Композиции и способы для диагностики и мониторинга гипертиреоза у животных семейства кошачьих - RU2593952C2

Описание

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение относится к композициям, материалам и способам для диагностики и/или мониторинга гипертиреоза у животных семейства кошачьих и заболеваний и нарушений у животных семейства кошачьих, связанных с гипертиреозом или обусловленных им.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Гипертиреоз является наиболее распространенным гормональным нарушением у животных семейства кошачьих. Он является наиболее распространенным у пожилых кошек, и несколько более распространен у самок, чем у самцов. Гипертиреоз вызывается избыточной продукцией гормонов щитовидной железы, в частности, тироксина или T-4. Избыточная продукция T-4 может значительно увеличить базовую скорость метаболизма животного, что приводит к снижению массы тела, увеличению аппетита, беспокойному состоянию, скудному волосяному покрову, тахикардии, увеличению питья и мочеиспускания, рвоте, диарее, одышке, затрудненности дыхания, лихорадке, повышенному кровяному давлению и в конечном итоге к слабости, вялости, дрожанию мышц, истощению и смерти. Развернутый гипертиреоз часто ассоциирован с проблемами почек и проблемами сердца. Эффективные способы лечения включают использование лекарственных средств, таких как метимазол или карбимазол, которые ингибируют продукцию гормонов щитовидной железы, терапию радиоактивным йодом, которая разрушает сверхактивные клетки щитовидной железы, и хирургическую тиреоидэктомию. Однако если заболевание выявляют слишком поздно, повреждение может быть необратимым. Таким образом, ранняя диагностика является критически важной.

[0003] Наиболее распространенным исследованием для диагностики гипертиреоза является тест крови на T-4, где значительно повышенные уровни T-4 указывают на гипертиреоз, или тест подавления с T-3, который измеряет подавление T-4 в ответ на введение T-3, где отсутствие подавления указывает на состояние гипертиреоза. Однако уровень T-3 и T-4 у животных семейства кошачьих может колебаться в течение суток, что делает эти тесты ненадежными, и также существуют различные заболевания, которые могут искусственно снижать уровни T-4, таким образом, маскируя состояние гипертиреоза. Возможна радиовизуализация щитовидной железы с использованием технеция, и она может быть пригодной для выявления опухолей и аномальных тканей щитовидной железы, однако она является дорогостоящей.

[0004] Таким образом, существует потребность в альтернативных действенных и эффективных способах выявления гипертиреоза у животных семейства кошачьих.

[0005] Был разработан ряд способов для исследования дифференциальной экспрессии генов, например, ДНК-микрочипы, секвенирование маркерных экспрессированных последователностей (EST), серийный анализ экспрессии генов (SAGE), вычитательная гибридизация, вычитательное клонирование и дифференциальный дисплей (DD) для мРНК, ПЦР с произвольной затравкой РНК (RAP-ПЦР), ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР), репрезентативный анализ отличий (RDA), двумерный гель-электрофорез, масс-спектрометрия и белковый микрочип на основе связывания антител для белков.

[0006] Вследствие сложности биологических каскадов, вовлеченных в гипертиреоз и присущих им молекулярных взаимодействий и процессов внутриклеточной передачи сигнала, высоко желательно понимать происходящие взаимодействия на генетическом уровне. Выявление генов с нарушенной регуляцией на ранних стадиях гипертиреоза у животных семейства кошачьих является полезным для понимания биологии гипертиреоза у животных семейства кошачьих, исходя из генома в целом, что может быть полезным при создании способов определения риска развития гипертиреоза, предрасположенности к гипертиреозу, диагностики, и разработки, и мониторинга плана лечения гипертиреоза.

[0007] Более детальное понимание вовлекаемых биологических путей с помощью определения профиля экспрессии генов может способствовать разработке диагностических способов, реагентов и тестовых наборов, а также полезных фармацевтических, нутрицевтических и пищевых (диетологических) вмешательств в связанные с заболеванием каскады. Эти подходы могут обеспечить раннее выявление и, возможно, профилактику или лечение основного нарушения. Гены с нарушенной регуляцией, вовлеченные в патологию щитовидной железы, могут служить в качестве важных биомаркеров для диагностики и потенциально предупреждения или лечения нарушения и для оптимизации выбора подходящих фармацевтических, нутрицевтических и пищевых (диетологических) вмешательств.

[0008] Уровень экспрессии генов и/или определение уровня функционирования экспрессированного продукта гена у животных семейства кошачьих можно использовать для выбора подходящего средства для терапевтического или профилактического применения. Эти данные может использовать квалифицированный специалист при выборе подходящих лекарственных средств в качестве средств для профилактики или лечения заболеваний почек у животных семейства кошачьих путем определения профиля экспрессии генов. Данные и анализ экспрессии генов также можно использовать для выбора пищевых композиций, добавок в рацион и нутрицевтических средств, имеющих полезный эффект в отношении обеспечения нормальных характеристик функции щитовидной железы, с использованием биомаркеров, указывающих на состояние здоровья с точки зрения функционирования почки.

[0009] Только очень ограниченная работа была проведена к настоящему времени для скрининга генома животных семейства кошачьих в отношении профилей экспрессии генов применительно к диагностике заболеваний у животных семейства кошачьих. Исследования в здоровых группах животных семейства кошачьих относительно групп с заболеванием, таким как гипертиреоз, как описано в настоящем описании, не проводились на широкой основе. Мало данных доступно в отношении профиля экспрессии генома животных семейства кошачьих, особенно в отношении развития заболеваний почек у животных семейства кошачьих с течением времени.

[0010] Гипертиреоз является основной причиной смерти у животных семейства кошачьих. Чтобы эффективно лечить гипертиреоз, необходима ранняя диагностика и лечение до возникновения необратимого повреждения сердца и/или почек. Таким образом, существует потребность в улучшенных способах идентификации животных, имеющих гипертиреоз или обладающих повышенным риском гипертиреоза, так чтобы их можно было лечить надлежащим образом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Авторы изобретения исследовали экспрессию генов в ткани щитовидной железы и цельной крови животных семейства кошачьих с гипертиреозом. В исследовании ткани выявлено 1308 генов с дифференциальной экспрессией между животными семейства кошачьих с гипертиреозом и животными семейства кошачьих без гипертиреоза с FDR (уровень ложноположительных результатов) = 0,1 и кратностью изменения экспрессии >=+/-1,25. В исследовании цельной крови выявлено 1094 значимых генов между животными семейства кошачьих с гипертиреозом и животных семейства кошачьих без гипертиреоза с тем же пороговым значением, что указан выше. В исследовании ткани выявлено, что все гены, известные тем, что они вовлечены в каскад, ведущий к продукции гормонов щитовидной железы, обладают повышенной активацией у животных семейства кошачьих с гипертиреозом. Увеличенная экспрессия этих генов явно вносит вклад в высокую продукцию T4 в организме животных семейства кошачьих. В исследовании цельной крови выявлено, что 60 генов перекрываются с генами, выявленными в работе с солидной тканью, и они, по-видимому, регулируются в том же направлении, как выявлено в исследовании ткани. С использованием этих 60 генов животных семейства кошачьих с гипертиреозом можно отличить от нормальных животных семейства кошачьих путем исследования в цельной крови, а также в ткани. Эти 60 генов, приведенные в таблицах A и B ниже, могут позволить выявление животных семейства кошачьих с гипертиреозом.

[0012] Таким образом, настоящее изобретение относится к композициям, материалам и способам для диагностики и/или мониторинга гипертиреоза у животных семейства кошачьих и заболеваний и нарушений у животных семейства кошачьих, связанных с гипертиреозом или обусловленных им, включая композиции и способы для: определения риска развития гипертиреоза, идентификации предрасположенности к гипертиреозу, диагностики гипертиреоза, разработки и мониторинга плана лечения гипертиреоза, и мониторинга статуса гипертиреоза у животного семейства кошачьих, где гипертиреоз выявляют с использованием по меньшей мере одного характерного биомаркера, выделенного из и измеренного в образце для биологического исследования, взятом от такого животного семейства кошачьих, где экспрессия биомаркера положительно или отрицательно коррелирует с заболеванием. Характерный биомаркер для применения на практике композиций и способов по настоящему изобретению включает полинуклеотид или белок, присутствующий в таком образце для биологического исследования такого животного семейства кошачьих. Образец для биологического исследования для применения на практике способа по изобретению может включать, например, образец ткани от такого животного семейства кошачьих. Биомаркеры также выбирают основываясь на том, чтобы они были секретируемыми, так чтобы их можно было выявить в сыворотке или плазме крови или в моче. Таким образом, образец для биологического исследования также может представлять собой образец биологической жидкости, взятый от такого животного семейства кошачьих, например, крови или мочи.

[0013] Гены, для которых выявлено, что они являются особенно активированными при избыточной продукции гормона щитовидной железы, включают:

[0014] IYD (увеличение в 4,55 раз): Этот ген кодирует фермент, который катализирует окислительное NADPH-зависимое дейодирование моно- и дийодтирозина, которые являются галогенированными побочными продуктами продукции гормонов щитовидной железы. N-конец белка выполняет функцию мембранного якоря. Мутации в этом гене вызывают врожденный гипотиреоз вследствие дисгормоногенеза 4 типа, который также называют дефицитом дейодиназы или дефицитом йодтирозиндегалогеназы, или гормоногенезом щитовидной железы 4 типа.

[0015] TG (увеличение в 2,02 раза): Тиреоглобулин (Tg) представляет собой гомодимер гликопротеина, продуцируемый, главным образом, щитовидной железой. Он действует в качестве субстрата для синтеза тироксина и трийодтиронина, а также хранения неактивных форм гормона щитовидной железы и йода. Тиреоглобулин секретируется из эндоплазматической сети в его область йодирования и последующего биосинтеза тироксина в просвете фолликул. Мутации этого гена вызывают дисгормоногенез щитовидной железы, проявляющийся зобом, и они ассоциированы с врожденным гипотиреозом от умеренного до тяжелого.

[0016] SLC5A5, NIS (увеличение в 4,6 раз): Этот ген кодирует представителя семейства котранспортеров натрия-глюкозы. Кодируемый им белок отвечает за захват йода в ткани, такие как ткань щитовидной железы и лактирующая ткань молочной железы. Йод, захватываемый щитовидной железой, включается в метаболические регуляторы трийодтиронин (T3) и тетрайодтиронин (T4). Мутации в этом гене ассоциированы с дисгормоногенезом щитовидной железы 1.

