Способы и композиции для улучшения популяции кишечной микробиоты и их осуществления - RU2631595C2

Чертежи

Показать все 61 чертежа(ей)

Описание

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка притязает на преимущество приоритета заявки на китайский патент № 201210185004.2, поданной 6 июня 2012 г., которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам улучшения популяций кишечной микробиоты и композициям для их осуществления, а также к применению в лекарственных средствах, пищевых добавках, диетических продуктах, пищевых продуктах и напитках.

Уровень техники

За исключением особо оговоренных случаев вещества, описанные в данном разделе, не являются прототипами формулы изобретения, представленной в настоящей заявке, и не могут быть признаны в качестве прототипов в связи с включением в данный раздел.

В организме человека обитает большое количество симбиотических микроорганизмов, среди которых кишечная микробиота имеет особенно важное значение для здоровья хозяина. Существует более 1000 видов бактерий, количество которых в 10 раз превышает число клеток человека, при этом количество генов указанных видов примерно в 150 раз превышает число генов в клетках человека. В данной связи организм человека следует рассматривать как ”суперорганизм”, состоящий из клеток-хозяев и симбиотических микроорганизмов, включая кишечную микробиоту, и генома, кодирующего консорцию кишечных микроорганизмов (микробиоту), который считается вторым геномом человека, известным как ”метагеном человека”. При изменении состояния здоровья человека соответствующим образом изменяется состав симбиотических микроорганизмов. И наоборот, при изменении состава симбиотических микроорганизмов изменяется состояние здоровья человека. Разнообразие генома человека и генома кишечной микробиоты влияет на иммунитет, питание, обмен веществ, здоровье и болезни человека-хозяина. Однако до настоящего времени было неясно, каким образом кишечная микробиота влияет на этиологию и патологию, бактерии какого типа положительно коррелированы с состоянием здоровья хозяина и бактерии какого типа отрицательно коррелированы с состоянием здоровья хозяина.

Сущность изобретения

Нижеследующее краткое описание изобретения является иллюстративным и никоим образом не ограничивает изобретение. Помимо иллюстративных объектов, вариантов осуществления и вышеописанных признаков изобретения, благодаря ссылке на прилагаемые чертежи и приведенное ниже подробное описание изобретения станут очевидны другие объекты, варианты осуществления и признаки настоящего изобретения.

Одним объектом изобретения является способ улучшения популяции кишечной микробиоты. В одном варианте осуществления изобретения указанный способ включает введение субъекту композиции для увеличения первой популяции микробиоты кишечника при одновременном уменьшении второй популяции кишечной микробиоты у субъекта. Первая популяция кишечной микробиоты может включать бактерии, продуцирующие короткоцепные жирные кислоты (SCFA). Вторая популяция кишечной микробиоты может включать бактерии, продуцирующие эндотоксин.

Другим объектом изобретения являются способ скрининга испытуемого соединения, способного улучшить популяцию кишечной микробиоты. В одном варианте осуществления изобретения указанный способ включает введение контрольному субъекту эффективного количества контрольной композиции для увеличения первой популяции кишечной микробиоты при одновременном уменьшении второй популяции кишечной микробиоты у контрольного субъекта, введение испытуемому субъекту определенного количества испытуемого соединения и сравнение популяции кишечной микробиоты контрольного субъекта с популяцией кишечной микробиоты испытуемого субъекта. Подобие, равное по меньшей мере примерно 80%, указывает на то, что испытуемое соединение активно улучшает популяцию кишечной микробиоты. Первая популяция кишечной микробиоты может включать бактерии, продуцирующие короткоцепные жирные кислоты (SCFA). Вторая популяция кишечной микробиоты может включать бактерии, продуцирующие эндотоксин.

Другие объектом изобретения является композиция, предназначенная для улучшения популяции кишечной микробиоты. В одном варианте осуществления изобретения указанная композиция способна избирательно увеличивать первую популяцию кишечной микробиоты при одновременном уменьшении второй популяции кишечной микробиоты у субъекта. Первая популяция кишечной микробиоты может включать бактерии, продуцирующие короткоцепные жирные кислоты (SCFA). Вторая популяция кишечной микробиоты может включать бактерии, продуцирующие эндотоксин. В одном варианте осуществления изобретения указанную композицию вводят субъекту в дозе от около 50 кг/кг массы тела до около 400 мг/кг массы тела один раз в сутки в течение по меньшей мере двух недель.

Краткое описание чертежей

Вышеуказанные и другие признаки настоящего изобретения станут более очевидными из нижеследующего описания изобретения и прилагаемой формулы изобретения наряду с прилагаемыми чертежами. Следует отметить, что прилагаемые чертежи отображают только несколько вариантов осуществления изобретения, рассмотренных в настоящем описании изобретения, и поэтому не могут ограничивать объем изобретения, которое будет более подробно и с большей специфичностью описано с помощью прилагаемых чертежей.

