холат натрия (сравнение )99 Формула изобретения
25
5
5
0
Реактив для определения глицерина фотометрическим методом, содержащий глицериноксидазу из рода Asper- gillus, пероксидазу, индикатор, по- о верхностно-активное вещество, буферный раствор, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности, он содержит глицериноксидазу из Aspergillus DSM 1729, в качестве индикатора содержит 4-анти- пирин аминозамещенный и парахлорфенол, в качестве поверхностно-активного вещества холат или дезокснхолат натрия, а буферный раствор с рН 6,8-8,0 при 0 следующем соотношении компонентов, г/л:
Глицериноксидаэа из
рода Aspergillus
Пероксидаза
4-Антипирнн аминозамещенный
Парахлорфенол
Холат- или
дезоксихолат натрия
Буферный раствор
рН 6,8-8,0
Конюхова
0,333-0,833 0,02-0,20
0,038-0,955 0,640-6,400
1,0-5,0 До 1 л
Реферат
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической биохимии для определения глицерина и триглицеридов в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение специфической активности. Для этого используется глицериноксидаза из ASPERGILLUS SPEC. ASM 1729.
Формула