[0017] TPO (увеличение в 4,06 раз): Этот ген кодирует связанный с мембраной гликопротеин. Кодируемый белок действует в качестве фермента и играет центральную роль в функции щитовидной железы. Белок участвует в йодировании остатков тирозина в тиреоглобулина и образовании фенокси-сложного эфира между парами йодированных остатков тирозина для формирования гормонов щитовидной железы, тироксина и трийодтиронина. Мутации в этом гене ассоциированы с тяжелыми нарушениями гормоногенеза щитовидной железы, включая врожденный гипотиреоз, врожденный зоб и дефект органификации гормона щитовидной железы IIA.

[0018] TSHR (увеличение в 2,2 раза): Белок, кодируемый этим геном, представляет собой мембранный белок и он является основным регулятором метаболизма клеток щитовидной железы. Кодируемый белок представляет собой рецептор для тиреотропина и тиреостимулина, и его активность опосредуется аденилатциклазой. Дефекты в этом гене являются причиной тяжелых типов гипертиреоза.

[0019] DUOX2, ThOX (увеличение в 1,55 раза): Белок, кодируемый этим геном, представляет собой гликопротеин, и он является представителем семейства NADPH-оксидазы. Синтез гормона щитовидной железы катализируется белковым комплексом, расположенным на апикальной мембране клеток фолликулов щитовидной железы. Этот комплекс содержит переносчик йодидов, тиреопероксидазу, и генерирующую пероксид систему, которая включает этот кодируемый белок и DUOX1. Этот белок известен в качестве двойной оксидазы, поскольку он имеет как домен гомологии пероксидазы, так и домен gp91phox.

[0020] Другие гены, которые активируются как в крови, так и в ткани щитовидной железы животных семейства кошачьих с гипертиреозом, включают следующие:

[0021]

[0022] Таким образом, например, активация генов в этой таблице A может служить в качестве биомаркера гипертиреоза. Ранее не было известно, что эти гены вовлечены в гипертиреоз. Например, TGFB1 кодирует представителя семейства цитокинов трансформирующего фактора роста бета (TGFB), которые представляют собой многофункциональные пептиды, которые регулируют пролиферацию, дифференцировку, адгезию, миграцию и другие функции во многих типах клеток. Этот белок положительно и отрицательно регулирует множество других факторов роста. Секретируемый белок расщепляется на ассоциированный с латентностью пептид (LAP) и зрелый пептид TGFB1. Зрелый пептид также может образовывать гетеродимеры с другими представителями семейства TGFB. Этот ген часто активирован в опухолевых клетках и мутации в этом гене приводят к болезни Камурати-Энгельманна. Ранее не было известно, что он вовлечен в функцию щитовидной железы. CSTD кодирует лизосомальную аспартилпротеазу. Эта протеаза, которая является представителем семейства пептидазы C1, обладает специфичностью, сходной, но более узкой, чем у пепсина A. Транскрипция этого гена начинается с нескольких участков, включая участок, который является участком начала для регулируемого эстрогеном транскрипта. Мутации в этом гене вовлечены в патогенез нескольких заболеваний, включая рак молочной железы и, возможно, болезнь Альцгеймера. Ранее не было известно, что этот ген вовлечен в функцию щитовидной железы.

[0023] Гены, которые ингибируются как в крови, так и в ткани щитовидной железы животных семейства кошачьих с гипертиреозом, включают:

[0024]

[0025] Таким образом, например, подавление генов, представленных в этой таблице B, может служить в качестве биомаркеров для гипертиреоза. Например, белок, кодируемый геном DCN, является небольшим клеточным или околоклеточным матриксным протеогликаном, который является близкородственным по структуре белку бигликану. Он является компонентом соединительной ткани, связывается с фибриллами коллагена типа I и играет роль в сборке матрикса. Он способен подавлять рост различных опухолевых клеточных линий. Этот ген является геном-кандидатом для синдрома Марфана. Ранее не было известно, что он связан с функцией щитовидной железы. SEPP1 является секретируемым белком и является необычным тем, что он содержит 10 остатков селеноцистеина на полипептид, составляя наибольшую часть селена в плазме. Он является внеклеточным антиоксидантом и вовлечен в транспорт селена, однако ранее не было известно, что он вовлечен в функцию щитовидной железы.

[0026] Таким образом, изобретение относится к способу (способ 1) диагностики гипертиреоза или определения риска или предрасположенности к гипертиреозу у животных семейства кошачьих путем измерения уровня экспрессии одного или более биомаркеров у указанного животного семейства кошачьих, причем указанные один или более биомаркеров выбраны из группы, состоящей из генов, приведенных в таблице A (например, TGFB1 и/или CSTD) и B (например, DCN и/или SEPP1), или любых из следующих генов: IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 и DUOX2 (ThOX); продуктов экспрессии этих генов; и любой их комбинации, где измененная экспрессия одного или более, например, по меньшей мере трех, например, пяти или более, например, по меньшей мере десяти из указанных биомаркеров относительно нормальной популяции или измененная экспрессия относительно индивидуального исходного уровня у животного семейства кошачьих указывает на гипертиреоз или увеличенный риск или предрасположенность к гипертиреозу, например, в соответствии со следующими способами:

1.1. Способ 1, где уровень экспрессии одного или более биомаркеров определяют с использованием либо (i) ДНК-микрочипа, содержащего один или более олигонуклеотидов, комплементарных мРНК или кДНК, соответствующих одному или более маркерным генам, подлежащим определению, либо (ii) количественной полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами для мРНК или кДНК, соответствующих одному или более маркерным генам, подлежащим определению, например,

a. Указанный выше способ, где стадия определения экспрессии гена одного или более биомаркеров включает (i) выделение РНК из образца ткани, (ii) обратную транскрипцию РНК для получения соответствующей кДНК, (iii) выделение и фрагментацию полученной таким образом кДНК, (iv) приведение фрагментов кДНК в контакт с ДНК-микрочипом, содержащим один или более олигонуклеотидов, комплементарных кДНК, соответствующей одному или более подлежащим определению биомаркерам, и (v) выявление гибридизации между фрагментами кДНК и одним или более олигонуклеотидами в ДНК-микрочипе.

b. Любой из предшествующих способов, вовлекающих выявление гибридизации, где гибридизация между фрагментами кДНК и одним или более олигонуклеотидами в ДНК-микрочипе происходит в жестких условиях.

1.2. Способ 1, где уровень экспрессии биомаркера выявляют с помощью антитела к экспрессирующемуся белку.

a. Способ 1.2, где биомаркер выявляют с помощью иммуноанализа, выбранного из конкурентного анализа связывания, неконкурентного анализа связывания, радиоиммунного анализа, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), сэндвич-анализа, реакции преципитации, анализа иммунодиффузии в геле, флуоресцентного иммуноанализа, хемилюминесцентного иммуноанализа, иммуноанализа иммуно-ПЦР, иммуноанализа с белком A или белком G и анализа способом иммуноэлектрофореза.

b. Указанный выше способ, который представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

c. Способ 1.2, где анализ представляет собой иммунохроматографический анализ в боковом потоке.

d. Способ 1.2, где биологический образец представляет собой кровь или мочу.

1.3. Способ 1, где уровень экспрессии биомаркера выявляют путем определения с помощью количественной масс-спектроскопии экспрессируемого белка в биологическом образце, например, где биологическим образцом является кровь или моча.

1.4. Способ 1, где уровень экспрессии биомаркера определяют с помощью аптамера, распознающего экспрессированный белок.

a. Способ 1.4, где аптамер представляет собой олигонуклеотид.

b. Способ 1.4, где аптамер представляет собой пептид.

c. Способ 1.4, где биологический образец представляет собой кровь или мочу.

1.5. Любой из предшествующих способов, где уровень экспрессии одного или более биомаркеров в биологическом образце относительно контрольной величины экспрессии в нормальном образце превышает 1,25 раза, например, изменяется по меньшей мере на 30%.

1.6. Любой из предшествующих способов, где уровень экспрессии одного или более биомаркеров в биологическом образце нормализуют относительно экспрессии одного или более генов, известных тем, что они имеют относительно постоянную экспрессию.

1.7. Любой из предшествующих способов, где биологический образец представляет собой образец ткани щитовидной железы.

1.8. Любой из предшествующих способов, где биологический образец представляет собой кровь.

1.9. Любой из предшествующих способов, дополнительно включающий предоставление животному семейства кошачьих, у которого диагностированы гипертиреоз, или увеличенный риск, или предрасположенность к гипертиреозу, рациона, который ограничен по одному или более из йода, селена или арахидоновой кислоте, например, рациона, где уровень йода составляет менее 0,35 мг/кг, например 0,01-0,25 мг/кг, уровень селена составляет менее 0,1 мг/кг, например 0,01-0,05 мг/кг, и/или уровень арахидоновой кислоты меньше или равен 0,02%, например, 0,005-0,01%.

1.10. Любой из предшествующих способов, дополнительно включающий проведение у животного семейства кошачьих, у которого диагностированы гипертиреоз, или увеличенный риск, или предрасположенность к гипертиреозу, лечение для снижения продукции гормона щитовидной железы, например, введение эффективного количества лекарственного средства, которое ингибирует продукцию T-4, например, метимазола или карбимазола, и/или проведение терапии радиоактивным йодом, и/или проведение хирургической тиреоидэктомии.

[0027] В следующем варианте осуществления изобретение относится к реагентам, необязательно меченым, пригодным для выявления уровня экспрессии одного или более биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1, и их продуктов экспрессии, например,

a. Антитела, например моноклональные антитела, одноцепочечные антитела и функциональный фрагменты антител, распознающие белки, выбранные из группы, состоящей из продуктов экспрессии IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или генов из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1.

b. Аптамеры, например, аптамеры на основе нуклеиновой кислоты или пептидные аптамеры, распознающие белки животных семейства кошачьих, выбранные из группы, состоящей из продуктов экспрессии IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или генов из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1.

c. Выделенный и очищенный или рекомбинантный белок животного семейства кошачьих, выбранный из группы, состоящей из продуктов экспрессии IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или генов из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1.

d. Олигонуклеотидные зонды, способные гибридизоваться с геном животного семейства кошачьих, выбранным из группы, состоящей из IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или генов из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1.

e. В следующем варианте осуществления изобретение относится к набору (Набор 1) для диагностики, прогнозирования или мониторинга нарушения щитовидной железы у животного семейства кошачьих, включающему

i. средство для измерения экспрессии генов одного или более биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1, и их продуктов экспрессии, в биологическом образце от указанного животного семейства кошачьих, и

ii. инструкции по применению такого средства для определения экспрессии одного или более биомаркеров в биологическом образце от указанного животного семейства кошачьих и оценки риска, предрасположенности или присутствия процесса, ведущего к нарушению щитовидной железы у животного семейства кошачьих, например,

1.1 Набор 1, где средство для измерения одного или более биомаркеров, представляет собой один или более зондов на основе нуклеиновой кислоты, способных выявлять экспрессию гена одного или более биомаркеров.

