Гидролизат коллагена, применяемый для улучшения здоровья кожи, волос и/или ногтей человека - RU2577699C2

Чертежи

Показать все 11 чертежа(ей)

Описание

Изобретение относится к гидролизату коллагена, применяемому для улучшения здоровья кожи, волос и/или ногтей человека.

С некоторого времени известно, что благодаря пероральному приему гидролизата коллагена можно добиться благоприятного действия на здоровье кожи, а также волос и/или ногтей у человека (например, Vivian Zague: "A new view concerning the effects of collagen hydrolysate intake on skin properties" in Arch. Dermatol. Res. 2008 (9) 479-483). Под улучшением здоровья кожи в данном контексте понимается любое положительное влияние на природные особенности и функции кожи, причем эти свойства и функции могут повреждаться как в результате старения, так и дополнительно вследствие различных негативных влияний окружающей среды. Также прием гидролизата коллагена оказывает благоприятное воздействие на свойства волос и/или ногтей.

В основе изобретения лежит задача еще больше повысить положительные действия гидролизата коллагена на здоровье кожи, волос и/или ногтей и предоставить особенно эффективный гидролизат коллагена для такого применения.

Эта задача решается при помощи гидролизата коллагена указанного в начале вида в соответствии с изобретением тем, что по меньшей мере 90 мас.% гидролизата коллагена имеют молекулярный вес менее чем 3500 Да и что гидролизат коллагена содержит по меньшей мере четыре типичных пептида с молекулярным весом между 600 и 1200 Да.

Гидролизаты коллагена содержат пептиды с различной длиной цепи соответственно молекулярным весом, которые образуются при расщеплении белковых цепей коллагена, причем в зависимости от условий получения гидролизата могут существенно различаться молекулярно-весовые распределения этих пептидов. Теперь оказалось, что гидролизат коллагена с указанными выше свойствами с разных точек зрения оказывает особенно благоприятное влияние на здоровье кожи, т.е. показывает лучшие результаты, чем используемые до сих пор гидролизаты коллагена, которые содержат существенно более низкую долю низкомолекулярных пептидов и/или которые не содержат типичных пептидов.

Молекулярно-весовое распределение гидролизата коллагена, которое лежит основе предельного значения по меньшей мере в 90 мас.% ниже 3500 Да, можно определить очень точно и воспроизводимым образом, например, с помощью гель-проникающей хроматографии с применением калибровочного стандарта из определенных коллагеновых фрагментов.

Предпочтительно по меньшей мере 45 мас.% гидролизата коллагена имеют молекулярный вес менее чем 1500 Да, т.е. определенная доля пептидов гидролизата коллагена является особенно короткоцепочечной. Оказалось, что благодаря таким, особенно низкомолекулярным долям, которые в применяемых в настоящее время гидролизатах коллагена содержатся только в гораздо меньшем количестве, можно достичь очень выраженных эффектов на здоровье кожи.

Средний молекулярный вес (средний вес M_W) применяемого в соответствии с изобретением гидролизата коллагена обычно находится в пределах от приблизительно 1700 до приблизительно 2300 Да.

Наличие типичных пептидов гидролизата коллагена, которые удивительным образом значительно способствуют его эффективности, можно определить в частности с помощью масс-спектроскопии MALDI, причем типичные пептиды в масс-спектре возникают в качестве пиков. Предпочтительно по меньшей мере четыре типичных пептида в определенном с помощью масс-спектроскопии MALDI молекулярно-весовом распределении обладают по меньшей мере удвоенной интенсивностью, далее предпочтительно по меньшей мере четырехкратной интенсивностью по сравнению с их средой.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения гидролизат коллагена включает пептид между 620 и 690 Да, пептид между 790 и 860 Да, пептид между 980 и 1050 Да и пептид между 1175 и 1245 Да. Эти пептиды характерным образом отличают гидролизат коллагена в соответствии с изобретением от известных гидролизатов коллагена.

Гидролизат коллагена также дополнительно может иметь типичные пептиды между 1500 и 3500 Да, которые равным образом являются отличительным признаком от гидролизатов коллагена из уровня техники.