На фигуре 1 показано влияние берберина на структуру кишечной микробиоты крыс; на фигуре 1А показан график оценки РСоА изменений структуры кишечной микробиоты крыс при скармливании рациона с высоким содержанием жира (HFD) и введении берберина; на фигуре 1В показано распределение кишечной микробиоты на основании расстояний Мехаланобиса, вычисленных методом MANOVA; и на фигуре 1С показан индекс Шеннона - Винера, вычисленный после выполнения одинакового числа считываний последовательностей для всех образцов.

На фигуре 2 показаны некоторые репрезентативные различия в структуре кишечной микробиоты, вызванные введением берберина, которые были выявлены при помощи тройного графика расстояний RDA микробиоты кишечника.

На фигуре 3 показано влияние на содержание короткоцепных жирных кислот в фекалиях крыс при скармливании крысам рациона с высоким содержанием жира или нормального рациона; на фигуре 3А показаны уровни общего содержания короткоцепных жирных кислот (SCFA); на фигуре 3В показан уровень уксусной кислоты; на фигуре 3С показан уровень пропионовой кислоты; и на фигуре 3D показан уровень масляной кислоты (D).

На фигуре 4 показано влияние берберина на фенотипы ожирения и потребление пищи у крыс; на фигуре 4А показано влияние берберина на увеличение массы тела крыс; на фигуре 4В показано влияние берберина на индекс ожирения, вычисленный в виде массы жировой ткани (сумма эпидидимальной и периренальной жировой ткани) на 100 г общей массы тела; и на фигуре 4С показано потребление корма крысами в течение всего эксперимента.

На фигуре 5 показано влияние берберина на восприимчивость к инсулину у крыс; на фигуре 5А показано влияние берберина на уровень глюкозы в крови натощак (FBG); на фигуре 5В показано влияние берберина на уровень инсулина в сыворотке натощак (FINS); на фигуре 5С показано влияние берберина на оценку гомеостаза устойчивости к инсулину (HOMA-IR), вычисленную в соответствии с формулой: уровень инсулина натощак (мкед/мл) × уровень глюкозы натощак (ммоль/л)/22,5; на фигуре 5D показано влияние берберина на пероральную пробу на толерантность к глюкозе (OGTT); и на фигуре 5Е показано влияние берберина на внутрибрюшинную пробу на толерантность к инсулину (ITT).

На фигуре 6 показано влияние берберина на уровень воспалительных факторов у крыс; на фигуре 6А показано влияние берберина на уровень сывороточного белка (LBP), связывающего липополисахарид (LPS); на фигуре 6В показано влияние берберина на уровень лептина в сыворотке; на фигуре 6С показано влияние берберина на уровень МСР-1 в сыворотке; и на фигуре 6D показано влияние берберина на уровень адипонектина в сыворотке, скорректированного в отношении содержания жира в организме.

Подробное описание изобретения

Нижеследующее подробное описание изобретения содержит ссылку на прилагаемые чертежи, которые составляют часть описания изобретения. На чертежах одинаковые символы обычно обозначают одинаковые компоненты за исключением тех случаев, когда из контекста следует обратное. Иллюстративные варианты осуществления изобретения, представленные в подробном описании изобретения, на чертежах и в формуле изобретения, не ограничивают объем изобретения. Могут быть использованы другие варианты осуществления изобретения и внесены другие изменения, не выходящие за пределы существа или объема изобретения. Следует отметить, что объекты изобретения, рассмотренные в настоящем описании изобретения и иллюстрированные чертежами, могут быть расположены, заменены, объединены, разделены и спроектированы в разных конфигурациях, которые полностью входят в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится наряду с прочим к композициям, способам, процессам, приборам, системам, устройствам и/или продуктам, предназначенным для улучшения популяции кишечной микробиоты.

Настоящее изобретение относится к способам улучшения популяции кишечной микробиоты и новым композициям для их осуществления. Настоящее изобретение позволяет идентифицировать семейства бактерий, тесно связанные с обменом веществ хозяина, например, при помощи высокопроизводительного секвенирования и многомерных статистических методов.

Одним объектом изобретения является способ улучшения популяции микробиоты кишечника. В одном варианте осуществления изобретения указанный способ может включать избирательное обогащение первой популяции кишечной микробиоты. Первая популяция кишечной микробиоты может включать, например, бактерии, продуцирующие короткоцепные жирные кислоты (SCFA). В одном варианте осуществления изобретения указанный способ может включать подавление второй популяции кишечной микробиоты. Вторая популяция кишечной микробиоты может включать, например, бактерии, продуцирующие эндотоксин.

В одном варианте осуществления изобретения указанный способ может включать стадию введения субъекту композиции. Указанная композиция может представлять собой препарат для перорального или парентерального ведения. Указанная композиция может избирательно увеличивать первую популяцию кишечной микробиоты при одновременном уменьшении второй популяции кишечной микробиоты.