1.2 Любой из предшествующих наборов, содержащий ДНК-микрочип, содержащий один или более зондов на основе нуклеиновой кислоты, способных выявлять экспрессию генов одного или более биомаркеров.

1.3 Набор 1, где средство для определения одного или более биомаркеров представляет собой одно или более антител, способных выявлять экспрессию генов одного или более биомаркеров путем распознавания экспрессированного белка.

1.4 Набор 1.3 в формате ELISA, содержащий антитело, способное выявлять один или более биомаркеров; выделенный, очищенный или рекомбинантный белок, соответствующий экспрессированному белку; и буфер.

1.5 Набор 1, где средство для измерения одного или более биомаркеров представляет собой один или более аптамеров, например, как описано выше, способных выявлять экспрессию гена одного или более биомаркеров путем распознавания экспрессированного белка.

1.6 Любой из указанных выше наборов, адаптированных для применения в любом из указанных выше способов 1 и т.д.

[0028] Кроме того, настоящее относится к применению

нуклеотидной последовательности, соответствующей или комплементарной гену IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1,

или антитела к белку, выбранному из IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1, или

аптамера к белку, выбранному из IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1, или

выделенного, очищенного или рекомбинантного белка животного семейства кошачьих, выбранного из IYD, TG, SLC5A5, NIS, TPO, TSHR, DUOX1 или DUOX2 (ThOX), или из таблицы A или B, например, TGFB1, CSTD, DCN или SEPP1,

в способе согласно способу 1 и т.д., или

для изготовления набора согласно набору 1 и т.д.

[0029] Дальнейшие области применимости настоящего изобретения станут понятными из подробного описания, представленного далее. Следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и указывают на предпочтительный вариант осуществления изобретения, предназначены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0030] Представленное ниже описание предпочтительных вариантов осуществления является только иллюстративным по своей природе и ни в коем случае не предназначено для ограничения изобретения, его применимости или способов применения.

Определенные определения

[0031] Термин "антитело" означает любой иммуноглобулин, который связывается со специфическим антигеном, включая антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин включает поликлональные, моноклональные, одновалентные, гуманизированные, гетероконъюгатные антитела, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифические антитела, диантитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv, или другие антигенсвязывающие фрагменты.

[0032] Термин "чип" означает упорядоченное расположение по меньшей мере двух зондов на субстрате. По меньшей мере один из зондов является контрольным или стандартным, и по меньшей мере один из зондов представляет собой диагностический зонд. Расположение от приблизительно двух до приблизительно 40000 зондов на субстрате обеспечивает то, что размер и интенсивность сигнала для каждого меченого комплекса, образованного между зондом и полинуклеотидом или полипептидом образца, является индивидуально отличимым. Коллекцию молекул, нанесенных на чип, можно получать либо синтетическими, либо биосинтетическими путями. Чип может иметь различные формы, включая библиотеки растворимых молекул, библиотеки соединений, связанных с резиновыми гранулами, чипы на основе кремнизема или другие твердые положки. Чип с нуклеиновыми кислотами может включать библиотеки нуклеиновых кислот, которые можно получать нанесением точками нуклеиновых кислот по существу любой длины (например, от 1 до приблизительно 1000 нуклеотидов в длину) на субстрат. Чип с зондами на основе нуклеиновых кислот предпочтительно содержит нуклеиновые кислоты, связанные с субстратом, в известных положениях. В других вариантах осуществления система может включать твердую подложку или субстрат, такие как мембрана, фильтр, предметное стекло микроскопа, лунка микропланшета, пробирка для образца, гранула, чип с гранулами или сходные с ними. Твердую подложку можно получать из различных материалов, включая бумагу, целлюлозу, нейлон, полистирол, поликарбонат, пластмассу, стекло, керамику, нержавеющую сталь или сходные с ними. Твердая подложка предпочтительно может иметь жесткую или полужесткую поверхность и предпочтительно она может быть сферической (например, гранулы) или по существу плоской (например, плоская поверхность) с подходящими лунками, приподнятыми областями, вытравленными углублениями, или сходными с ними. Твердая подложка также может включать гель или матрицу, в которые могут быть погружены нуклеиновые кислоты.

[0033] Термин "биомаркеры" относится к генам и продуктам генов, кодируемым геном по изобретению или его гомологом, особенно его гомологом животного семейства кошачьих, т.е. где определено, что ген дифференциально экспрессируется в результате заболевания, состояния, нарушения или введения вещества, лекарственного средства, пищевой добавки или компонента рациона, или их комбинации. Биомаркером может быть полинуклеотид, полипептид, белок, РНК, включая РНК-транскрипт или его продукт трансляции, ДНК, кДНК, метаболит одной или более из указанных выше молекул или подходящий вариант любой из указанных выше молекул, дифференциальная экспрессия которого ассоциирована с нарушением щитовидной железы, и где корреляцию такой дифференциальной экспрессии в образце, взятом от исследуемого животного, с образцом, взятым от контрольного животного, можно использовать для диагностики, прогнозирования, мониторинга или лечения состояния, заболевания или нарушения у животного, нуждающегося в этом. Кроме того, биомаркер можно широко использовать для обозначения любой части или сегмента такого гена или белка, которая может идентифицировать или коррелировать с полноразмерным геном или белком, например, в анализе или другом способе по изобретению. Экспрессию биомаркеров также можно идентифицировать путем выявления трансляции биомаркера (т.е. выявления биомаркерного белка в образце). Способы, пригодные для выявления биомаркерного белка, включают любой пригодный способ выявления и/или количественного определения белков из клетки или клеточного экстракта. Такие способы включают, но не ограничиваются ими, иммуноблоттинг (например, вестерн-блоттинг), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA), иммунопреципитацию, иммуногистохимию и иммунофлуоресценцию. Особенно предпочтительные способы выявления белков включают любой анализ отдельных клеток, включая иммуногистохимию и иммунофлуоресцентные анализы. Такие способы хорошо известны в данной области. Более того, антитела против определенных биомаркеров, описанных в настоящем описании, известны в данной области и описаны в общедоступной литературе, и способы их получения хорошо известны квалифицированному специалисту.

[0034] Термин "сравнительно", как используют для сравнения экспрессии в исследуемом образце с контрольным образцом, означает признаки подобного характера или количества и включают, но не ограничиваются ими, величины в пределах одного стандартного отклонения от средней величины, с которой указанное сравнение проводят, и величины, охватывающие дифференциальную экспрессию между исследуемым образцом и контрольным образцом.

[0035] Термины "дифференциально экспрессируемый ген", "дифференциальная экспрессия гена", "дифференциальная экспрессия" или "дифференциально экспрессируемый" и их синонимы, которые используют взаимозаменяемо, относятся к гену, экспрессия которого активирована до более высокого или более низкого уровня у индивидуума, страдающего заболеванием, состоянием или нарушением, или в результате введения вещества, лекарственного средства, пищевой добавки или компонента рациона, или их комбинаций, относительно его экспрессии у нормального или контрольного индивидуума. Термины также включают гены, экспрессия которых активируется до более высокого или более низкого уровня на различных стадиях одного и того же заболевания. Также понятно, что дифференциально экспрессируемый ген может быть либо активирован, либо ингибирован на уровне нуклеиновой кислоты или на уровне белка, или он может подвергаться альтернативному сплайсингу с образованием отличающегося полипептидного продукта. О таких отличиях может свидетельствовать, например, изменение уровней мРНК, поверхностной экспрессии, секреции или иного распределения полипептида. Дифференциальная экспрессия генов может включать сравнение экспрессии между двумя или более генами или их продуктами, или сравнение соотношений экспрессии между двумя или более генами или их продуктами, или даже сравнение двух дифференциально процессированных продуктов одного и того же гена, которые отличаются между нормальными индивидуумами и индивидуумами, страдающими заболеванием, состоянием или нарушением, или в результате введения вещества, лекарственного средства, пищевой добавки или компонента рациона, или их комбинаций, между различными стадиями одного и того же заболевания, состояния или нарушения, или в результате введения различных количеств вещества, лекарственного средства, пищевой добавки или компонента рациона, или их комбинаций. Дифференциальная экспрессия включает как количественные, так и качественные, отличия во временном профиле экспрессии или клеточном профиле экспрессии гена или его продуктов экспрессии среди, например, нормальных и пораженных заболеванием клеток, или среди клеток, которые подверглись различным событиям заболевания или стадиям заболевания. Для целей настоящего изобретения "дифференциальную экспрессию гена" считают существующей, когда существует по меньшей мере приблизительно 2,0-, 1,9-, 1,8-, 1,7-, 1,6-, 1,5-, 1,4-, 1,3-, 1,2-, 1,1- или 1,0-кратное, предпочтительно по меньшей мере приблизительно двукратное или более, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 2,5-, 3- или 4-кратное или более изменение количества транскрибированных полинуклеотидов или транслированного белка в образце.

[0036] Термин "кратный", при использовании в качестве меры дифференциальной экспрессии генов, означает величину экспрессии гена у животного семейства кошачьих, т.е. многократную или дробную величину экспрессии генов по сравнению с величиной экспрессии генов у сравниваемого животного семейства кошачьих, например, животного семейства кошачьих, имеющего симптомы, связанные с гипертиреозом, имеющего риск гипертиреоза или риск наличия гипертиреоза по сравнению с животным, не демонстрирующим такое состояние. Например, ген, который экспрессируется в 2 раза больше у животного по сравнению со сравниваемым животным, имеет 2-кратную дифференциальную экспрессии генов, и ген, который экспрессируется у животного на уровне половины по сравнению с со сравниваемым животным, также имеет 2-кратную дифференциальную экспрессию гена.

[0037] Термин "фрагмент" означает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая является частью полной последовательности и которая имеет ту же или сходную активность для конкретного применения, что и полная полинуклеотидная последовательность, или (2) пептидную или полипептидную последовательность, которая является частью полной последовательности и которая имеет ту же или сходную активность для конкретного применения, что и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут включать любое число нуклеотидов или аминокислот, считающихся пригодными для конкретного применения. Как правило, олигонуклеотидные или полинуклеотидные фрагменты содержат по меньшей мере приблизительно 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов, и полипептидные фрагменты содержат по меньшей мере приблизительно 4, 10, 20 или 50 последовательно расположенных аминокислот из полной последовательности. Термин охватывает полинуклеотидные и полипептидные варианты фрагментов. Полинуклеотид, например, может быть разрушен или фрагментирован на множество сегментов.