Предпочтительно гидролизат коллагена имеет содержание гидроксипролина в 12 мас.% или более. Аминокислота гидроксипролин, образованная благодаря посттрансляционному гидроксилированию пролина, встречается исключительно в коллагене, так что более высокая доля гидроксипролина в гидролизате коллагена представляет собой меру для значительного отсутствия других белков соединительной ткани (например, эластина и протеогликана), фрагменты которых в зависимости от способов получения равным образом могут содержаться в гидролизатах коллагена в определенных количествах.

Является благоприятным, если гидролизат коллагена получают ферментативным гидролизом желатина. Желатин содержит денатурированный коллаген и его получают с помощью различных, известных специалисту в данной области техники способов из соединительной ткани или из костей различных видов животных. В рамках изобретения используемый в качестве исходного вещества для гидролизата коллагена желатин преимущественно получают из кожи млекопитающих, в особенности из свиной шкуры или спилка из крупного рогатого скота, причем также не исключается применение желатина из сельскохозяйственных птиц.

Ферментативный гидролиз желатина, как правило, происходит посредством по меньшей мере одной эндопротеазы, причем в рамках изобретения предпочтительно использовать несколько эндопротеаз (т.е. по меньшей мере две различные эндопротеазы), чтобы вследствие этого соответствующим образом оказать воздействие на аминокислотный профиль полученного гидролизата коллагена и повысить положительное действие гидролизата на здоровье кожи, волос и/или ногтей.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения гидролизат коллагена получают путем следующего друг за другом воздействия по меньшей мере двух эндопротеаз с различной специфичностью, в особенности по меньшей мере двух разных металлопротеаз и/или сериновых протеаз, т.е. протеаз, которые расщепляют аминокислотную последовательность молекул коллагена каждый раз до или после определенных аминокислот. Преимущественно металлопротеазы и/или сериновые протеазы представляют собой ферменты из микроорганизмов Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus oryzae и Aspergillus melleus.

Благодаря выбору пригодных эндопротеазы можно получить не только типичное молекулярно-весовое распределение гидролизата коллагена, но и также оказать влияние на вид аминокислот на концах пептидов, содержащихся в гидролизате. В этом отношении, например, предпочтительно, когда по меньшей мере 50% N-концевых аминокислот гидролизата коллагена представляют собой гидрофобные аминокислоты, в особенности аланин, лейцин и изолейцин.

Изобретение в особенности также относится к применению гидролизата коллагена для стимуляции биосинтеза внеклеточных матричных белков клетками кожи. Клетки кожи включают в особенности фибробласты, которые среди всего прочего синтезируют коллаген (преимущественно типа I), эластин, а также протеогликаны. Образование этих белков в достаточном количестве является решающим для строения соответственно регенерации внеклеточной матрицы кожи, которая снова является существенно определяющей для свойств кожи, таких как упругость и эластичность, а также ее баланс влажности.

К клеткам кожи также относятся кератиноциты, которые отвечают как за ороговение самого верхнего слоя кожи, так и за формирование волос и ногтей. Таким образом, стимуляция этих клеток посредством применяемого в соответствии с изобретением гидролизата коллагена может вызвать улучшение защитной функции кожи, а также здоровья волос и/или ногтей.

Один важный аспект изобретения относится к применению гидролизата коллагена для повышения упругости кожи и/или уменьшения образования морщин. Эти свойства кожи ухудшаются, как правило, в процессе старения, а также в результате влияний окружающей среды, таких как, например, ультрафиолетовое излучение или токсические вещества. Так как за упругость и эластичность кожи в особенности отвечают матричные белки коллаген и эластин, то благодаря их повышенному синтезу, который в особых размерах стимулируется применяемым в соответствии с изобретением гидролизатом коллагена, можно противодействовать этим эффектам и явно улучшить здоровье кожи.