Обогащение первой популяции кишечной микробиоты и подавление второй популяции кишечной микробиоты может быть осуществлено одновременно. Указанный способ позволяет предотвратить или лечить метаболический синдром, в том числе, не ограничиваясь ими, ожирение, сахарный диабет, устойчивость к инсулину, гиперлипопротеинемию, гиперурекемию, жировую дегенерацию печени, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, воспаление и другие нарушения.

Кишечные бактерии, продуцирующие короткоцепные жирные кислоты (SCFA), являются в основном благоприятными бактериями. Такие бактерии прямо или косвенно, путем повышения уровня короткоцепных жирных кислот в кишечнике, выполняют, не ограничиваясь ими, функции, включающие защиту от воспаления, защиту кишечного барьера, регулирование обмена веществ и иммунной системы. Указанные функции позволяют предотвратить или лечить ожирение, устойчивость к инсулину, диабет и другие болезни обмена веществ.

С помощью способов улучшения популяции кишечной микробиоты по настоящему изобретению можно увеличить популяцию кишечной микробиоты, включающую Alistipes, Allobaculum, Bacteroides, Barnesiella, Blautia, Butyricicoccus, Butyricimonas, Dorea, Helicobacter, Hespellia, Holdemania, Lawsonia, Oscillibacter, Parabacteroides, Phascolarctobacterium, Prevotella или Sedimentibacter. В одном варианте осуществления изобретения увеличенная популяция кишечной микробиоты может включать Bacteroidaceae, Coriobacteriaceae, Desulfovibrionaceae, Erysipelotrichaceae, Flavobacteriaceae, Helicobacteraceae, Incertae Sedis XI, Incertae Sedis XIV, Lachnospiraceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Rikenellaceae, Ruminococcaceae или Veillonallaceae; альтернативно увеличенная популяция кишечных бактерий может включать Campylobacterales, Desulfovibrionales, Bacteroidales, Coriobacteriales, Flavobacteriales, Clostridiales или Erysipelotrichales; альтернативно увеличенная популяция кишечных бактерий может включать Epsilonproteobacteria, Deltaproteobacteria, Bacteroidia, Coriobacteridae, Flavobacteria, Clostridia или Erysipelotrichi; альтернативно увеличенная популяция кишечных бактерий может включать Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria или Firmicutes.

Например, увеличенная популяция кишечной микробиоты может включать бактерии, в которых V3-область последовательности гена рРНК 16S по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 98% или по меньшей мере примерно на 99% подобна последовательности нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-93.

Кишечные бактерии, продуцирующие эндотоксин, являются наиболее вредными бактериями, которые прямо или косвенно, путем повышения уровня эндотоксина, стимулируют воспалительные процессы, разрушают кишечный барьер, нарушают обмен веществ и ослабляют иммунную систему, вызывая, таким образом, ожирение, устойчивость к инсулину, диабет и другие болезни обмена веществ.

С помощью способов улучшения популяции кишечной микробиоты по настоящему изобретению можно уменьшить популяцию кишечной микробиоты, включающую Alistipes, Anaeroplasma, Barnesiella, Bifidobacterium, Butyricimonas, Butyrivibrio, Coprococcus, Fastidiosipila, Helicobacter, Hespellia, Marvinbryantia, Oribacterium, Oscillibacter, Prevotella, Roseburia, Ruminococcus или TM7_genera_incertae_sedis; альтернативно можно уменьшить популяцию кишечных бактерий Helicobacteraceae, Lachnospiraceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Rikenellaceae, Ruminococcaceae, Anaeroplasmataceae или Bifidobacteriaceae. В одном варианте осуществления изобретения уменьшенная популяция кишечной микробиоты может включать Campylobacterales, Bacteroidales, Clostridiales, Anaeroplasmatales или Bifidobacteriales; альтернативно уменьшенная популяция кишечных бактерий может включать Epsilonproteobacteria, Alphaaproteobacteria, Bacteroidia, Clastridia, Actinobacteridae или Mollicutes. В одном варианте осуществления изобретения уменьшенная популяция кишечной микробиоты может включать Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes или Tenericutes.

Например, уменьшенная популяция кишечных бактерий может включать бактерии, в которых V3-область последовательности гена рРНК 16S по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 98% или по меньшей мере примерно на 99% подобна последовательности нуклеиновой кислоты, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO:94-268.

Способы по настоящему изобретению позволяют снизить в сыворотке уровни провоспалительных факторов. В качестве примера провоспалительных факторов можно привести, не ограничиваясь ими, цитокины, такие как белок, связывающий липополисахариды, протеин-1, являющийся хемоаттрактантом моноцитов, или лептин. Дополнительно и необязательно способы по настоящему изобретению позволяют повысить в сыворотке уровень такого цитокина как адипонектин.