[0038] Различные способы фрагментации нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области. Эти способы могут быть, например, либо химическими, либо физическими. Химическая фрагментация может включать частичную деградацию ДНКазой; частичную дупуринизацию кислотой; применение ферментов рестрикции; кодируемые интроном эндонуклеазы; основанные на ДНК способы расщепления, такие как способы образования триплекса и гибрида, которые основаны на специфической гибридизации сегмента нуклеиновой кислоты для локализации расщепляющего агента в конкретной области молекулы нуклеиновой кислоты; или другие ферменты или соединения, которые расщепляют ДНК в известной или неизвестной областях. Физические способы фрагментации могут вовлекать воздействие на ДНК высоких сдвиговых усилий. Высокие сдвиговые усилия могут быть обеспечены, например, путем продвижения ДНК через камеру или канал с углублениями или выступами, или пропускания образца ДНК через проточный канал ограниченного размера, например, отверстие, имеющее поперечный размер микронного или субмикронного порядка. Другие физические способы включают обработку ультразвуком и распыление. Аналогично можно использовать комбинации физической и химической фрагментации, такие как фрагментация нагреванием и опосредуемый ионами гидролиз. См. например, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) ("Sambrook et al), который включен в настоящее описание в качестве ссылки для любых целей. Эти способы можно оптимизировать для расщепления нуклеиновой кислоты на фрагменты выбранного диапазона размеров. Пригодные диапазоны размеров могут составлять от 100, 200, 400, 700 или 1000 до 500, 800, 1500, 2000, 4000 или 10000 пар оснований. Однако также могут быть пригодными более высокие диапазоны размеров, такие как от 4000, 10000 или 20000 до 10000, 20000 или 500000 пар оснований.

[0039] Термин "ген" или "гены" означает полный или неполный сегмент ДНК, вовлеченный в продуцирование полипептида, включая области, предшествующие и следующие после кодирующей области (лидерные и концевые) и встроенные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). Термин охватывает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной для кодирующих гены последовательностей.

[0040] Термин "гомолог" означает (1) полинуклеотид, включающий полинуклеотиды из того же или другого вида животных, имеющие более чем 30%, 50%, 70%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сходство последовательности с полинуклеотидом и имеющие те же или по существу те же свойства и выполняющий ту же или по существу ту же функцию, что и полный полинуклеотид, или обладающие способностью специфично гибридизоваться с полинуклеотидом в жестких условиях или (2) полипептид, включающий полипептиды из того же или отличающегося вида животных, имеющие более чем 30%, 50%, 70%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сходство последовательности с полипептидом, идентифицированным по экспрессии полинуклеотидов, и имеющие те же или по существу те же свойства и выполняющие ту же или по существу ту же функцию, что и полный полипептид, или обладающий способностью специфично связываться с полипептидом, идентифицированным по экспрессии полинуклеотидов. Сходство последовательностей для двух полипептидных последовательностей или двух полинуклеотидных последовательностей определяют с использованием способов, известных квалифицированным специалистам, например, алгоритма Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). Для проведения выравниваний с пропусками для целей сравнения можно использовать Gapped Blast, как описано в Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST, используют параметры по умолчанию и соответствующие программы (например, XBLAST и NBLAST). См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

[0041] Термин "гибридизация" относится к процессу, при котором два одноцепочечных полинуклеотида нековалентно связываются с образованием стабильного двухцепочечного полинуклеотида. Термин "гибридизация" также может относиться к трехцепочечной гибридизации. Полученный (обычно) двухцепочечный полинуклеотид представляет собой "гибрид". Долю совокупности полинуклеотидов, которые образуют стабильные гибриды, называют в настоящем описании "степенью гибридизации".

[0042] Реакции гибридизации можно проводить в форматах абсолютной или дифференциальной гибридизации. В формате абсолютной гибридизации полинуклеотиды, происходящие из одного образца, гибридизуются с зондами на чипе с нуклеиновыми кислотами. Сигналы, выявленные после образования комплексов гибридизации, коррелируют с уровнями полинуклеотида в образце. В формате дифференциальной гибридизации полинуклеотиды, происходящие из двух образцов, метят различными группами для мечения. Смесь эти дифференциально меченных полинуклеотидов добавляют к чипу с нуклеиновыми кислотами. Затем чип с нуклеиновыми кислотами исследуют в условиях, при которых испускание двух различных меток является индивидуально поддающимся детекции. В одном варианте осуществления в качестве частей для мечения для формата дифференциальной гибридизации используют флуорофоры Cy3 и Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.).

[0043] Сигналы, полученные с чипов с нуклеиновыми кислотами, можно анализировать с использованием коммерчески доступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение, предоставляемое Affymetrix или Agilent Technologies. Предпочтительно в эксперименты по гибридизации включают контроли, например, для чувствительности сканирования, мечения зондов и дискретизации кДНК или кРНК. Сигналы гибридизации можно масштабировать или нормализовать перед проведением дальнейшего их анализа. Например, сигналы гибридизации для каждого отдельного зонда можно нормализовать для учета варьирования интенсивности гибридизации, когда используют более одного чипа в сходных условиях тестирования. Сигналы гибридизации также можно нормализовать с использованием интенсивностей, полученных для внутренних контролей для нормализации, содержащихся на каждом чипе. Кроме того, можно использовать гены с относительно постоянными уровнями экспрессии в образцах для нормализации уровней экспрессии других генов. В одном варианте осуществления в чип с нуклеиновыми кислотами по настоящему изобретению включены зонды для определенных поддерживающих генов. Эти гены выбирают, поскольку они демонстрируют стабильные уровни экспрессии среди различных групп тканей. Сигналы гибридизации можно нормализовать и/или масштабировать, исходя из уровней экспрессии этих поддерживающих генов.

[0044] Термин "гибридизационный комплекс" означает комплекс, который образован между полинуклеотидами образца, когда пурины одного полинуклеотида образуют водородные связи с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например, 5'-A-G-T-C-3' образует пары оснований с 3'-T-C-A-G-5'. Степень комплементарности и использование нуклеотидных аналогов влияют на эффективность и жесткость реакций гибридизации.

[0045] Термин "зонды для гибридизации" включает нуклеиновые кислоты (такие как олигонуклеотиды), способные связываться специфичным для оснований образом с комплементарной цепью нуклеиновой кислоты. Такие зонды включают пептидные нуклеиновые кислоты, как описано в Nielsen et al, Science 254: 1497-1500 (1991), Nielsen Curr. Opin. Biotechnol., 10:71-75 (1999) и другие аналоги нуклеиновых кислот и миметики нуклеиновых кислот. См. патент США № 6156501, выданный 3 апреля 1996 года.

[0046] "Последовательность нуклеиновой кислоты" означает олигонуклеотид, нуклеотид или полинуклеотид, и их фрагменты или части, и ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, и соответствуют смысловой или антисмысловой цепи.

[0047] Термин "полинуклеотид" или "олигонуклеотид" означает полимер нуклеотидов. Термин охватывает молекулы ДНК и РНК (включая кДНК и мРНК), либо одноцепочечные, либо двухцепочечные и, в случае одноцепочечных, комплементарную им последовательность либо в линейной, либо в замкнутой форме. Также термин охватывает фрагменты, варианты, гомологи и аллели, в соответствующих случаях, последовательностей, которые имеют те же или по существу те же свойства и выполняют ту же или по существу функцию, что и исходная последовательность. Последовательности могут быть полностью комплементарными (без несовпадений) при выравнивании, или они могут иметь вплоть до 30% несовпадений в последовательности. Предпочтительно, для полинуклеотидов цепь содержит приблизительно от 20 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 150 до 3500 нуклеотидов. Предпочтительно, для олигонуклеотидов цепь содержит приблизительно от 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида зависит от различных факторов и от конкретного применения и использования полинуклеотида или олигонуклеотида. Термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезированы и которые выделены и очищены из природных источников. Термин "полинуклеотид" включает термин "олигонуклеотид".

[0048] Термин "полипептид", "пептид" или "белок" означает полимер аминокислот. Термин охватывает встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе (синтетические) полимеры и полимеры, в которых искусственные химические миметики заменяют одну или более аминокислот. Также термин охватывает фрагменты, варианты и гомологи, которые обладают теми же или по существу теми же свойствами и выполняют ту же или по существу ту же функцию, что и исходная последовательность. Термин охватывает полимеры любой длины, предпочтительно полимеры, содержащие приблизительно от 2 до 1000 аминокислот, более предпочтительно приблизительно от 5 до 500 аминокислот. Термин включает полимеры аминокислот, которые являются синтезированными и которые являются выделенными и очищенными из природных источников.

[0049] Термин "зонд" означает (1) олигонуклеотид или полинуклеотид, либо РНК, либо ДНК, как встречающийся в природе, например, в очищенном продукте расщепления ферментом рестрикции, так и продуцированный синтетически, который способен подвергаться отжигу или специфично гибридизоваться с полинуклеотидом с последовательностями, комплементарными зонду, или (2) пептид или полипептид, способный специфично связывать конкретный белок или фрагмент белка по существу для исключения других белков или фрагментов белков. Олигонуклеотидный или полинуклеотидный зонд может быть либо одноцепочечным, либо двухцепочечным. Точная длина зонда зависит от многих факторов, включая температуру, источник и применение. Например, для диагностических применений, в зависимости от комплексности последовательности-мишени, олигонуклеотидный зонд, как правило, содержит приблизительно от 10 до 100, от 15 до 50 или от 15 до 25 нуклеотидов. В определенных диагностических применениях полинуклеотидный зонд содержит приблизительно 100-1000, 300-600, нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 300 нуклеотидов. Зонды, описанные в настоящем описании, выбирают так, чтобы они были "по существу" комплементарными различным цепям конкретной последовательности-мишени. Это означает, что зонды должны быть достаточно комплементарными для специфической гибридизации или отжига с их соответствующими последовательностями-мишенями в наборе заданных условий. Таким образом, последовательность зонда не должна отражать точную комплементарную последовательность мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может связываться с 5'- или 3'-концом зонда, а остальная последовательность зонда может являться комплементарной последовательности-мишени. Альтернативно некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть вставлены в зонд, при условии что последовательность зонда имеет достаточную комплементарность с последовательностью полинуклеотида-мишени, чтобы подвергаться специфическому отжигу с полинуклеотидом-мишенью. Пептидный или полипептидный зонд может представлять собой любую молекулу, с которой белок или пептид специфично связывается, включая ДНК (для связывающих ДНК белков), антитела, рецепторы клеточной мембраны, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны, органеллы и мембраны органелл.

[0050] Термины "образец" и "жидкий образец" означает любую ткань животного или жидкость, содержащую полинуклеотиды, включая клетки и другие ткани, содержащие ДНК и РНК. Примеры включают: кровь, почку, соединительную ткань, мышечную ткань, нервную ткань, мокроту и т.п. Образец может быть твердым или жидким и он может содержать ДНК, РНК, кДНК, например, жидкости организма, такие как кровь или моча, клетки, клеточные препараты или растворимые фракции или их аликвоты среды, хромосомы, органеллы и т.п.