Один другой важный аспект изобретения относится к применению гидролизата коллагена для повышения содержания влаги в коже. Существенный вклад в способность кожи связывать достаточные количества влаги вносят содержащиеся во внеклеточной матрице протеогликаны (например, версикан, бигликан и декорин), синтез которых равным образом доказуемо стимулируется гидролизатом коллагена, применяемым в соответствии с изобретением. Также содержание влаги в коже может быть снижено вследствие вредного воздействия окружающей среды, такого как ультрафиолетовое излучение, причем потеря влаги часто сопровождается незначительной эластичностью, наличием трещин и избыточным ороговением кожи.

Один другой аспект изобретения относится к применению гидролизата коллагена с целью улучшения защитной функции кожи. Значительную роль для этой защитной функции играют так называемые белки рогового конверта (белки «cornified envelope), в частности инволюкрин, лорикрин и филаггрин, биосинтез которых бесспорно стимулируется с помощью низкомолекулярного гидролизата коллагена. Таким образом, благодаря применению в соответствии с изобретением гидролизата коллагена улучшается уменьшение потери влаги, защитная функция, а также природная защита кожи против патогенных микроорганизмов и токсических веществ.

Применение гидролизата коллагена в соответствии с изобретением также дополнительно приводит к антиокислительному действию внутри кожи, вследствие чего может быть снижена частота повреждений ДНК (мутаций), например, вследствие ультрафиолетового излучения или мутагенных веществ. Такие мутации представляют собой одну из причин для преждевременного старения клеток и вследствие этого способствуют явлениям старения кожи (ослабление упругости, образование морщин и т.п.), так что этом процесс может быть приостановлен благодаря применению в соответствии с изобретением.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения гидролизат коллагена предназначен для перорального приема. При пероральном приеме часто происходит более эффективный перенос гидролизата коллагена через кровообращение к месту действия, т.е. в частности к клеткам кожи, чем при местном применении. К тому же для потребителей эта форма применения, как правило, связана с весьма незначительными расходами.

Преимущественно гидролизат коллагена используют в качестве биологически активной добавки. Гидролизат коллагена при этом, как правило, служит для улучшения здоровья кожи в смысле общих профилактических мероприятий или также для косметического применения; такие биологически активные добавки могут обозначаться как «нутрицевтики» или «нутрикосметики». Однако в рамках изобретения также возможно применение гидролизата коллагена для лечения клинической картины заболевания, так, например, при наличии атопического дерматита, при котором у пациентов имеется повышенная склонность к сухой, трескающейся коже.

Биологически активная добавка может быть предложена почти в любом виде, например в виде таблеток, капсул, драже, пастилок или также раствора (например, в отдельных ампулах или в виде напитков).

Альтернативно гидролизат коллагена также может содержаться в продуктах питания или пищевкусовых продуктах, например в кондитерских изделиях или в быстрорастворимом порошке для приготовления напитков. Таким образом, гидролизат может употребляться потребителем без дополнительных расходов в рамках нормального питания (так называемое «функциональное питание»). В связи с этим является особенно предпочтительным, если гидролизат коллагена в основном не имеет вкуса.

Предпочтительно, если суточная доза гидролизата коллагена составляет от приблизительно 1,5 до 5 г, предпочтительно приблизительно 2 до 3 г, далее предпочтительно приблизительно 2,3 до 2,7 г. Оказалось, что благодаря пероральному приему этого количества гидролизата уже в течение нескольких недель может быть заметно улучшено здоровье кожи.

Один другой вариант осуществления изобретения относится к местному применению гидролизата коллагена, т.е. к применению в виде косметических продуктов для нанесения на кожу, волосы и/или ногти. При этом гидролизат коллагена может содержаться в частности в креме, в мази, в лосьоне или в геле. Также предпочтительно, если гидролизат коллагена добавляют в продукты по уходу за кожей, такие как, например, гель для душа или шампунь для волос, например, в количестве от приблизительно 5 до 10 мас.%.