С помощью способов по настоящему изобретению можно повысить уровень короткоцепных жирных кислот в кишечнике. Короткоцепные жирные кислоты могут включать, не ограничиваясь ими, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, масляную кислоту, валериановую кислоту, изомасляную кислоту и изовалериановую кислоту.

Композиции, предназначенные для улучшения популяции кишечной микробиоты, могут быть введены перорально или парентерально. В одном варианте осуществления изобретения такая композиция может входить в состав пищевого продукта, напитка, пищевой добавки или фармацевтического препарата. В одном варианте осуществления изобретения указанная композиция может быть в форме суппозитория, таблетки, пилюли, гранулы, порошка, пленки, микрокапсулы, аэрозоля, спиртового раствора, настойки, тонизирующего средства, жидкой суспензии или сиропа. Композиция по настоящему изобретению может быть введена в дозе от около 50 мг/кг массы тела до около 400 мг/кг массы тела.

В одном примере субъекту была введена композиция, включающая берберин. Популяцию микробиоты кишечника указанного субъекта затем анализировали методом пиросеквенирования 454 последовательностей и определяли содержание короткоцепных жирных кислот при помощи газовой хроматографии. Полученные результаты показали, что берберин способен изменять популяцию кишечной микробиоты, а именно обогащать популяцию определенных бактерий, в том числе бактерий, продуцирующих короткоцепные жирные кислоты, и одновременно подавлять или устранять популяцию определенных бактерий, в том числе бактерий, продуцирующих эндотоксин. Полученные результаты далее показали, что берберин, вводимый перорально, способен повышать уровень короткоцепных жирных кислот в кишечнике, причем указанное увеличение является более выраженным у субъектов, страдающих метаболическим синдромом. Дополнительные эксперименты и наблюдения далее показали, что вышеописанное воздействие берберина на популяцию кишечной микробиоты является благоприятным и позволяет улучшить восприимчивость к инсулину, уменьшить воспаление, контролировать увеличение массы тела и предотвратить ожирение, вызванное перееданием, хроническим воспалением и устойчивостью к инсулину.

Другим объектом изобретения являются способы скрининга лекарственных средств, соединений, композиций, экстрактов или препаратов, способных улучшать популяцию кишечной микробиоты. Способы по настоящему изобретению могут быть использованы при разработке лекарственных средств, пищевых добавок, диетических продуктов, пищевых продуктов и напитков, позволяющих улучшить состояние здоровья и/или предотвратить ожирение или другие связанные с ожирением метаболические синдромы благодаря целенаправленному воздействию на популяцию кишечной микробиоты у субъекта.

В одном варианте осуществления изобретения способ скрининга по настоящему изобретению может включать введение контрольному субъекту эффективного количества контрольной композиции для увеличения первой популяции кишечной микробиоты при одновременном уменьшении второй популяции кишечной микробиоты у контрольного субъекта, введение испытуемому субъекту определенного количества испытуемой композиции и сравнение популяции кишечной микробиоты у контрольного субъекта и популяции кишечной микробиоты у испытуемого субъекта.

В использованном здесь значении термин ”субъект” означает животное, такое как млекопитающее, например, человек. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект может быть крысой. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект может быть мышью. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект может быть человеком.

Испытуемое соединение, демонстрирующее такое же воздействие на микробиоту кишечника, что и контрольное соединение, обладает активностью, позволяющей улучшать популяции кишечной микробиоты. В использованном здесь значении термин ”подобный” означает сходство, равное по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99%.

Испытуемая композиция может представлять собой отдельное соединение, смесь, пищевой продукт, пищевую добавку, питательную добавку, диетический продукт, фармацевтический препарат или напиток.

Другим объектом изобретения являются композиции, предназначенные для улучшения популяции кишечной микробиоты. В одном варианте осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению может избирательно увеличивать первую популяцию кишечной микробиоты при одновременном уменьшении второй популяции кишечной микробиоты у субъекта.

Композиция по настоящему изобретению может включать химическое соединение, природное лекарственное средство, природный продукт или растительный экстракт. В одном варианте осуществления изобретения химическое соединение может включать, не ограничиваясь ими, берберин, производные берберина, изохинолиновые алкалоиды или любые комбинации указанных веществ.

В одном варианте осуществления изобретения композиция может включать природное лекарственное средство, целое, фрагментированное или порошкообразное растение либо растительный экстракт, выделенный из растений Berberis, Coptis, Scutellaria, Phellodendron, Momordica, Ilex, Sophora, Gentiana, Anemarrhena, Gardenia, Rheum или Taraxacum. В одном варианте осуществления изобретения композиция может включать природное лекарственное средство, целое, фрагментированное или порошкообразное растение либо растительный экстракт, выделенный из растений Berberidaceae, Ranunculaceae, Lamiaceae, Rutaceae, Cucurbitacea, Aquifoliaceae, Leguminosae, Gentianaceae, Agavaceae, Rubiaceae, Polygonaceae, Asteraceae, Menispermaceae или Cucurbitaceae. В одном варианте осуществления изобретения композиция может включать природное лекарственное средство, целое, фрагментированное или порошкообразное растение либо растительный экстракт, выделенный из Berberis vulgaris, Coptischinensis, Scutellariabaicalensis, Phellodendri Chinensis, Momordicacharantia, Ilex kudingcha, Sophoraflavescens, Gentianascabra, Anemarrhenaasphodeloides, Gardenia jasminoides, Pheum palmatum или Herba Taraxaci.