[0051] Термин "специфически связывать" означает обособленное и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, в частности, от их молекулярных боковых групп, например, встраивание регуляторного белка в большую бороздку молекулы ДНК, образование водородных связей вдоль основной цепи между двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, или связывание между эпитопом белка и агонистом, антагонистом или антителом.

[0052] Термин "специфически гибризоваться" означает ассоциацию двух одноцепочечных полинуклеотидов с достаточно комплементарной последовательностью, чтобы позволить такую гибридизацию в заданных условиях, обычно используемых в данной области (иногда называемых "по существу комплементарными"). Например, термин может относиться к гибридизации полинуклеотидного зонда по существу с комплементарной последовательностью, содержащейся в одноцепочечной молекуле ДНК или РНК согласно одному аспекту изобретения, по существу исключая гибридизацию полинуклеотидного зонда с одноцепочечными полинуклеотидами с некомплементарной последовательностью.

[0053] Термин "жесткие условия" означает (1) гибридизацию в 50% (об./об.) формамиде с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 0,1% Ficoll, 0,1% поливинилпирролидоном, 50 мМ натрий-фосфатном буфере при pH 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитратом натрия при 42°C, (2) гибридизацию в 50% формамиде, 5x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрате натрия), 50 мМ фосфате натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфате натрия, 5x растворе Денхардта, обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфате декстран при 42°C; с промыванием при 42°C в 0,2x SSC и 0,1% SDS или промыванием 0,015 M NaCl, 0,0015 M цитратом натрия, 0,1% Na₂SO₄ при 50°C, или сходные известные в данной области методики с использованием сходной низкой ионной силы и средств для промывания при высокой температуре и сходных денатурирующих средств.

[0054] Термин "приемлемое варьирование" означает (1) для полинуклеотида: комплементарные последовательности полинуклеотида; гомологи полинуклеотида и комлементарные им последовательности; варианты полинуклеотида, комплементарные им последовательности и их гомологи; и фрагменты полинуклеотида, комплементарные им последовательности, их гомологи и их варианты, и (2) для полипептида: гомологи полипептида; варианты полипептида и их гомологи; и фрагменты полинуклеотида, их гомологи и их варианты.

[0055] Термин "вариант" означает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любую замену, варьирование, модификацию, замену, делецию или вставку одного или более нуклеотидов из полинуклеотидной последовательность или в полинуклеотидную последовательность, и которая имеет те же или по существу те же свойства и выполняет ту же или по существу ту же функцию, что и исходная последовательность и (2) полипептидную последовательность, содержащую любую замену, варьирование, модификацию, замену, делецию или вставку одной или более аминокислот из полипептидной последовательности или в полипептидную последовательность, и которая имеет те же или по существу те же свойства и выполняет ту же или по существу ту же функцию, что и исходная последовательность. Таким образом, термин включает однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и аллельные варианты и включает консервативные и неконсервативные аминокислотные замены в полипептидах. Также термин охватывает химическое преобразование в производное полинуклеотида или полипептида и замену нуклеотидов или аминокислот нуклеотидами или аминокислотами, которые не встречаются в природе, в соответствующих случаях.

[0056] Если нет иных указаний, все технические и научные термины и любые сокращения, используемые в настоящем описании, имеют те же значения, как обычно понимает специалист в области изобретения.

Зонды

[0057] Зонды, пригодные для осуществления изобретения на практике и которые используют для идентификации биомаркеров животных семейства кошачьих в образцах от указанного животного семейства кошачьих соответствуют представленным ниже идентификационным номерам зондов в запатентованном чипе с генами животных семейства кошачьих, изготавливаемом Affymetrix, обозначаемом как Affymetrix Feline GeneChip®, как более подробно описано в настоящем описании.

[0058] Другие и дополнительные объекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут понятны специалистам в данной области.

[0059] На протяжении настоящего описания различные аспекты этого изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в диапазоне формата представлено только для удобства и краткости, и его не следует истолковывать как жесткое ограничение объема изобретения. Таким образом, описание диапазона следует рассматривать как конкретное описание всех возможных поддиапазонов, а также всех отдельных числовых величин в этом диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 5, следует рассматривать как конкретно описанные поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 2 до 4, от 2 до 5, от 3 до 5 и т.д., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4 и 5. Это применимо, независимо от ширины диапазона.

[0060] На практике этого изобретения могут использоваться, если нет иных указаний, общепринятые способы и описания органической химии, технологии полимеров, молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие общепринятые способы включают синтез полимерных чипов, гибридизацию, лигирование и детекцию гибридизации с использованием метки. Конкретные иллюстрации подходящих способов могут быть приведены с помощью примеров в настоящем описании ниже. Однако также, безусловно, можно использовать другие эквивалентные общепринятые методики. Такие общепринятые технологии и описания могут быть найдены в стандартных лабораторных справочниках, таких как: Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cells: A Laboratory Manual; PCR Primer: A Laboratory Manual, и Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, New York; Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000); Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y; и Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y., все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме для всех целей.

[0061] Чипы с нуклеиновыми кислотами, которые пригодны в рамках настоящего изобретения, включают чипы, которые являются коммерчески доступными от Affymetrix (Santa Clara, Calif.) под торговым названием GeneChip®. Иллюстративные чипы представлены на web-сайте affymetrix.com.

[0062] Настоящее изобретение также предусматривает использование полимеров, присоединенных к твердым субстратам. Эти применения включают мониторинг экспрессии генов, определение профиля экспрессии генов, скрининг библиотек, генотипирование и диагностику. Способы мониторинга и определения профиля экспрессии генов могут быть представлены в патентах США № 5800992, 6013449, 6020135, 6033860, 6040138, 6177248, 6309822 и 6344316. Генотипирование и применения, таким образом, представлены в патентных заявках США с серийными номерами № 60/319253, 10/013598, и патентах США № 5856092, 6300063, 5858659, 6284460, 6361947, 6368799 и 6333179. Другие применения описаны в патентах США № 5871928, 5902723, 6045996, 5541061 и 6197506.

[0063] Специалистам в данной области будет понятно, что продукты и способы, осуществленные с помощью настоящего изобретения, можно применять к различным системам, включая коммерчески доступные системы мониторинга экспрессии генов, вовлекающие чипы с зондами на основе нуклеиновых кислот, мембранные блоты, микролунки, гранулы и пробирки для образцов, изготовленные из различных материалов с использованием различных способов, известных в данной области. Таким образом, настоящее изобретение не ограничивается какими-либо конкретными окружающими условиями, и представленное ниже описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения предоставлено только для иллюстративных целей.

[0064] В предпочтительном варианте осуществления система мониторинга экспрессии генов может включать чип с зондами на основе нуклеиновых кислот (включая чип с олигонуклеотидами, чип с кДНК, точечный чип и т.п.), мембранный блот (такой как используется в гибридизационном анализе, таком как нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, дот-блоттинг и т.п.), или микролунки, пробирки для образца, гранулы или волокна (или любую твердую подложку, содержащую связанные с ней нуклеиновые кислоты). См. патенты США № 5770722, 5744305, 5677195, 5445934 и 6040193, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. Система мониторинга экспрессии генов также может включать зонды на основе нуклеиновой кислоты в растворе.

[0065] Настоящее изобретение также охватывает получение образца, вовлекающее амплификацию. Геномный образец можно амплифицировать с помощью различных механизмов, в некоторых из которых используется ПЦР. См., например, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Eds. Innis, et al, Academic Press, San Diego, Calif, 1990); Mattila et al, Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et al, PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR (Eds. McPherson et al, IRL Press, Oxford); и патенты США № 4683202, 4683195, 4800159 4965188, и 5333675, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. Образец можно амплифицировать на чипе. См., например, патент США № 6300070 и патентную заявку США с серийным номером № 09/513300, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.

[0066] Другие подходящие способы амплификации включают лигазную цепную реакцию (LCR) (например, Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren et al, Science 241, 1077 (1988) и Barringer et al. Gene 89:117 (1990)), транскрипционную амплификацию (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989) и WO88/10315), самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Guatelli et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990) и WO90/06995), селективную амплификацию последовательностей полинуклеотидов-мишеней (патент США № 6410276), полимеразную цепную реакцию с затравкой консенсусной последовательностью (CP-ПЦР) (патент США № 4437975), полимеразную цепную реакцию с произвольной затравкой (AP-ПЦР) (патенты США № 5413909, 5861245) и амплификацию последовательности на основе нуклеиновой кислоты (NABSA). (См., патенты США № 5409818, 5554517 и 6063603, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки). Другие способы амплификации, которые можно использовать, описаны в патентах США № 5242794, 5494810, 4988617, 6344316 и в патентной заявке США с серийным номером № 09/854317, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.

[0067] Дополнительные способы получения образца и технологии описаны в Dong et al, Genome Research 11, 1418 (2001), в патентах США № 6361947, 6391592 и патентных заявках США с серийными номерами 09/916135, 09/920491, 09/910292 и 10/013598.

[0068] Систему мониторинга экспрессии генов в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для облегчения сравнительного анализа экспрессии в различных клетках или тканях, различных субпопуляциях одних и тех же клеток или тканей, в различных физиологических состояниях одних и тех же клеток или тканей, различных стадиях развития одних и тех же клеток или тканей, или различных популяциях клеток одной и той же ткани. В предпочтительном варианте осуществления способы пропорциональной амплификации по настоящему изобретению могут обеспечивать воспроизводимые результаты (т.е. в пределах статистически значимых пределов ошибки или степени достоверности), достаточные для облегчения измерения количественных, а также качественных отличий в исследованных образцах.

[0069] Анализы гибридизации полинуклеотидов хорошо известны в данной области. Методики и условия анализа гибридизации варьируют, в зависимости от применения, и их выбирают в соответствии с общими известными способами связывания, включая способы, описанные в: Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y, 1989); Berger and Kimmel Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif, 1987); Young and Davis, P.N.A.S, 80: 1194 (1983). Способы и устройство для осуществления повторяющихся и контролируемых реакций гибридизации описаны в патентах США № 5871928, 5874219, 6045996, 6386749 и 6391623, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки. В определенных предпочтительных вариантах осуществления осуществляют выявление сигнала гибридизации между лигандами. См. патенты США № 5143854, 5578832, 5631734, 5834758, 5936324, 5981956, 6025601, 6141096, 6185030, 6201639, 6218803 и 6225625, патентную заявку США 60/364731 и заявку PCT PCT/US99/06097 (опубликованную как WO99/47964), каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для любых целей. Способы и устройство для выявления сигнала и обработки данных об интенсивности описаны, например, в патентах США № 5143854, 5547839, 5578832, 5631734, 5800992, 5834758; 5856092, 5902723, 5936324, 5981956, 6025601, 6090555, 6141096, 6185030, 6201639; 6218803 и 6225625, в патентной заявке США 60/364731 и в заявке PCT PCT/US99/06097 (опубликованной в качестве W099/47964), каждый из которых также включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для любых целей.