Эти и другие преимущества изобретения более подробно описаны при помощи нижеследующих примеров, ссылаясь на чертежи. В частности представлено:

Фиг. 1А-1С: диаграммы, соответствующие стимуляции синтеза коллагена типа I, бигликана соответственно версикана;

Фиг. 2А и 2В: диаграммы, соответствующие повышению увлажнения кожи у бесшерстных мышей;

Фиг. 3: диаграмма, соответствующая стимуляции синтеза белков рогового конверта;

Фиг. 4А-4С: масс-спектры MALDI различных гидролизатов коллагена;

Фиг. 5А и 5В: диаграммы, соответствующие стимуляции синтеза коллагена типа I, декорина и версикана.

Примеры

1. Получение и свойства гидролизата коллагена

Для получения гидролизата коллагена в соответствии с изобретением в качестве исходного вещества используют водный раствор желатина из свиной шкуры (тип А, от 200 до 250 г по Блуму) с концентрацией от 20 до 40 мас.% (сухое вещество). Желатин подвергают ферментативному гидролизу посредством следующего друг за другом воздействия двух различных эндопротеаз микробиологического происхождения при от 50 до 60°C в течение от 120 до 180 мин, причем в качестве первого фермента применяют эндопротеазу из Bacillus subtilis или из Bacillus amyloliquefaciens и в качестве второго фермента эндопротеазу из Bacillus licheniformis. Затем ферменты термически дезактивируют и раствор подвергают распылительной сушке.

Молекулярно-весовое распределение полученного гидролизата коллагена может быть определено с помощью гель-проникающей хроматографии с применением следующих параметров:

неподвижная фаза: TSK 2000 SW XL (Tosoh Bioscience GmbH)

подвижная фаза: 0,4 моль/л дигидрофосфат натрия рН 5,3

скорость потока: 0,5 мл/мин

калибровочный стандарт: определенные фрагменты коллагена типа I (FILK, Фрейберг)

обнаружение: ультрафиолетовый детектор Knauer К-2501 при 214 нм

Определение давало молекулярно-весовое распределение гидролизата коллагена в соответствии с изобретением (в дальнейшем обозначается как низкомолекулярный гидролизат) в соответствии с нижеследующей табл. 1. Для сравнения в табл. 1 также указывается молекулярно-весовое распределение коммерчески доступного гидролизата коллагена, которое было определено с помощью того же самого метода (в дальнейшем обозначается как высокомолекулярный гидролизат).

Содержание гидроксипролина этого низкомолекулярного гидролизата составляет приблизительно от 12 до 13 мас.% и может быть определено фотометрически после окисления хлорамином Т и взаимодействия с п-диметиламино-бензальдегидом. Более чем 50% N-концевых аминокислот гидролизата представляют собой гидрофобные аминокислоты, в особенности аланин, лейцин и изолейцин.

2. Стимуляция синтеза внеклеточных матричных белков

Стимуляцию синтеза коллагена (тип I), а также протеогликанов бигликан и версикан исследовали in vitro на человеческих дермальных фибробластах (клетки кожи). Для этого клетки в течение 24 ч инкубировали каждый раз с 0,5 мг/мл низкомолекулярного соответственно высокомолекулярного гидролизата и затем определяли экспрессию РНК коллагена, РНК бигликана и РНК версикана с помощью ПЦР в реальном времени и представляли в полуколичественной форме (в пересчете на контроль без гидролизата).

Результаты представлены в виде столбиковых диаграмм для коллагена типа I на фиг. 1А, для бигликана на фиг. 1В и для версикана на фиг. 1С, причем диаграммы каждый раз показывают среднее значение из по меньшей мере 18 измерений. На абсциссе представлена экспрессия РНК относительно контроля (=1). Левый заполненный столбик каждый раз означает контроль, средний заштрихованный столбик означает высокомолекулярный гидролизат (в качестве сравнения) и правый столбик в точку означает низкомолекулярный гидролизат (в соответствии с изобретением).

Оказалось, что синтез всех трех матричных белков стимулируется обоими гидролизатами коллагена, причем положительный эффект низкомолекулярного гидролизата каждый раз выражается сильнее, чем положительный эффект высокомолекулярного гидролизата. У коллагена, который наряду с эластином несет главную ответственность за упругость и эластичность кожи, а также у версикана, который имеет важное значение для баланса влажности кожи, усиленный эффект низкомолекулярного гидролизата оказывается особенно отчетливым.