Нижеследующие примеры приведены для иллюстрации выполнения и особенностей репрезентативного способа по настоящему изобретению. Приведенные примеры не ограничивают объем изобретения.

Примеры

В примерах использованы крысы Wistar (самцы в возрасте 8 недель) в качестве испытуемых субъектов и берберин в качестве репрезентативного соединения. 40 крыс Wistar акклиматизировали в течение двух недель и затем произвольно распределяли в четыре группы: группа, получавшая нормальный рацион (NCD), группа, получавшая нормальный рацион и берберин (NCD+BBR), группа, получавшая рацион с высоким содержанием жира (HFD), и группа, получавшая рацион с высоким содержанием жира и берберин (HFD+BBR). Каждую группу исследовали в течение 18 недель. На протяжении указанных 18 недель группе NCD+BBR внутрижелудочно вводили берберин в указанных количествах. Образцы фекалий каждого животного собирали в разные периоды времени. Было выполнено пиросеквенирование 454 последовательностей для анализа структуры кишечной микробиоты. Содержание короткоцепных жирных кислот в фекалиях анализировали с помощью газовой хроматографии. Кроме того, в течение 18 недель контролировали и измеряли массу тела, потребление корма, восприимчивость к инсулину и уровни системных воспалений.

Берберин изменял популяцию кишечной микробиоты в условиях скармливания как нормального рациона, так и рациона с высоким содержанием жира

Популяции кишечной микробиоты у крыс во всех четырех экспериментальных группах исследовали путем пиросеквенирования 454 последовательностей и выполнения многомерных статистических анализов. Анализ РСоА на основании невзвешенного значения расстояния Unifrac показал, что берберин изменял структуру кишечной микробиоты как в группе, получавшей нормальный рацион, так и в группе, получавшей рацион с высоким содержанием жира, на статистически значимом уровне; при этом на долю берберина приходится 12,6% от общего изменения популяции кишечной микробиоты (фигура 1А). Рацион также оказывал статистически значимое воздействие на популяцию кишечной микробиоты. На фигуре 1А на вертикальной оси показано статистически значимое различие (3,7%) популяции кишечной микробиоты для двух разных рационов (NCD и HFD). Многомерный дисперсионный анализ (MANOVA), выполненный в отношении четырех групп, показал, что берберин или рацион оказывают статистически значимое воздействие на микробиоту кишечника (Р<0,01), но наиболее выраженное различие имеет место при введении берберина (фигура 1В). Индекс Шеннона - Винера показывает, что берберин уменьшает множественность популяций кишечной микробиоты на статистически значимом уровне (Р<0,05).

Берберин увеличивает количество бактерий, продуцирующих короткоцепные жирные кислоты, и уменьшает количество бактерий, продуцирующих эндотоксин, в популяции кишечной микробиоты.

Было идентифицировано 268 относящихся к берберину операционных таксономических единиц (OTU) при выполнении анализа с введением избыточности (RDA), и детальные результаты анализа приведены на фигуре 2, таблица 1 и таблица 2. Берберин позволил обогатить 93 OTU (SEQ ID NO:1-93) (таблица 1), при этом 175 OTU (SEQ ID NO:94-268) (таблица 2) было подавлено или уничтожено.

Такстономию указанных 268 операционных таксономических единиц (OTU) анализировали при помощи классификатора RDP с использованием репрезентативной последовательности OTU. Было установлено, что бактерии, подавленные берберином, включают бактерии Alistipes, Anaeroplasma, Barnesiella, Bifidobacterium, Butyricimonas, Butyrivibrio, Coprococcus, Fastidiosipila, Helicobacteer, Hespellia, Marvinbryantia, Oribacterium, Oscillibacter, Prevotella, Roseburia, Ruminococcus, TM7_genera_incertae_sedis и другие. Среди указанных бактерий бактерии Helicobacter, относящиеся к Proteobacteria phylum, способны продуцировать высокоактивный эндотоксин. Кроме того, было установлено, что популяции бактерий, увеличенные берберином, включают бактерии Alistipes, Allobaculum, Bacteroides, Barnesiella, Blautia, Butyricicoccus, Butyricimonas, Dorea, Helicobacter, Hespellia, Holdemania, Lawsonia, Oscillibacter, Parabacteroides, Phascolarctobacterium, Prevotella и Sedimentibacter. Среди указанных бактерий бактерии Blautia, Allobaculum, Prevotella, Bacterioides и Butyricimonas присутствуют в достаточно большом количестве и способны продуцировать короткоцепные жирные кислоты.