[0070] Изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем описании, поскольку они могут варьировать. Кроме того, терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения.

[0071] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к одному или более генам или сегментам генов ("гены", как определено в настоящем описании), которые дифференциально экспрессируются у животных с нарушением по сравнению с нормальными животными. Изобретение основано на открытии полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются у животных с нарушением по сравнению с нормальными животными. Эти гены идентифицированы путем сравнения экспрессии генов в образцах ткани, взятых от животных, диагностированных как имеющие нарушение, с генами в образцах тканей от животных, диагностированных как нормальные, с использованием технологии Affymetrix GeneChip®.

[0072] Полинуклеотиды и гены идентифицируют путем измерения отличий в экспрессии генов образцах тканей, взятых от животных семейства кошачьих, диагностированных как не являющиеся нормальными и имеющих нарушение щитовидной железы, с экспрессией генов в образцах тканей от животных семейства кошачьих, диагностированных как нормальные. Изменение экспрессии гена можно определять любым способом, известным квалифицированным специалистам. Как правило, изменение экспрессии генов определяют путем измерения транскрипции (определения количества мРНК, продуцируемой геном) или измерения трансляции (определения количества белка, продуцируемого геном). Количество РНК или белка, продуцируемых геном, можно определять с использованием любого известного квалифицированным специалистам способа количественного определения полинуклеотидов и белков.

[0073] Как правило, экспрессию мРНК определяют с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) (включая, но не ограничиваясь ими, ПЦР с обратной транскрипцией (RT-ПЦР) и количественную ПЦР в реальном времени (q-ПЦР)), чипы с короткими или длинными олигонуклеотидами, кДНК-чипы, секвенирование EST, нозерн-блоттинг, SAGE, MPSS, MS, чипы с гранулами и другие способы гибридизации. Измеренная РНК, как правило, имеет форму мРНК или обратно транскрибированной мРНК.

[0074] Экспрессию белка или полипептида определяют с использованием различных колориметрических и спектроскопических анализов и способов, таких как количественный вестерн-блоттинг, ELISA, 2D-гели, газовая или жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, анализ Лоури, биуретовый анализ, флуоресцентные анализы, турбодиметрические способы, анализ с бицинхолиновой кислотой, технология белковых чипов, поглощение инфракрасного излучения, способ с нингидрином, анализ Брэдфорд и поглощение ультрафиолетовых лучей.

[0075] Генные чипы позволяют крупномасштабное исследование биологических процессов и измерение активности в клетке в определенный момент времени. Анализ микрочипов позволяет учитывать различия в фенотипах на крупномасштабной генетической основе. Фактическое изменение продуктов экспрессии генов является более точным индикатором функции гена, чем определение самих последовательностей. Анализ микрочипов основан на количественном определении концентрации мРНК-транскрипта гена в клетке в данный момент времени. ДНК иммобилизуют на носителе и меченую мРНК-мишень гибридизуют с зондами на чипе. Связывание меченой мРНК с зондами измеряют с помощью лазерного анализа. Показателем является количество испускаемых фотонов. Весь чип сканируют и получают его цифровое изображение. Изображение обрабатывают для определения положения зондов и для присвоения показателей интенсивности каждому зонду. Таким путем можно определять активированные и ингибированные гены. Этот анализ позволяет квалифицированному специалисту найти группы генов со сходными профилями экспрессии и определить ткани со сходными профилями экспрессии. Таким образом, можно идентифицировать гены, которые объясняют наблюдаемые отличия в образцах тканей.

[0076] Для генных чипов Affymetrix, как правило, используются зонды размером 25 п.о. и наборы зондов из от 11 до 20 зондов, соответствующих конкретному гену или EST. Чип конструируют с зондом с абсолютным соответствием и с зондом с несоответствием по 25 п.о. каждый, причем первый из них является полностью комплементарным конкретной области гена, а второй имеет замененную 13-ую п.о. для внесения несоответствия. Алгоритм суммирования зондов используют для определения коррекции по фону, нормализации и суммирования зондов, которое представляет собой преобразование величин для зондов в величины экспрессии по набору зондов. RMA представляет собой один из алгоритмов, которые можно использовать для этой цели. Алгоритм выполняет последние две стадии анализа - нормализацию и суммирование показателей интенсивности на уровне зондов. Таким образом, величины абсолютного соответствия являются скорректированными по фону, нормализованными и суммированными в набор показателей экспрессии.

[0077] Необработанные данные анализируют с использованием программного обеспечения GeneSpring версии 7.0 (GS) (Agilent Corporation) и проверяют с использованием свободно распространяемого программного обеспечения R-Bioconductor (RB). Оба пакета программ используют для вычисления интенсивности зондов из файлов CEL, создаваемых Affymetrix Instrument. Сигналы присутствия/отсутствия/предела на зонд и величины P вычисляют с использованием программного обеспечения R-Bioconductor и GeneSpring по отдельности.

[0078] Как правило, дифференциальную экспрессию генов у животных с нарушением по сравнению с нормальными животными определяют путем измерения экспрессии по меньшей мере одного гена. Предпочтительно, для получения характера экспрессии генов или профиля экспрессии генов измеряют экспрессию двух или более дифференциально экспрессируемых генов. Более предпочтительно, измеряют экспрессию множества дифференциально экспрессируемых генов для получения дополнительной информации для более показательного характера или профиля экспрессии генов.

[0079] Настоящее изобретение относится множеству маркеров, которые вместе или по отдельности используют или можно использовать в качестве маркеров заболевания почек. В особенно пригодных вариантах осуществления изобретения можно выбирать множество из этих маркеров и их экспрессию мРНК можно одновременно измерять для получения профилей экспрессии для применения в различных аспектах изобретения, описанных в настоящей заявке.

[0080] В другом аспекте изобретение относится к устройству, пригодному для выявления экспрессии множества генов, дифференциально экспрессируемых у животных семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальными животными семейства кошачьих. Устройство содержит подложку, имеющую множество олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов по настоящему изобретению, связанных с подложкой в известных положениях. Устройство по существу представляет собой иммобилизованную версию олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов, описанных в настоящем описании. Устройство пригодно для быстрого и специфического выявления генов и полинуклеотидов и их паттернов и профилей экспрессии. Как правило, такие зонды связывают с субстратом или сходной твердой подложкой и образец, содержащий один или более полинуклеотидов (например, ген, продукт ПЦР, продукт лигазной цепной реакции (LCR), последовательность ДНК, синтезированная с использованием способов амплификации, или их смесь) подвергают воздействию зондов, так чтобы полинуклеотид(ы) образца могли гибридизоваться с зондами. Зонды, полинуклеотид(ы) образца, или и зонды и полинуклеотид(ы) образца, можно метить, как правило, флуорофором или другой меткой, такой как стрептавидин, и выявлять с использованием способов, известных квалифицированным специалистам. Если полинуклеотид(ы) образца является меченным, гибридизацию можно выявлять путем выявления флуоресценции при связывании. Если зонды являются мечеными, гибридизацию, как правило, выявляют по тушению метки. Если и зонд, и полинуклеотид(ы) образца являются мечеными, гибридизацию, как правило, выявляют путем мониторинга изменения цвета в результате сближения двух связанных меток. Специалистам в данной области известны различные стратегии мечения и метки, в частности, для флуоресцентных меток. Предпочтительно, зонды иммобилизуют на подложках, пригодных для формирования чипа (известного под различными названиями, включая ДНК-микрочип, генный чип, биочип, ДНК-чип и генная матрица), сравнимого с чипами, известными в данной области.

[0081] Способы определения количества или концентрации белка в образце известны квалифицированным специалистам. Такие способы включают радиоиммунные анализы, конкурентные анализы связывания, вестерн-блоттинг и анализы ELISA. Для способов, в которых используют антитела, пригодны поликлональные и моноклональные антитела. Такие антитела могут быть иммунологически специфичными к белку, эпитопу белка или белковому фрагменту.

[0082] В некоторых вариантах осуществления изобретения используются антитела для выявления и количественного определения белков, продуцируемых экспрессией полинуклеотидов по настоящему изобретению. Хотя выявление белков можно осуществлять путем иммунопреципитации, аффинного разделения, вестерн-блоттинга, белковых чипов и т.п., в предпочтительном способе используется технология ELISA, где антитело иммобилизуют на твердой подложке и белок-мишень или пептид-мишень подвергают воздействию иммобилизованного антитела. Либо зонд, либо мишень, или и зонд и мишень, можно метить с использованием известных способов.

[0083] В следующем аспекте изобретение относится к способу выявления дифференциальной экспрессии одного или более генов, дифференциально экспрессирующихся у животных семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальными животными семейства кошачьих в образце. Способ включает (a) гибридизацию комбинации, содержащей множество полинуклеотидных зондов, которые дифференциально экспрессируются у кошек с нарушением по сравнению с нормальными кошками, с полинуклеотидами в образце с образованием одного или более гибридизационных комплексов; (b) необязательно, гибридизацию комбинации, содержащей множество полинуклеотидных зондов, которые дифференциально экспрессируются у животных семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальными животными семейства кошачьих, с полинуклеотидами в стандарте с образованием одного или более гибридизационных комплексов; (c) выявление гибридизационных комплексов из образца и, необязательно, стандарта со стадии (b); и (d) сравнение гибридизационных комплексов из образца с гибридизационными комплексами из стандарта, где отличие в количестве гибридизационных комплексов между стандартом и образцом указывает на дифференциальную экспрессию генов, дифференциально экспрессирующихся у животных с нарушением по сравнению с нормальными животными, в образце.

[0084] Стадия (b) и часть стадии (c) являются необязательными и их используют, если необходимо провести относительно одновременное сравнение двух или более тест-систем. Однако в предпочтительном варианте осуществления стандарт, используемый для сравнения, основан на данных, ранее полученных с использованием способа.

[0085] Эти зонды подвергают взаимодействию с образцом для образования комплексов гибридизации, которые выявляют и сравнивают со стандартными комплексами гибридизации. Отличия между комплексами гибридизации из образца и стандартом указывают на дифференциальную экспрессию полинуклеотидов и, таким образом, на гены, дифференциально экспрессируемые у животных семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальными животными семейства кошачьих, в образце. В предпочтительном варианте осуществления зонды изготавливают для специфического выявления полинуклеотидов или их фрагментов, продуцируемых одним или более генами или фрагментами генов, идентифицированных согласно настоящему изобретению. Способы выявления комплексов гибридизации известны квалифицированным специалистам.