3. Повышение содержания влаги в коже

Влияние гидролизата коллагена на влажность кожи непосредственно исследовали на бесшерстных мышах. Бесшерстные мыши представляют собой общепризнанную систему модели, которую часто используют в дерматологических целях, и полученные из этого познания, в принципе, переносят на кожу человека (например, Т. Fujimura et al.; J. Dermatol. Sci. 2000 (24) 105-111 and Y. Nishimori et al.; J. Invest. Dermatol. 2001 (117) 1458-1463).

Животных ежедневно кормили в течение периода времени в три недели 150 мкг гидролизата коллагена на 1 кг массы тела, контрольная группа вместо этого получала БСА. Одновременно все животные получали еженедельную дозу УФ-Б излучения 18 мДж/см² поверхности кожи, вследствие чего оказывается негативное влияние на влажность кожи.

Содержание влаги в коже измеряли через одну неделю и через три недели с помощью корнеометра СМ 825 (производитель: Courage & Khazaka). При этом принцип измерения основывается на изменении способности измерительного конденсатора посредством диэлектрической проницаемости воды, связанной в верхних слоях кожи, которая явно отличается от диэлектрической проницаемости большинства других веществ.

Результаты представлены в виде столбиковых диаграмм для измерения через неделю на фиг. 2А и для измерения через три недели на фиг. 2В, причем диаграммы каждый раз показывают среднее значение и нормированную ошибку 7 измерений. На абсциссе представлена влажность кожи относительно контроля (=1). Левый заполненный столбик каждый раз означает контроль, средний заштрихованный столбик означает высокомолекулярный гидролизат (в качестве сравнения) и правый столбик в точку означает низкомолекулярный гидролизат (в соответствии с изобретением).

Оказывается, что повышение влажности кожи под влиянием низкомолекулярного гидролизата как через неделю, так и через три недели каждый раз усиливается, нежели под влиянием высокомолекулярного гидролизата. Это является еще одним доказательством особой эффективности применяемого в соответствии с изобретением гидролизата для улучшении здоровья кожи.

4. Стимуляция синтеза белков рогового конверта

Так называемые белки «рогового конверта» играют важную роль для защитной функции кожи против проникновения патогенных микроорганизмов и токсических веществ. Синтез белков рогового конверта инволюкрина, лорикрина и филаггрина определяли у бесшерстных мышей, которых перед этим в течение пяти недель ежедневно кормили 150 мкг гидролизата коллагена на кг массы тела (как описано выше). Количественное выражение белков относительно контрольной группы (кормление посредством БСА) осуществляли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и вестерн-блоттинга со специфическими антителами после извлечения белков из кожи.

Результаты представлены в виде столбиковой диаграммы на фиг. 3, причем диаграмма каждый раз показывает среднее значение и нормированную ошибку 7 измерений. На абсциссе представлено количество белков рогового конверта после кормления низкомолекулярным гидролизатом относительно контроля (=1). Левый столбик означает инволюкрин, средний столбик означает лорикрин и правый столбик означает филаггрин.

Оказалось, что синтез всех трех исследуемых белков рогового конверта стимулируется посредством перорального применения гидролизата коллагена, применяемого в соответствии с изобретением, в случае инволюкрина даже более чем в троекратном количестве.

5. Антиокислительное действие гидролизата коллагена

Антиокислительное действие низкомолекулярного гидролизата коллагена было определено в не содержащей бактериальных клеток системе с помощью анализа малондиальдегида.

При этом оказалось, что образование реакционноспособных видов кислорода уменьшается благодаря гидролизату коллагена в среднем на приблизительно 7%. Вследствие этого внутри кожи может быть снижена частота повреждений ДНК, так что явлениям старения можно противодействовать посредством применения в соответствии с изобретением.

6. Анализ молекулярно-весового распределения с помощью МС MALDI

Полученный в соответствии с примером 1 низкомолекулярный гидролизат коллагена в соответствии с изобретением, который имеет средний молекулярный вес приблизительно 2000 Да (в дальнейшем гидролизат А), был противопоставлен двум коммерчески доступным гидролизатам коллагена со средним молекулярным весом в приблизительно 2100 Да (в дальнейшем гидролизат В) и приблизительно 2900 Да (в дальнейшем гидролизат С).