Таким образом, при введении субъекту берберин способен увеличивать количество бактерий, продуцирующих короткоцепные жирные кислоты, и уменьшать количество бактерий, продуцирующих эндотоксин, в популяции кишечной микробиоты.

Берберин повышает уровень короткоцепных жирных кислот в кишечнике крыс, получавших нормальный рацион или рацион с высоким содержанием жира

Содержание короткоцепных жирных кислот (включающих уксусную кислоту, пропионовую кислоту, масляную кислоту, валериановую кислоту, изомасляную кислоту, изовалериановую кислоту и т.д.) в фекалиях крыс анализировали с помощью газовой хроматографии. Полученные результаты показали, что пероральное введение 100 мг/кг массы тела позволяет повысить уровень короткоцепных жирных кислот в кишечнике крыс, получавших нормальный рацион или рацион с высоким содержанием жира. Особенно выраженным является воздействие на уровни уксусной кислоты и пропионовой кислоты (фигура 3). Таким образом, берберин способен повышать уровень короткоцепных жирных кислот в кишечнике крыс, получавших нормальный рацион или рацион с высоким содержанием жира.

Берберин уменьшает фенотип ожирения крыс.

Массу тела крыс во всех четырех группах контролировали и анализировали на протяжении всех экспериментов. Полученные результаты показали, что после скармливания рациона с высоким содержанием жира в течение 18 недель крысы в группе HFD имели значительно большую массу тела по сравнению с группой, получавшей нормальный рацион (Р<0,01); внутрижелудочное введение берберина в дозе 100 мг/кг массы тела эффективно ограничивает увеличение массы тела крыс, особенно у крыс, получавших рацион с высоким содержанием жира. Особенно удивительным результатом является то, что в течение всего эксперимента масса тела крыс в группе HFD+BBR оставалась на таком же уровне, что и в группе, получавшей нормальный рацион, при отсутствии статистически значимого отличия (Р>0,05). Берберин также в некоторой степени влиял на массу тела крыс, получавших нормальный рацион (фигура 4).

В конце эксперимента животных умерщвляли. Измеряли массу тела натощак, массу эпидидимальной жировой ткани и массу периренальной жировой ткани. На фигуре 4В приведен индекс ожирения ([масса эпидидимальной жировой ткани + масса периренальной жировой ткани]/масса тела натощак ×100). После скармливания рациона с высоким содержанием жира в течение 18 недель индекс ожирения в группе HFD был значительно выше, чем в группе NCD, при этом введение берберина позволяет значительно снизить индекс ожирения. Кроме того, ни рацион с высоким содержанием жира, ни берберин не оказали существенного воздействия на печень и поджелудочную железу, из чего следует, что длительное введение берберина не оказывает очевидного побочного эффекта на нормальные физиологические функции крысы. Результаты измерения калорий, потребляемых крысами, показали, что пероральное введение берберина в дозе 100 мг/кг массы тела оказывает значительное ингибирующее воздействие на потребление корма крысами, особенно крысами, получавшими рацион с высоким содержанием жира (фигура 4С).

Берберин уменьшает восприимчивость к инсулину у крыс, получавших нормальный рацион или рацион с высоким содержанием жира.

У крыс во всех четырех экспериментальных группах измеряли уровень глюкозы в крови натощак (FBG) и уровень инсулина в сыворотке натощак (FINS). Крысы, получавшие HFD в течение 18 месяцев, характеризовались значительно более высоким уровнем FBG по сравнению с аналогичным показателем в группе NCD. Весьма удивительным является то, что берберин эффективно снижал FBG у крыс в группах NCD и HFD, особенно у крыс в группе HFD, где снижение FBG было значительным (Р<0,05) (фигура 5А). Результат воздействия берберина на уровень инсулина показан на фигуре 5В. Уровень инсулина в сыворотке натощак (FINS) у крыс, получавших рацион с высоким содержанием жира (HFD), был значительно выше по сравнению с аналогичным показателем у крыс в группе NCD; однако после введения берберина в дозе 100 мг/кг массы тела в течение 18 месяцев уровень FINS значительно снизился даже у крыс, получавших рацион с высоким содержанием жира (HFD+BBR), достигнув уровня, сравнимого с уровнем, имевшим место у крыс, получавших нормальный рацион. На фигуре 5С приведено значение индекса устойчивости к инсулину HOMA, характеризующее устойчивость крыс к инсулину, которое показывает, что после скармливания рациона с высоким содержанием жира в течение 18 недель у крыс возникла очевидная устойчивость к инсулину, но введение берберина в дозе 100 мг/кг массы тела предотвращает возникновение устойчивости к инсулину (Р<0,05).