[0086] В другом аспекте изобретение относится к способу выявления дифференциальной экспрессии генов, дифференциально экспрессируемых у животных семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальными животными семейства кошачьих, в образце. Способ включает (a) реакцию комбинации, содержащей множество полипептидных зондов, с белками в образце в условиях, которые позволяют специфическое связывание между зондами и белками, где белки, связанные зондами, дифференциально экспрессируются у животного семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальным животным семейства кошачьих; (b) необязательно, реакцию комбинации, содержащей множество полипептидных зондов, с белками в стандарте в условиях, которые позволяют специфическое связывание между зондами и белками, где белки, связанные зондами, дифференциально экспрессируются у животного семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальным животным семейства кошачьих; (c) выявление специфического связывания в образце и, необязательно, стандарте стадии (b); и (d) сравнение специфического связывания в образце со связыванием стандарта, где отличия между специфическим связыванием в стандарте и образце указывают на дифференциальную экспрессию генов, у животных семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальными животными семейства кошачьих, в образце.

[0087] Эти зонды подвергают взаимодействию с образцом с получением специфического связывания, которое выявляют и сравнивают со специфическим связыванием стандарта. Отличия между специфическим связыванием образца и стандарта указывают на дифференциальную экспрессию белков и, таким образом, генов, дифференциально экспрессируемых у животных семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальными животными семейства кошачьих, в частности, генов, ассоциированных с ненормальным состоянием, в образце. В предпочтительном варианте осуществления зонды изготавливают для специфической детекции белков или их фрагментов, продуцируемых одним или более генами или фрагментами генов, идентифицированных согласно настоящему изобретению.

[0088] В одном варианте осуществления способ дополнительно включает воздействие на животное семейства кошачьих или образец исследуемого вещества перед реакцией полипептидов с белками. Затем сравнение указывает на то, изменяет ли исследуемое вещество экспрессию генов, дифференциально экспрессируемых у животных семейства кошачьих с нарушением по сравнению с нормальными животными семейства кошачьих, в частности, генов, ассоциированных с ненормальным состоянием, в образце.

[0089] Как используют в настоящем описании, диапазоны используют в качестве сокращения для описания каждой величины, которая находится в пределах этого диапазона. Любая величина в диапазоне может быть выбрана как конечная величина диапазона. Кроме того, все ссылки, цитированные в настоящем описании, включены в качестве ссылок в полном объеме. В случае противоречий между определениями настоящего описания и определениями цитированной ссылки, следует руководствоваться настоящим описанием.

Пример 1 - Экспрессия генов у животных семейства кошачьих с гипертиреозом

[0090] Это исследование сфокусировано на экспрессии генов в ткани щитовидной железы и цельной крови у животных семейства кошачьих с гипертиреозом. У всех животные семейства кошачьих с гипертиреозом диагноз поставлен ветеринарами, исходя из клинических признаков и повышенных концентраций T4. В исследовании ткани выявлено 1308 генов со значимой дифференциальной экспрессией между животными семейства кошачьих с гипертиреозом и животными семейства кошачьих без гипертиреоза с FDR=0,1 и кратностью изменения >=+/-1,25. В исследовании цельной крови выявлено 1094 имеющих значение генов между животными семейства кошачьих с гипертиреозом и животными семейства кошачьих без гипертиреоза с тем же пороговым уровнем, как показано выше. В исследовании ткани выявлено, что все гены, известные тем, что они вовлечены в каскад, ведущий к продукции гормонов щитовидной железы, активированы у животных семейства кошачьих с гипертиреозом. Увеличенная экспрессия этих генов явно вносит вклад в высокую продукцию T4 в организме животного семейства кошачьих. В исследовании цельной крови выявлены 60 генов, перекрывающихся с генами, выявленными в работе с солидной тканью, которые, по-видимому, регулируются в том же направлении, как и в исследовании тканей. С использованием этих 60 генов животных семейства кошачьих с гипертиреозом можно отличить от нормальных животных семейства кошачьих при исследовании в цельной крови, а также в ткани.

[0091] Животных семейства кошачьих подразделяют на две группы. Одна группа включает животных семейства кошачьих без признаков заболевания, а другая группа включает животных семейства кошачьих с гипертиреозом. Как ткани, так и цельную кровь, собирают для анализа экспрессии генов.

[0092] Выделение РНК из солидной ткани:

[0093] Образцы тканей гомогенизируют с использованием гомогенизатора Ultra-Turrax T25 Power Homogenizer. РНК выделяют с использованием протокола, описанного в SOP# LAB-LS-028.3. Качество и количество РНК определяют с использованием Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) в соответствии с инструкциями изготовителя. Целостность РНК определяют с использованием величины целостности РНК (RIN; Agilent 2100 RIN Beta Version Software). Очищенные образцы РНК хранят при -70°C.

[0094] Получение образца из цельной крови:

[0095] Кровь собирают и обрабатывают в соответствии с инструкциями изготовителя в пробирках для крови PAXgene RNA. Пробирки для крови PAXgene RNA хранят при -20°C (кратковременное хранение, <6 месяцев) и -70°C (>6 месяцев) перед выделением РНК.

[0096] Выделение РНК из цельной крови:

[0097] РНК выделяют с помощью набора для выделения РНК PAXgene Blood RNA Isolation Kit в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen, p/n 762164). Качество и количество РНК определяют с использованием Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) в соответствии с инструкциями изготовителя. Целостность РНК определяют с использованием величины целостности РНК (RIN; Agilent 2100 RIN Beta Version Software). Очищенные образцы РНК хранят при -70°C.

[0098] Приготовление зонда для цельной крови:

[0099] Реагенты для мечения и амплификации получают от NuGEN Technologies, Inc (San Carlos, CA, США) и биотинилированные кДНК-мишени получают в соответствии с инструкциями изготовителя. Двухцепочечную кДНК синтезируют из приблизительно 75 нг тотальной РНК с последующей стадией линейной изотермической амплификации (SPIA Amplification^TM) с получением одноцепочечной кДНК. За фрагментацией следует процесс прямого мечения, который связывает биотин с амплифицированным зондом. Очистку зондов проводят с использованием DNA Clean and Concentrator-25 (Zymo Research, Orange, CA, США).

[00100] Приготовление зонда для солидной ткани:

[00101] Реагенты для мечения и амплификации получают от Affymetrix (3420 Central Expressway, Santa Clara, CA 95051). Для синтеза, фрагментации и мечения каждой кДНК-мишени используют набор One-cycle cDNA Synthesis Kit (p/n 900431) и набор 3'IVT Labeling Kit (p/n 900449). Все кДНК-мишени получают в соответствии с инструкциями изготовителя. Очистку зондов проводят с использованием GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix p/n 900371). Важно отметить, что Affymetrix более не продает эти конкретные продукты сами по себе, поскольку они преобразовали и переименовали их линию продуктов для мечения и амплификации, однако все еще доступны эквивалентные продукты.

[00102] Гибридизация на чипе и обработка (цельная кровь):

[00103] После предгибридизации в течение 20 минут при 45°C 1,5 мкг каждой кДНК-мишени смешивают с контролями гибридизации Affymetrix в буфере для гибридизации и гибридизуют с Feline-2 GeneChip® в течение 16 часов при 45°C. После гибридизации смеси удаляют, чипы промывают в жидкостной системе с буфером низкой жесткости (6X стандартный фосфатно-солевой буфер с EDTA, 0,01% Tween 20) и буфером высокой жесткости (100 мМ N-морфолино-этансульфоновая кислота (MES), 0,1 M NaCl, и 0,01% Tween 20) и окрашивают SAPE (стрептавидин-фикоэритрин). После этого процесса проводят инкубацию с нормальным IgG козы и биотинилированным антителом мыши против стрептавидина (Вектор Lab, BA-0500), а затем проводят повторное окрашивание с помощью SAPE. Чипы сканируют в сканере GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix Inc, Santa Clara, CA) для выявления сигналов гибридизации. Исследование изображения проводят вручную сразу после каждого сканирования (GeneChip® Expression Analysis Technical Manual. P/N 702232 Rev. 3, Chapter II and III).

[00104] Гибридизация на чипе и обработка (солидные ткани):

[00105] После предгибридизации в течение 10 минут при 45°C, 4,4 мкг каждой кДНК-мишени смешивают с контролями гибридизации Affymetrix в буфере для гибридизации и гибридизуют с Feline-2 GeneChip® в течение 16-18 часов при 45°C. После гибридизации смеси удаляют, чипы промывают в жидкостной системе с буфером низкой жесткости (6X стандартный фосфатно-солевой буфер с EDTA, 0,01% Tween 20) и буфером высокой жесткости (100 мМ N-морфолино-этансульфоновая кислота (MES), 0,1 M NaCl, и 0,01% Tween 20) и окрашивают SAPE (стрептавидин-фикоэритрин). После этого процесса проводят инкубацию с нормальным IgG козы и биотинилированным антителом мыши против стрептавидина (Вектор Lab, BA-0500), а затем проводят повторное окрашивание с помощью SAPE. Чипы сканируют в сканере GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix Inc, Santa Clara, CA) для выявления сигналов гибридизации. Исследование изображения проводят вручную сразу после каждого сканирования (GeneChip® Expression Analysis Technical Manual. P/N 702232 Rev. 3, Chapter II and III).

[00106] Анализ данных:

[00107] Для анализа данных используют Partek® GS (Partek Inc., St. Charles, MO) для программного обеспечения Gene Expression Data software (Partek Incorporated, 12747 Olive Blvd., Suite 205, St. Louis, Missouri 63141, U.S.A. http://www.partek.com/partekgs_geneexpression). Для поправки на фон, нормализации и суммирования уровней зондов образцов GeneChip® используют алгоритм Robust Multichip Average (RMA) (Rafael. A. Irizarry, Benjamin M. Bolstad, Francois Collin, Leslie M. Cope, Bridget Hobbs and Terence P. Speed (2003), Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data Nucleic Acids Research 31(4):el5). Для поиска значимых дифференциально экспрессируемых генов между двумя группами с минимальным контролем FDR при 0,1 и кратностью изменения 1,25 в каждом направлении проводят анализ ANOVA. Эмпирические исследования авторов настоящего изобретения показали, что Feline-2 GeneChips® имеет ассоциированный с ним уровень фонового уровня, составляющий 1,3 раза. Таким образом, во всех анализах, представленных в этом отчете, используется пороговое значение +/-1,25 раза (чтобы оно было более включительным). Более того, в качестве минимального уровня приемлемой статистической значимости выбран порог уровня ложноположительных результатов, равный 0,1 (что означает, что 10% наблюдений являются случайными).