Точные молекулярно-весовые распределения этих трех гидролизатов были проанализированы с помощью масс-спектроскопии MALDI (МС MALDI). Для этого образцы в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте устанавливали до конечной концентрации в 10 мкг/мкл и затем очищали с применением µС₁₈-материала. Образцы препарировали с матрицей НССА на мишени MALDI и масс-спектры определяли с применением масс-спектрометра Ultraflex-III-TOF/TOF (производитель: Bruker Daltonics).

Фиг. 4А-4С показывают соответствующие масс-спектры соответственно молекулярно-весовые распределения гидролизатов коллагена А, В соответственно С, причем на ординате представлен молекулярный вес соответственно массовое число и на абсциссе - интенсивность. Сравнение трех спектров показывает, что гидролизат А в соответствии с изобретением содержит следующие типичные пептиды согласно табл. 2, причем соответствующие пики имеют от двукратную до четырехкратную интенсивности по сравнению с их средой.

В особенности четыре пептида между 600 и 1500 Да не имеют никаких соответствий у обоих коммерческих гидролизатов В и С, и таким образом являются особенно типичными для гидролизата А.

7. Стимуляция синтеза внеклеточных матричных белков

Стимуляцию синтеза коллагена (тип I), а также протеогликанов декорин и версикан исследовали in vitro на человеческих дермальных фибробластах (клетки кожи). Для этого клетки в течение 24 ч инкубировали каждый раз с 0,5 мг/мл гидролизатов А, В соответственно С и затем определяли экспрессию РНК коллагена, РНК декорина и РНК версикана с помощью ПЦР в реальном времени и представляли в полуколичественной форме. Декорин имеет важное значение для образования коллагеновых волокон в коже.

Результаты представлены в виде столбиковой диаграммы для гидролизата В на фиг. 5А и для гидролизата С на фиг. 5В, причем на абсциссе каждый раз нанесена экспрессия РНК у коммерческих гидролизатов В соответственно С относительно экспрессии РНК у гидролизата А (=1) в соответствии с изобретением. Левый столбик в каждом случае означает коллаген типа-I, средний столбик означает декорин и правый столбик означает версикан. Каждый раз представлено среднее значение из по меньшей мере 7 измерений, а также нормированных ошибок.

Удивительным образом данные показывают, что у всех трех матричных белков по сравнению с гидролизатом А происходит явно более низкая стимуляция синтеза РНК посредством обоих гидролизатов В и С, средний молекулярный вес которых является только незначительно выше. Таким образом, типичные пептиды гидролизата А видимо играют решающую роль для их благоприятного действия.

8. Примерные рецептуры для биологически активных (пищевых) добавок и косметических средств

В дальнейшем указаны некоторые примерные рецептуры для применения гидролизата коллагена в соответствии с изобретением, которые само собой разумеется, могут быть разнообразно изменены:

Капсетты (биологически активная добавка)

Шоколад

Напиток

Шампунь для волос

Реферат

Изобретение относится к области косметологии и касается гидролизата коллагена, применяемого для улучшения здоровья кожи, волос и/или ногтей человека, получаемого ферментативным гидролизом желатина при последовательном воздействии друг за другом двух эндопептидаз с различной специфичностью, причем по меньшей мере 90 мас.% гидролизата коллагена имеют молекулярный вес менее чем 3500 Да, и гидролизат коллагена содержит по меньшей мере четыре типичных пептида с молекулярным весом 600-1200 Да, которые имеют по меньшей мере удвоенную интенсивность в молекулярно-массовом распределении (определенном методом MALDI-масс-спектрометрии) по сравнению с их средой, а содержание гидроксипролина в гидролизате коллагена составляет 12 мас.% или более. Изобретение обеспечивает гидролизат коллагена, обладающий повышенным положительным действием на здоровье кожи, волос и/или ногтей. 14 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 8 пр.

Формула