Для дальнейшего исследования восприимчивости к инсулину был выполнен анализ пероральной пробы на толерантность к глюкозе и внутрибрюшинной пробы на толерантность к инсулину; полученные результаты приведены соответственно на фигурах 5D и 5Е. В соответствии с результатами FBG и FINS после скармливания рациона с высоким содержанием жира в течение 18 недель показатели пероральной пробы на толерантность к глюкозе и внутрибрюшинной пробы на толерантность к инсулину были существенно ухудшены, в то время как введение берберина в дозе 100 мг/кг массы тела в значительной степени предотвратило снижение толерантности к глюкозе и толерантности к инсулину, из чего следует, что берберин может играть важную роль в улучшении глюкозного обмена.

Берберин снижает уровень системного воспаления у крыс, получавших рацион с высоким содержанием жира.

Для оценки уровней системного воспаления у крыс во всех четырех экспериментальных группах измеряли уровни белка (LBP), связывающего липополисахарид (LPS), протеина-1, являющегося хемоаттрактантом моноцитов (МСР-1), лептина и адипонектина в сыворотке; полученные результаты приведены на фигуре 6. Результаты экспериментов показывают, что скармливание рациона с высоким содержанием жира существенно повышает уровень LBP в сыворотке, но введение берберина в дозе 100 мг/кг массы тела в значительно степени подавляет повышение уровня LBP в сыворотке (Р<0,05, фигура 6А).

МСР-1 является провоспалительным цитокином, вызывающим хемотаксис и активацию моноцитов/макрофагов. С МСР-1 тесно связано возникновение и развитие многих воспалительных заболеваний, в том числе атеросклероза, ожирения, диабета 2-го типа, артрита, сепсиса и хронических бактериальных инфекций. Результаты данного эксперимента показали, что в процессе постепенного возникновения ожирения и устойчивости к инсулину, вызываемых у крыс рационом с высоким содержанием жира, уровень МСР-1 постепенно повышается; однако после введения берберина уровень МСР-1 значительно снизился, при этом весьма удивительным является то, что уровень МСР-1 был даже ниже, чем у крыс в группе NCD (фигура 6В).

Лептин является гормоном, секретируемым жировой тканью, который широко участвует в липидном, глюкозном и энергетическом обмене. Результаты, полученные при выполнении данного эксперимента, показали, что уровень лептина в сыворотке у крыс в группе HFD значительно выше, чем у крыс в группе NCD (P<0,01); однако берберин позволил существенно снизить уровень лептина в сыворотке, особенно у крыс, получавших рацион с высоким содержанием жира, (Р<0,05, фигура 6С).

Во всех четырех группах были исследованы уровни адипонектина. Полученные результаты показывают, что уровень адипонектина, нормализованный относительно массы жировой ткани, был значительно ниже у крыс в группе HFD по сравнению с аналогичным показателем в группе NCD (Р<0,001); однако введение берберина позволило существенно повысить уровень адипонектина у крыс, получавших HFD (P<0,01, фигура 6D). Таким образом, берберин улучшает популяцию кишечной микробиоты, снижает уровни LPB, МСР-1 и лептина и повышает секрецию адипонектина. В таблице 1 приведены последовательности V3-области гена рРНК 16S бактерий, обогащенных берберином.

Приведенное выше подробное описание изобретения содержит ссылку на прилагаемые чертежи, которые составляют часть описания изобретения. На чертежах одинаковые символы обычно обозначают одинаковые компоненты за исключением тех случаев, когда из контекста следует обратное. Иллюстративные варианты осуществления изобретения, представленные в подробном описании изобретения, на чертежах и в формуле изобретения, не ограничивают объем изобретения. Могут быть использованы другие варианты осуществления изобретения и внесены другие изменения, не выходящие за пределы существа или объема изобретения. Следует отметить, что объекты изобретения, рассмотренные в настоящем описании изобретения и иллюстрированные чертежами, могут быть расположены, замены, объединены, разделены и спроектированы в разных конфигурациях, которые полностью входят в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение не ограничено конкретными вариантами его осуществления, рассмотренными в данной заявке, которые служат только для иллюстрации разных объектов изобретения. В настоящее изобретение могут быть внесены многие модификации и изменения, не выходящие за пределы существа и объема изобретения, как должно быть очевидно специалистам в данной области. Из приведенного выше описания изобретения специалистам в данной области должны быть очевидны функционально эквивалентные способы и устройства, входящие в объем изобретения, помимо рассмотренных в настоящем описании изобретения. Такие модификации и изменения входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Настоящее изобретение должно быть ограничено только прилагаемой формулой изобретения наряду с полным объемом эквивалентов, охватываемых данной формулой изобретения. Следует отметить, что настоящее описание изобретения не ограничено конкретными способами, реагентами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые, несомненно, могут изменяться. Кроме того, следует отметить, что терминология, приведенная в настоящем описании изобретения, использована только с целью описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не ограничивает объем изобретения.