[00108] Это исследование сфокусировано на экспрессии генов в ткани щитовидной железы и цельной крови в отношении гипертиреоза у животных у семейства кошачьих. В исследовании ткани выявлено, что 1308 генов значимо дифференциально экспрессируются между животными семейства кошачьих с гипертиреозом и животными семейства кошачьих без гипертиреоза с FDR=0,1 и кратностью изменения >=+/-1,25. В исследовании цельной крови идентифицировано 1094 значимых генов с использованием тех же пороговых значений.

[00109] Анализ PCA в обоих исследованиях демонстрирует, что, исходя из дифференциальной экспрессии генов, животные семейства кошачьих с гипертиреозом выделяются в отдельную группу и отличаются от животных семейства кошачьих без гипертиреоза.

[00110] Гипертиреоз у животных семейства кошачьих представляет собой эндокринное нарушение, которое вовлекает продукцию чрезмерного количества гормона щитовидной железы щитовидной железой. Это состояние имеет тенденцию к поражению животных семейства кошачьих среднего возраста и пожилых животных семейства кошачьих, и как самцы, так и самки имеют равный риск развития этого нарушения. Гипертиреоз поражает каждый орган и клетку в организме животного семейства кошачьих (1).

[00111] Уровень гормона щитовидной железы тироксина (T4) измеряют в крови. Высокие уровни этого гормона являются высоко показательными для гипертиреоза. У большинства кошек, страдающих этим эндокринным нарушением, уровни T4 являются настолько высокими, что нет сомнений, что гипертиреоз является проблемой. Однако в некоторых случаях уровни гомона у животных семейства кошачьих находятся на верхней границе уровней нормального диапазона. В таких случаях проводят дополнительный тест, известный как свободный T4 (FT4). В большинстве случаев этот второй тест щитовидной железы является достаточным для подтверждения диагноза гипертиреоза.

[00112] Также тесты крови выявляют повышенные уровни эритроцитов и лейкоцитов, а также низкие уровни лимфоцитов и эозинофилов. Также некоторые животные семейства кошачьих с гипертиреозом имеют повышенные уровни ALT. Также могут присутствовать другие вещества на повышенных уровнях, такие как другие ферменты, химические соединения креатинин, фосфор и желчный пигмент билирубин. Некоторые из этих уровней, превышающих нормальные уровни, запускаются физиологическими осложнениями гипертиреоза.

[00113] Щитовидная железа животного семейства кошачьих представляет собой железу в форме бабочки, расположенную в его шее. Эта железа ответственна за продукцию гормона тироксина (T4), который играет существенную роль в регуляции скорости метаболизма в организме. Все органы и физиологические системы поражаются при гипертиреозе, вызывая классические симптомы, такие как снижение массы тела, гиперактивность, повышенное кровяное давление и повышенная частота сердечных сокращений.

[00114] В исследовании тканей выявлено, что все гены, вовлеченные в каскад, ведущий к продукции гормонов щитовидной железы, активированы у животных семейства кошачьих с гипертиреозом. Эти гены представляют собой гены, представленные в таблице A. Увеличенная экспрессия этих генов приводит к высокой продукции T4 в организме животного семейства кошачьих.

[00115] Описание активируемых генов, которые вносят вклад в избыточную продукцию гормона щитовидной железы:

[00116] IYD (увеличение в 4,55 раз): Этот ген кодирует фермент, который катализирует окислительное NADPH-зависимое дейодирование моно- и дийодтирозина, которые являются галогенированными побочными продуктами продукции гормонов щитовидной железы. N-конец белка выполняет функцию мембранного якоря. Мутации в этом гене вызывают врожденный гипотиреоз вследствие дисгормоногенеза 4 типа, который также называют дефицитом дейодиназы или дефицитом йодтирозиндегалогеназы, или гормоногенезом щитовидной железы 4 типа.

[00117] TG (увеличение в 2,02 раза): Тиреоглобулин (Tg) представляет собой гомодимер гликопротеина, продуцируемый, главным образом, щитовидной железой. Он действует в качестве субстрата для синтеза тироксина и трийодтиронина, а также хранения неактивных форм гормона щитовидной железы и йода. Тиреоглобулин секретируется из эндоплазматической сети в его область йодирования и последующего биосинтеза тироксина в просвете фолликул. Мутации этого гена вызывают дисгормоногенез щитовидной железы, проявляющийся зобом, и они ассоциированы с врожденным гипотиреозом от умеренного до тяжелого.

[00118] SLC5A5, NIS (увеличение в 4,6 раз): Этот ген кодирует представителя семейства котранспортеров натрия-глюкозы. Кодируемый им белок отвечает за захват йода в ткани, такие как ткань щитовидной железы и лактирующая ткань молочной железы. Йод, захватываемы щитовидной железой, включается в метаболические легуляторы трийодтиронин (T3) и тетрайодтиронин (T4). Мутации в этом гене ассоциированы с дисгормоногенезом щитовидной железы 1.

[00119] TPO (увеличение в 4,06 раз): Этот ген кодирует связанный с мембраной гликопротеин. Кодируемый белок действует в качестве фермента и играет центральную роль в функции щитовидной железы. Белок участвует в йодировании остатков тирозина в тиреоглобулина и образовании фенокси-сложного эфира между парами йодированных остатков тирозина для формирования гормонов щитовидной железы, тироксина и трийодтиронина. Мутации в этом гене ассоциированы с тяжелыми нарушениями гормоногенеза щитовидной железы, включая врожденный гипотиреоз, врожденный зоб и дефект органификации гормона щитовидной железы IIA.

[00120] TSHR (увеличение в 2,2 раза): Белок, кодируемый этим геном, представляет собой мембранный белок и он является основным регулятором метаболизма клеток щитовидной железы. Кодируемый белок представляет собой рецептор для тиреотропин и тиреостимулина, и его активность опосредуется аденилатциклазой. Дефекты в этом гене являются причиной тяжелых типов гипертиреоза.

[00121] DUOX2, ThOX (увеличение в 1,55 раза): Белок, кодируемый этим геном, представляет собой гликопротеин, и он является представителем семейства NADPH-оксидазы. Синтез гормона щитовидной железы катализируется белковым комплексом, расположенным на апикальной мембране клеток фолликулов щитовидной железы. Этот комплекс содержит переносчик йодидов, тиреопероксидазу, и генерирующую пероксид систему, которая включает этот кодируемый белок и DUOX1. Этот белок известен в качестве двойной оксидазы, поскольку он имеет как домен гомологии пероксидазы, так и домен gp91phox.

[00122] В исследовании тканей у животных семейства кошачьих с гипертиреозом активированы несколько генов, вовлеченных в каскад продукции арахидоновой кислоты. Большинство из этих генов представляют собой вышерасположенные гены относительно синтеза арахидоновой кислоты, таким образом, продукция арахидоновой кислоты может увеличиваться. Действительно, в исследованиях у человека было выявлено, что уровни арахидоновой кислоты являются значительно более высокими в группе людей с гипертиреозом, чем либо в нормальной группе, либо в группе людей с гипотиреозом. Арахидоновая кислота представляет собой полиненасыщенную жирную кислоту, которая присутствует в фосфолипидах (особенно фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин и фосфатидилинозитиды) мембран клеток организме, и широко распространена в головном мозге, мышцах, печени. В дополнение к вовлечению в клеточную передачу сигнала в качестве липидного вторичного посредника, вовлеченного в регуляцию передачи сигналов ферментов, таких как изоформы PLC-γ, PLC-β и PKC-α, -β и -γ, арахидоновая кислота является ключевым промежуточном соединением воспаления. Арахидоновая кислота играет центральную роль в воспалении, связанном с травмой и многими заболеваниями. То, как она метаболизируется в организме, определяет ее воспалительную или противовоспалительную активность. Индивидуумы, страдающие от болей в суставах или активного воспалительного заболевания, могут обнаружить, что увеличенное употребление арахидоновой кислоты обостряет симптомы, возможно потому, что она легче конвертируется в воспалительные соединения. Аналогично, высокое употребление арахидоновой кислоты не советуют для индивидуумов с воспалительным заболеванием в анамнезе или с нарушением состояния здоровья. Также следует отметить, что, хотя дополнение ARA, по-видимому, не обладает провоспалительными эффектами у здоровых индивидуумов, она может противостоять противовоспалительным эффектам дополнения посредством омега-3 EFA. Таким образом, у животных семейства кошачьих с гипертиреозом рацион должен быть преобразован так, чтобы избегать арахидоновой кислоты.

[00123]

[00124] В исследовании экспрессии генов в цельной крови выявлено 60 генов, которые перекрываются с генами, выявленном в анализе тканей, и они проявляют то же направление регуляции. Однако выявлено, что ни один из этих генов не ассоциирован с продукцией гормона щитовидной железы, как видно в исследовании тканей. С использованием этих 60 генов животных семейства кошачьих с гипертиреозом можно отличить от нормальных животных семейства кошачьих путем исследования в крови, и в то же время в ткани. Эти 60 генов представляют собой гены, представленные в таблице B.

Реферат

Изобретение относится к биохимии, в частности к способу диагностики существования или наличия высокого риска гипертиреоза у животного семейства кошачьих и набору для его осуществления. Для осуществления способа измеряют уровень экспрессии одного или более биомаркеров в биологическом образце от указанного животного с помощью средства для измерения экспрессии, такого как антитело, аптамер или олигонуклеотидный зонд. Повышенная экспрессия IYD, CHI3L1, PDZK1IP1, MAPK13, PGD, МВОАТ7, CTSD, CYP4F3, TGFB1, C20orf3, АСАА2, HTATIP2, RHOC, G6PD, GSTP1, CAPG, AP1S1, ATP6V1D, CAPN1, LASS4, PDCL, HSD3B7, LRPAP1, PARP3, ATP6AP1, B3GNT8, SORT1, TG, SLC5A5 (NIS), TPO, TSHR и DUOX2 (ThOX) и/или пониженная экспрессия C13orf27, GP1BB, IGLL1, LRRC4B, MALT1, REV3L, GNL3, RNPC3, LMO4, RFXAP, MPP6, DTWD1, MYC, TCEA3, RPAP2, ZNF292, CSGALNACT1, ZFP37, IGJ, LTBP1, ABCA5, GPRASP2, ARMCX1, SEPP1, DCN в образце относительно контрольной величины экспрессии и/или относительно предшествующей индивидуальной исходной величины для этого животного указывает на существование или высокий риск гипертиреоза. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для диагностики гипертиреоза у кошек. 5 н. и 14 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

Формула