Что касается использования терминов во множественном и/или единственном числе, то специалисты в данной области могут интерпретировать термины во множенном числе как термины в единственном числе и/или термины в единственном числе как термины во множественном числе в зависимости от контекста и/или применения. Разные изменения форм единственного/множественного числа могут быть специально указаны в настоящем описании изобретения для достижения большей ясности изложения.

Как должно быть понятно специалистам в данной области, термины, использованные в настоящем описании изобретения и особенно в прилагаемой формуле изобретения (например, в основной части прилагаемой формулы изобретения), как правило, представлены в виде ”открытых” терминов (например, термин “включающий” следует интерпретировать как ”включающий, но не ограниченный”, термин ”имеющий” следует интерпретировать как ”имеющий по меньшей мере”, термин ”включает” следует интерпретировать как ”включает, но не ограничен” и т.д.). Специалистам в данной области также должно быть понятно, что конкретное число, которое предполагается привести в формуле изобретения, будет включено в формулу изобретения, и отсутствие такого указания означает отсутствие такого намерения. Например, приведенная ниже формула изобретения может содержать вводные фразы ”по меньшей мере один” и “один или несколько” для указания объектов. Однако использование таких фраз не следует рассматривать как ограничение любого конкретного пункта формулы изобретения, содержащего только один объект, даже когда пункт формулы изобретения включает вводные фразы “один или несколько” или “по меньшей мере один” и объект в единственном числе (например, объект в единственном числе следует интерпретировать как ”по меньшей мере один” или “один или несколько”). Кроме того, даже если точно указано численное значение объекта, специалистам в данной области должно быть понятно, что такое указание следует интерпретировать как по меньшей мере данное число (например, фраза ”два объекта” без других определений означает по меньшей мере два объекта либо два или более объектов). Далее в тех случаях, когда использована фраза, аналогичная фразе ”по меньшей мере один из А, В, С и т.д.”, такую конструкцию следует интерпретировать, например, как “систему, имеющую по меньшей мере один из А, В и С”, которая включает, но не ограничивается системами, имеющими только А, только В, только С, вместе А и В, вместе А и С, вместе В и С и/или вместе А, В и С”, и т.д. Специалистам в данной области должно быть также понятно, что фактически любое разделяющее слово и/или фраза, представляющая два или более альтернативных терминов в описании изобретения, формуле изобретения или на чертежах, следует рассматривать как возможность включения одного из терминов, любого из терминов или обоих терминов. Например, фраза ”А или В” означает возможность использования ”А” или “В” либо “А и В”.

Кроме того, когда признаки или объекты изобретения описаны в виде групп Маркуша, специалистам в данной области должно быть понятно, что может быть использован любой отдельный член или подгруппа членов группы Маркуша.

Как должно быть понятно специалисту в данной области, любые диапазоны, указанные в настоящем описании изобретения, включают любые и все возможные поддиапазоны и комбинации указанных поддиапазонов. Любой приведенный диапазон может быть разбит по меньшей мере на равные половины, трети, четверти, пятые части, десятые части и т.д. В качестве неограничивающего примера можно отметить, что каждый диапазон, приведенный в настоящем описании изобретения, может быть легко разбит на три части и т.д. Как должно быть понятно специалисту в данной области, такие фразы как ”до определенного числа”, “по меньшей мере” и тому подобные включают указанное число и относятся к диапазонам, которые могут быть затем разбиты на вышеуказанные поддиапазоны. И наконец, как должно быть понятно специалисту в данной области, в диапазон входят все отдельные числа. Так, например, группа, состоящая из 1-3 элементов, означает группы, включающие 1, 2 или 3 элемента. Аналогичным образом группа, содержащая 1-5 элементов, означает группы, включающие 1, 2, 3, 4 или 5 элементов, и так далее.

Из вышеизложенного следует, что разные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в целях иллюстрации, и возможны разные модификации, не выходящие за пределы объема и существа изобретения. Таким образом, разные варианты осуществления изобретения, рассмотренные в настоящем описании изобретения, не ограничивают изобретение, и действительный объем и существо изобретения изложены в нижеследующей формуле изобретения.

Реферат

Группа изобретений относится к медицине и предназначена для улучшения структуры кишечной микробиоты. Описано применение берберина, позволяющее избирательно увеличивать первую популяцию кишечной микробиоты при одновременном уменьшении второй популяции кишечной микробиоты у субъекта. Первая популяция кишечной микробиоты включает бактерию, продуцирующую короткоцепочечную жирную кислоту (SCFA), и вторая популяция кишечной микробиоты включает бактерию, продуцирующую эндотоксин. Группа изобретений позволяет улучшить структуру кишечной микробиоты. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 1 пр.

Формула